kl hoang tuan phi 080557h

1 Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Trong kinh tế nước ta nông nghiệp giữ vai trò chủ đạo, đặc biệt trồng trọt Tuy nhiên, năm gần đây, bệnh hại trồng tiếp tục gây thiệt hại đến mùa màng Việt Nam nước giới Sự bùng phát dịch bệnh loại trồng có giá trị kinh tế gây tác đ ộng lớn đến người nông dân Nhiều bệnh nấm đất gây ảnh hưởng trực tiếp đến trồng, làm giảm suất chất lượng nông sản dẫn đến thu nhập người nông dân giảm sút đáng kể Ngồi ra, chi phí cho biện pháp phòng trừ nấm bệnh làm giảm mức thu nhập họ Hiện nay, bệnh hại trồng kiểm soát cách áp dụng nhiều biện pháp khác Trong đó, biện pháp hóa học xem hữu hiệu áp dụng nhiều Tuy nhiên, việc sử dụng nhiều loại thuốc hóa học làm cho đất đai ngày bị thối hóa, dinh dưỡng bị cân đối, cân hệ sinh thái đất, hệ vi sinh vật đất bị phá hủy, tồn dư chất độc ngày cao, nguồn bệnh tích lũy ngày nhi ều Ngoài ra, việc lạm dụng mức phương pháp hóa học làm cho tác nhân gây bệnh trở nên kháng thuốc dẫn đến phát sinh số dịch hại không dự báo trước Đặc biệt, loại thuốc hóa học ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe nông dân gây ô nhiễm nguồn nước Chính thế, xu hướng dùng tác nhân sinh học vi sinh vật, trùng có ích hợp chất có hoạt tính sinh học từ tự nhiên để kiểm sốt dịch bệnh trồng Các chế phẩm sinh học khuyến khích sử dụng nhằm khắc phục số hạn chế phương pháp hóa học hướng đến phát triển nông nghiệp theo hướng sinh thái bền vững tương lai Ưu việc sử dụng biện pháp sinh học kiểm soát tác nhân gây bệnh với cải thiện suất trồng tránh việc gây ô nhiễm môi trường loại thuốc hóa học gây Hiện nay, ứng dụng chế phẩm sinh học từ Pseudomonas sp vào nơng nghiệp nói bước đầu đáp ứng yêu cầu Ngoài ra, Pseudomonas sp xem vi khuẩn có tiềm điều hịa tăng trưởng thực vật Có nhiều chủng Pseudomonas tác động lớn đến sinh trưởng phát triển trồng thông qua chế sinh học khác kích thích tăng trưởng phát triển trồng, đối kháng tác nhân gây bệnh nấm bệnh, vi khuẩn, tuyến trùng… kích thích chế tự vệ vật chủ Tuy nhiên, nay, Việt Nam có ích nghiên cứu Pseudomonas sp vấn đề Dựa sở đó, chúng tơi tiến hành thực đề tài “Khảo sát khả đối kháng số loại nấm gây bệnh trồng số chủng Pseudomonas sp.” 1.2 Mục tiêu đề tài - Đánh giá khả kiểm soát nấm bệnh số chủng Pseudomonas sp - Chọn lọc chủng có khả năng đối kháng tốt chọn lọc số điều kiện nhân sinh khối chủng chọn lọc 1.3 Nội dung thực - Xác định hiệu đối kháng chủng Pseudomonas sp (Pseudomonas putida Ps01, Pseudomonas fluorescens Ps02, Pseudomonas stutzeri Ps03 Pseudomonas aeruginosa BL2.2) với chủng nấm bệnh (Sclerotium rolfsii NB01, Rhizoctonia solani NB02, Phytophthora capsici NB03, Fusarium oxysporum NBTn01, Fusarium ambrosium NBS05, Brachycladium papaveris NBT04, Gilbertella persicaria NBT01) môi trường thạch đĩa PGA phương pháp nuôi cấy đồng thời để chọn lọc chủng Pseudomonas sp có khả đối kháng cao với nấm bệnh - Khảo sát số điều kiện ảnh hưởng đến trình tăng sinh chủng Pseudomonas sp chọn lọc (pH ban đầu mơi trường, nguồn carbon bổ sung thích hợp, nồng độ nguồn carbon bổ sung thích hợp, nguồn nitrogen bổ sung thích hợp, nồng độ nguồn nitrogen bổ sung thích hợp, nồng độ chất khoáng bổ sung…) nhằm lựa chọn điều kiện tăng sinh thích hợp Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan Pseudomonas Pseudomonas bao gồm lồi chi có khả sử dụng nhiều loại hợp chất vô hữu điều kiện môi trường sống thay đổi Do đó, chúng tồn khắp nơi hệ sinh thái đất, nước đóng vai trị quan trọng tương tác với động vật thực vật Tuy nhiên, số chủng m ầm bệnh người Chi Pseudomonas biết rộng rãi nhờ khả trao đổi chất thông tin di truyền linh hoạt Nói chung, lồi Pseudomonas có khả phát triển nhanh biết đến với khả sử dụng số lượng lớn loại chất, bao gồm chất hữu độc hại, chẳng hạn hydrocacbon thơm chất béo Một vài chủng đư ợc xác định tạo hợp chất chuyển hóa có tác dụng kích thích phát triển trồng ngăn chặn loài gây hại cho trồng [16] 2.1.1 Vị trí phân loại Theo Migula (1984), Pseudomonas có vị trí phân loại sau: Giới : Bacteria Ngành : Proteobacteria Lớp : Gamma Proteobacteria Bộ : Pseudomonadales Họ : Pseudomonadaceae Chi : : Pseudomonas Loài : Pseudomonas sp 2.1.2 Đặc điểm hình thái Pseudomonas trực khuẩn gram âm có vách màng tế bào mỏng, khơng sinh nội bào tử, có hình que cong ho ặc thẳng, đường kính tế bào thường nhỏ 1m chiều dài 1,5-5 m (Pierre Cornelis, 2008) Tế bào chúng đứng riêng rẽ, đứng thành đôi thành chuỗi ngắn Tuy nhiên, thực tế tế bào số chủng khơng miêu tả chung Tế bào P putida P syringae dài bất thường chủng khác ngắn [16] Hình 2.1 Khuẩn lạc Pseudomonas fluorescens thạch đĩa King’ B [44] Hình 2.2 Khuẩn lạc Pseudomonas aeruginosa thạch đĩa King’ B [46] Pseudomonas spp có khả di động nhờ nhiều tiên mao mọc đỉnh, khơng di động, hầu hết lồi Pseudomonas có nhiều tiên mao Tiên mao thường gắn cực tế bào, nhiên có ngo ại lệ P stutzeri (Palleroni cộng sự, 1970) [16] Các loài khác phân biệt dựa kiểm tra hóa sinh lai DNA Tế bào nhiều loài bị dung giải cách dễ dàng dung dịch EDTA, điều thường liên quan đến hàm lượng phosphoric cao lớp màng ngồi [16] Hình 2.3 Pseudomonas aeruginosa với tiên mao cực [47] Hình 2.4 Pseudomonas fluorescens với nhiều tiên mao cực [45] 2.1.3 Mơi trường sống Nhóm vi khuẩn tìm thấy nhiều nơi mơi trường sống chung quanh ta đất, nước (nhất nơi ẩm thấp), hồ tắm nước nóng Chúng phát sống bám bề mặt thực vật, động vật, kể bệnh viện (người ta phát vi khuẩn P aeruginosa thiết bị dụng cụ sử dụng thường xuyên chụp thở oxy, ống thông tiểu…) Môi trường ẩm ướt thích hợp cho vi khuẩn Ở người, vi khuẩn sống vùng da ẩm nách, háng số sống ruột [6] Đất vùng rễ ảnh hưởng nhiều đến trồng (Hiltner, 1904), khu vực có hoạt động mạnh vi sinh vật Pseudomonas loài có khả cư trú tốt vùng rễ thực vật (Lugtenberg cộng sự, 2001) nên có hiệu việc ức chế phát triển vi sinh vật khác rễ (Bianciotto cộng sự, 1996) [16] Pseudomonas đặc trưng phát triển môi trường đơn giản với nhiều loại thành phần hữu khác [28] Môi trường sống Pseudomonas phong phú đất, nước hay mô tế bào thực vật động vật Về bản, môi trường sống nhiệt độ từ 4- 420C, pH từ 4-8 có chất hữu đơn giản hay phức tạp môi trường sống cho Pseudomonas [16] Pseudomonas lồi hiếu khí, oxy yếu tố quan trọng cho tồn Trong thực tế, Pseudomonas sp thường tìm thấy đất mơi trường hiếu khí, có nhiệt độ trung bình điều kiện pH trung tính [16] 2.1.4 Đặc điểm sinh lý sinh hóa Trong tự nhiên, loài Pseudomonas tồn cách hoại sinh ký sinh thực vật Thường chúng không phù hợp với mơi trường kị khí chúng khơng thể cư trú với mơi trường sống có nhiệt độ cao acid Một số chủng Pseudomonas kháng kháng sinh, thuốc tẩy, kim loại nặng dung môi hữu [16] Pseudomonas spp chia làm nhóm theo khả phát huỳnh quang: Pseudomonas spp phát huỳnh quang (như P aeruginosa, P fluorescens, P putida hay P syringae…) Pseudomonas spp không phát huỳnh quang (như P alcaligenes, P fragi hay P stutzeri…) [16] Cách phân chia khơng phải phân nhóm thức, mà phân nhóm theo tính chất có sản xuất hay không hợp chất thứ cấp đặc hiệu phát huỳnh quang pyoverdine Tính đặc trưng nhiều đại diện thuộc nhóm Pseudomonas spp phát huỳnh quang sinh sắc tố huỳnh quang quan sát đèn UV bước sóng 254 nm, phát triển nồng độ sắt bị giới hạn (Meyer cộng sự, 2002) [16] Ở số loài, sắc tố khuếch tán vào môi trường, nhuộm môi trường thành màu tương ứng Các sắc tố sản xuất từ Pseudomonas bao gồm pyocyanin ( P aeruginosa, màu xanh), pyorubin (P aeruginosa, màu đỏ), oxycholororaphin (P aureofaciens P chlororaphis, màu da cam), chlororaphin (P chlororaphis, màu xanh cây)… (Hugh Gilardi, 1980) [16] Pseudomonas có khả oxy hóa khơng lên men đường, khơng sinh mơi trường lỏng có chứa nguồn carbohydrate Chúng phát triển tốt mơi trường peptone, hầu hết lồi phát triển mơi trường xác định glucose galactose nguồn carbon ammonium phosphate nguồn nitrogen Acid tạo thành từ glucose galactose môi trường peptone, acid không hình thành từ manitol glycerol (trừ P taetrolens P synxantha) Arginine dihydrolase tạo thành ornithine decarboxylase khơng đư ợc tạo thành (trừ P synxantha) Pseudomonas không phân giải tinh bột (ngoại trừ P stutzeri), không tạo thành acetoin không sử dụng cellulose pectin Pseudomonas sp phát triển môi trường chứa 10 đến 40% muối mật môi trường đến 5% NaCl Pseudomonas có hệ enzyme catalase, có hệ thống cytochrom có khả phân giải H2O2 (trừ P pavonacea), oxidase dương tính (trừ P iodinum, P synxantha P syringae) (O.Lysenko, 1961) Pseudomonas hiếu khí bắt buộc số chủng có khả sử dụng nitrate thay oxy m ột chất nhận điện tử cuối hơ hấp tế bào Ngồi ra, số lồi Pseudomonas P chloridismutans sử dụng chlorate ( CLO3-) chất nhận điện tử thay cho oxy (Wolterink cộng sự, 2002) [16] Pseudomonas sp sử dụng amino acid mơi trường nguồn carbon nitrogen Khi có diện amino acid, tế bào Pseudomonas sp kích hoạt hệ thống màng đặc biệt giúp vận chuyển amino acid vào tế bào chất Chúng sử dụng amino acid nguồn dinh dưỡng giúp tiết kiệm lượng tế bào sử dụng mà khơng địi h ỏi q trình biến đổi [16] 2.1.5 Khả kiểm soát nguồn bệnh thực vật Pseudomonas phát huỳnh quang nhóm vi khuẩn có khả kiểm soát sinh học thay cho thuốc diệt nấm nơng nghiệp Khả kiểm sốt tác nhân gây bệnh chúng làm thúc đẩy trình tăng trưởng thực vật Pseudomonas sp sử dụng tác nhân kiểm soát nguồn bệnh thực vật có khả sản xuất loại hợp chất chuyển hóa thứ cấp siderophore, kháng sinh, enzyme phytohormone (Gupta cộng sự, 2001) [12] Các loài P fluorescens P putida rễ thực vật giúp tăng phát triển cho thực vật Sự ảnh hưởng cho ức chế lồi vi khuẩn nấm bệnh thực vật Chúng ngăn bệnh rễ nấm bệnh gây Chủng P flourescens sản xuất kháng sinh pyrrolnintrin, pyoluteorin, phenazine 2,4 – diacetylphloroglucinol Các hợp chất nhân tố quan trọng tiêu biểu kiểm soát bệnh thực vật [10] [28] [35] Các chủng Pseudomonas fluorescens đư ợc sử dụng rộng rãi cho việc kiểm soát sinh học với tác nhân gây bệnh nấm, vi khuẩn virus Một số chủng Pseudomonas phát huỳnh quang xem vi khuẩn rễ điều hòa tăng trưởng thực vật (Plant – growth Promoting Rhizobacteria – PGPR) (Salaheddin Valluvaparidasan, 2010) Các chủng sản xuất 50 hợp chất kháng sinh (Dewivedi Johri, 2003) [22] Hydrogen cyanide hợp chất chuyển hóa có tác dụng ức chế tiêu diệt tác nhân gây bệnh không ảnh hưởng đến trồng HCN có hiệu việc ngăn chặn đường cytochrome oxidase có độc tính cao nên ức chế tất vi khuẩn hiếu khí Ở thuốc lá, bệnh thối đen Thielaviopsis basicola gây bị ức chế chủ yếu HCN sản xuất từ P fluorescens CHAO Pseudomonas sp nhóm PGPR có khả sản sinh siderophore nhằm cạnh tranh nguyên tố sắt đất, hạn chế phát triển mầm bệnh Siderophore hợp chất giữ nguyên tố sắt, nguyên tố cần thiết cho sống tất vi sinh vật Một số PGPR kéo nguyên tố sắt siderophore vi sinh vật khác (Loper Henkels 1997) [30] Bên cạnh đó, nhiều chủng Pseudomonas kiểm sốt sinh học cách sản xuất enzyme thủy giải ngoại bào protease, lipase chitinase Các enzyme phân giải vách tế bào thành phần bên nấm gây hại 2.1.5.1 Một số hợp chất chuyển hóa thứ cấp sản xuất Pseudomonas spp ứng dụng kiểm sốt nguồn bệnh thực vật a Nhóm Phenazine Phenazine nhóm hợp chất có sắc tố đậm màu tổng hợp từ chủng vi khuẩn khác (Leisinger Margraff, 1979; Budzikiewicz, 1993 ; Stevans cộng sự, 1994) Phenazine hợp chất có khả chống lại vi khuẩn nấm (Smimov Kiprianova, 1990) - Phenazine-1-carboxylic acid (PCA) sản xuất từ loài Pseudomonas huỳnh quang P fluorescens (Gunrsiddaiah cộng sự, 1986), P chlroraphis (Pierson Thamashow, 1992) P aeruginosa (Anjaiah cộng sự, 1998) PCA chứng minh có hiệu đối kháng với nhiều loại nấm bệnh Gaeumannomyces graminis var tritici, Pythium sp., Polysporus sp., Rhizoctonia solani… mầm bệnh vi khuẩn Actimomyces viscosus, Bacillus subtilis, Erwinia amylovora… (Gulusiddaiah cộng 1986; Thomashow cộng sự, 1990) - Phenazine-1-carboxamide (PCN) sản xuất từ loài Pseudomonas huỳnh quang P aeruginosa P chlororaphis (Chin-A-Woeng cộng sự, 1998; Mavrodi cộng sự, 2001; Sunish kurnar cộng sự, 2005) PCN chất hoạt động ổn định PCA hoạt động đối kháng nấm bệnh pH kiềm (Chin-Awoeng cộng sự, 1998) - Pyocyanin có màu xanh nhạt sản xuất chủ yếu P aeruginosa (Demange cộng sự, 1989) Pyocyanin loại chất độc nhiều loại vi khuẩn nấm A B C Hình 2.5 Một số hợp chất nhóm Phenazine A: Phenazine-1-carboxylic acid, B: Phenazine-1-carboxamide, C: Pyocyanin b Nhóm phloroglucinol Phloroglucinol loại kháng sinh sản xuất từ nhiều dòng vi khuẩn Trong 2,4 – diacetyl phloroglucinol (DAPG) hợp chất sản xuất từ P fluorescnes Pf-5 (Howell Stipanovic, 1979), P fluorescens F113 (Fenton cộng sự, 1992), P fluorescens CHAO (Keel cộng sự, 1992) P fluorescens Q2-87 (Bangera Thomashow 1996) DAGP có chế hoạt động giống 2,4 dichlorophenoxyacetic (2,4-D) (Dwivedi Johri, 2003) DAGP giúp tăng sức đề kháng thực vật (Dwivedi Johri, 2003) hoạt động chống nấm bệnh Hình 2.6 Hợp chất 2,4 – diacetyl phloroglucinol 10 c Nhóm Pyrrol Pyrrolnitrin (PRN) hợp chất có tính kháng nấm (Arima cộng sự, 1964), sản xuất loài Pseudomonas huỳnh quang P fluorescens (Kirner cộng 1998) P chlororahis (Elander cộng 1968) d Nhóm Polyketide Nhóm gồm nhiều hợp chất khác sau: - Pyoluteorin (PLT) hợp chất có tính kháng nấm sản xuất loài Pseudomonas P fluorescnes (Maurhofer cộng sự, 1992; Maurhofer cộng sự, 1994; Kraus Loper, 1995; NowakThompson cộng sự, 1997) PLT có hiệu việc chống lại nấm bệnh P ultimum (Maurhofer cộng sự, 1992) - Mupirocin loại kháng sinh tự nhiên sản xuất từ Pseudomonas huỳnh quang nên gọi pseudomonic acid Mupirocin sản xuất từ P fluorescens NCIMB 10586 có hoạt tính cao đối kháng với Staphylococcus số vi khuẩn gram dương khác (El-Sayed cộng sự, 2003) - 2,3-deoxy-2,3-didehydrorhizoxin (DDR) sản xuất P choloraphis MA342 có hiệu việc đối kháng với số loại nấm gây bệnh A B Hình 2.7 Một số hợp chất nhóm Polyketide A: Pyoluteorin, B: Mupirocin e Nhóm peptide Nhóm peptide Pseudomonas sp tổng hợp bao gồm nhiều hợp chất như: tensin, viscosinamide Omycin A 42 Biểu đồ 4.7 Hiệu đối kháng chủng Pseudomonas ủ ngày với NBTn01 70 60 I (%) 50 40 30 20 10 Ps01 Ps02 Ps03 BL 2.2 Chủng Pseudomonas Bảng 4.7 Hiệu đối kháng chủng Pseudomonas sau ủ ngày với NBTn01 ĐC Đường kính khuẩn lạc nấm bệnh trung bình (cm) I (%) 4,5 Chủng Pseudomonas Ps01 Ps02 Ps03 BL 2.2 1,68 ± 0,01 4,48 ± 0,01 4,49 ± 0,00 2,47 ± 0,02 62,78 ± 0,02 0.5 ± 0,02 0.3 ± 0,01 44,89 ± 0,1 ĐC: Đối chứng  Nhận xét Nhìn chung, qua kết đối kháng chủng Pseudomonas với chủng nấm bệnh nhận thấy hiệu đối kháng thay đổi theo chủng Pseudomonas khác Trong đó, hai chủng Ps01 BL 2.2 cho k ết đối kháng với tất loại nấm bệnh cao rõ r ệt so với hai chủng Ps02 Ps03 Với chủng Ps01, hiệu đối kháng thay đổi so với chủng nấm bệnh.Nhìn chung, chủng Pseudomonas có hiệu đối kháng nấm bệnh cao với kết đối kháng 55% Cụ thể, Ps01 cho kết đối kháng với chủng NBT04 cao nhất, đạt 43 mức đối kháng cực tốt [++++], ức chế phát triển sợi nấm lên tới 76,67 % Ps01 thể mức độ đối kháng tốt [+++] với chủng nấm bệnh NB01, NB02, NBS05 NBTn01 Trong đó, với NBT01 NB03, Ps01 thể mức đối kháng trung bình [++] Các kết thu cho thấy chủng BL 2.2 có hiệu đối kháng tốt với chủng nấm bệnh Cụ thể, BL 2.2 cho hiệu ức chế với chủng nấm bệnh NBT01 NBT04 đạt mức đối kháng tốt [+++] Với chủng nấm bệnh NBS05 NB 02, BL 2.2 đạt mức độ đối kháng trung bình [++] Hiệu đối kháng BL 2.2 thể mức [+] với chủng nấm bệnh NB01, NB03 NBTn01 Trong số chủng Pseudomonas nghiên cứu chủng Ps02 Ps03 cho hiệu đối kháng thấp rõ rệt so với Ps01 BL 2.2 Cả chủng cho hiệu đối kháng mức (I < 50%) không đối kháng với tất chủng nấm bệnh Trong số chủng nấm bệnh sử dụng nghiên cứu, chủng NBT04 chủng nấm bệnh dễ bị kiểm soát Cả chủng Pseudomonas sử dụng cho kết đối kháng với NBT04 với hiệu đối kháng từ 26,39 % đến 76,67 % Ngược lại chủng nấm bệnh NB03 chủng nấm bệnh khó ức chế tiến hành ni cấy đối kháng với chủng Pseudomonas Chỉ có chủng Ps01 BL 2.2 cho thấy ức chế với NB03 với hiệu ức chế 49,17 % 15,20 % chủng Ps02 Ps03 không cho thấy ức chế Trong số chủng Pseudomonas nghiên cứu chủng Ps01 cho kết đối kháng cao hẳn so với chủng lại (Bảng 4.8 4.9) Ps01 ch ủng Pseudomonas cho thấy mức độ đối kháng mức cực tốt [++++] (I > 75%) thường xuyên cho thấy kết đối kháng mức tốt [+++] (I = 61-75%) nuôi cấy đồng thời với hầu hết chủng nấm bệnh 44 Bảng 4.8 Đánh giá tổng hợp hiệu đối kháng nấm bệnh chủng Pseudomonas Chủng Pseudomonas Hiệu đối kháng chủng nấm bệnh Ps01 Ps02 Ps03 BL 2.2 NB 01 [+++] [-] [-] [+] NB 02 [+++] [-] [-] [++] NB 03 [++] [-] [-] [+] NBT 04 [++++] [+] [+] [+++] NBS 05 [+++] [+] [+] [++] NBT 01 [++] [-] [-] [+++] NBTn 01 [+++] [-] [-] [+] Bảng 4.9 Tổng hợp hiệu đối kháng chủng Ps01 với chủng nấm bệnh phương pháp nuôi cấy đồng thời đĩa thạch PGA Nấm bệnh I (%) NB01 69,72 ± 0,03 NB02 NB03 NBT04 NBS05 NBT01 NBTn01 72,59 ± 0,04 49,17 ± 0,03 76,67 ± 0,06 66,39 ± 0,05 55,56 ± 0,06 62,78 ± 0,02 Từ kết nhận hiệu đối kháng nấm bệnh chủng Pseudomonas, chọn chủng Ps01 để tiến hành thí nghiệm nhằm chọn lọc số điều kiện nhân sinh khối nhằm hướng đến việc tạo chế phẩm sinh học để kiểm soát nấm bệnh 4.2 Khảo sát ảnh hưởng thành phần mơi trường chọn lọc điều kiện thích hợp cho tăng sinh chủng chọn lọc Pseudomonas putida Ps01 Chúng tiến hành khảo sát ảnh hưởng thành phần môi trường nuôi cấy lên khả tăng sinh chủng Ps01 pH ban đầu môi trường, nguồn 45 carbon, nồng độ carbon, nguồn nitrogen, nồng độ nitrogen nồng độ khoáng để chọn điều kiện thích hợp cho ni cấy tăng sinh chủng Ps01 4.2.1 Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường ni cấy [34], [40] Trong q trình phát triển, vi sinh vật có phạm vi pH sinh trưởng định pH sinh trưởng tốt Vi sinh vật ưa acid có pH sinh trưởng tốt nằm khoảng pH – 5,5; vinh sinh vật ưa trung tính pH sinh trưởng tốt nằm khoảng pH 5,5 – vi sinh vật ưa kiềm pH 8,5 – 11,5 [1] Từ số nghiên cứu cho thấy Pseudomonas sp thuộc nhóm vi khuẩn trung tính Trên sở ta tiến hành khảo sát nhằm xác định pH ban đầu mơi trường thích hợp cho trình tăng sinh ch ủng Ps01 chọn lọc Sử dụng môi trường King’ B môi trường tăng sinh, tiến hành điều chỉnh pH môi trường NaOH 5N HCl 5N [40] Mẫu đối chứng pH tự nhiên mơi trường Kết trình bày bảng 4.10 160 Khối lượng sinh khối (mg/50ml) 140 120 100 80 60 40 20 5,5 6,0 6,3 6,5 7,0 7,5 8,0 pH ban đầu môi trường Biểu đồ 4.8 Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường lên tăng sinh chủng Ps01 46 Bảng 4.10 Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường lên tăng sinh chủng Ps01 Nồng độ pH 5,5 Lượng sinh khối khô 50ml môi trường tăng sinh (mg) 33,5 ± 0,22 6,0 46,6 ± 5,53 6,5 52,3 ± 0,79 7,0 151,1 ± 0,13 7,5 111,9 ± 0,76 8,0 57,9 ± 1,34 pH tự nhiên (6,3) 52,5 ± 1,90  Nhận xét Mỗi loài vi sinh vật có khoảng pH thích hợp điểm pH tối ưu cho sinh trưởng phát triển cùa chúng Qua kết khảo sát ta thấy nồng độ pH giảm phía pH mang tính acid hay tăng khồng pH có tính kiềm hiệu tăng sinh chủng Ps01 có suy giảm Bảng 4.10 cho thấy lượng sinh khối Ps01 tăng liên tục tăng pH từ 5,5 đến 7,0 đạt khối lượng sinh khối cao pH 7,0 Khi tăng pH lên 7,5 kh ối lượng sinh bị giảm xuống tiếp tục giảm xuống pH 8,0 Khối lượng sinh khối Ps01 pH (151,1 mg) cao đáng kể so với pH tự nhiên môi trường (52,5 mg) Biểu đồ 4.8 cho thấy pH ban đầu môi trường vùng acid khả tăng sinh chủng Ps01 bị ảnh hưởng đáng kể Lượng sinh khối thu dãy pH 5,5 – 6,5 thấp đáng kể so với điểm pH trung tính kiềm nhẹ Như vậy, từ kết thu trên, chúng tơi lựa chọn điểm pH điểm pH thích hợp cho tăng sinh chủng Ps01 Kết tương đồng với nghiên cứu chủng P fluorescens môi trường King’s B Zeniat (2010) P J Slininger (1995) Các nghiên cứu cho thấy điểm pH thích hợp cho Pseudomonas sp nằm khoảng pH từ pH đến pH 7,5 47 4.2.2 Ảnh hưởng nguồn carbon bổ sung vào môi trường nuôi cấy [34], [40] Zeinat cộng (2010) báo cáo nguồn carbon bổ cung có ảnh hưởng đến tăng trưởng hiệu ức chế chủng Pseudomonas với nấm bệnh Thêm vào đó, nồng độ nguồn carbon cao thấp có ảnh hưởng đến phát triển chúng Do đó, chúng tơi tiến hành xác định nguồn carbon thích hợp để bổ sung vào mơi trường ni cấy nhằm tối ưu hóa phát triển chủng Pseudomonas chọn lọc cách tiến hành nuôi chủng Ps01 mơi trường có pH chọn mục 4.2.1 thay đổi nguồn carbon bổ sung Mẫu đối chứng không bổ sung nguồn carbon Kết trình bày bảng 4.11 180 Khối lượng sinh khối (mg/50ml) 160 140 120 100 80 60 40 20 Glyceron Glucose Saccharose Lactose Dextrine Đối chứng Nguồn carbon Biểu đồ 4.9 Ảnh hưởng nguồn carbon bổ sung lên tăng sinh chủng Ps01 48 Bảng 4.11 Ảnh hưởng nguồn nguồn carbon bổ sung lên tăng sinh chủng Ps01 Nguồn carbon bổ sung Lượng sinh khối khô 50ml môi trường tăng sinh (mg) Glycerol 150,0 ± 1,22 Glucose 147,1 ± 0,57 Saccharose 166,5 ± 0,36 Lactose 156,7 ± 0,16 Dextrine 145,0 ± 0,31 Đối chứng 119,7 ± 2,56  Nhận xét Dựa vào số liệu bảng 4.11, giống kết nghiên cứu Zeinat cộng sự, chúng tơi thấy nguồn carbon khác có ảnh hưởng lên khả tăng sinh chủng Ps01 Các kết đo bảng cho thấy khối lượng sinh khối Ps01 có thay đổi theo nguồn carbon nhiều đáng kể so với môi trường khơng bổ sung nguồn carbon Trong đó, với đường saccharose khối lượng sinh khối thu lớn (166,5 mg), đường lactose (156,7 mg) khối lượng sinh khối thu thấp với nguồn carbon bổ sung dextrine (145 mg) Mẫu đối chứng không bổ sung nguồn carbon thu lượng sinh khối 119,7 mg Sự thay đổi nguồn carbon glycerol, glucose dextrin không làm thay đổi đáng kể đến lượng sinh khối thu Theo kết nghiên cứu Zeniat chủng P fluorescens cho thấy tăng sinh tối ưu môi trường King’s B có bổ sung nguồn carbon glycerol Các nghiên cứu khác Slininger P.J (1995) Daffy B.K (1999) cho thấy nguồn carbon P fluorescens sử dụng hiệu glucose Điều cho thấy chủng Pseudomonas khác có nhu cầu nguồn carbon bổ sung khác Kết thu cho thấy chủng Ps01 tăng sinh tốt mơi trường có nguồn carbon bổ sung saccharose Với kết chọn saccharose nguồn carbon bổ sung để tiến hành khảo sát thí nghiệm 49 4.2.3 Ảnh hưởng nồng độ saccharose Nồng độ nguồn carbon ảnh hưởng đến tăng sinh Pseudomonas sp Do tiến hành nuôi chủng Ps01 môi trường thích hợp ch ọn mục 4.2.2 bổ sung saccharose với tỷ lệ từ 0% đến 5% Kết khảo sát trình bày bảng 4.12 Bảng 4.12 Ảnh hưởng nổng độ saccharose lên tăng sinh chủng Ps01 Lượng sinh khối khô 50ml môi trường tăng sinh (mg) 114,9 ± 8,74 168,1 ± 1,75 156,1 ± 8,49 143,0 ± 2,97 140,7 ± 1,33 136,8 ± 6,04 Khối lượng sinh khối (mg/50ml) Nồng độ saccharose bổ sung (%) 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Nồng độ saccharose (%) Biểu đồ 4.9 Ảnh hưởng nổng độ saccharose lên tăng sinh chủng Ps01 50  Nhận xét: Kết thu bảng 4.12 lần khẳng định kết luận Zeniat (2010) nồng độ nguồn carbon bổ sung có ảnh hưởng đến trình tăng sinh c Pseudomonas sp hợp lý Dựa vào biểu đồ 4.9, ta thấy nồng độ saccharose 1% khối lượng sinh khối Ps01 thu lớn nhất, đạt 168,1 mg Khối lượng sinh khối Ps01 giảm dần tăng nồng độ saccharose cao 1% Ở nồng độ 5% khối lượng sinh khối Ps01 giảm xuống 136,8 mg Kết tương đồng với nghiên cứu Zeniat (2010) Daffy BK (1999), cho thấy Pseudomonas sp tăng sinh tốt môi trường bổ sung nguồn carbon với nồng độ khoảng 1% - 1,2% giảm dần tăng nồng độ carbon Điều cho thấy nồng độ carbon bổ sung cao dẫn đến việc ức chế trình tăng sinh Pseudomonas sp Với kết này, chọn đường saccharose với nồng độ bổ sung 1% để tiến hành tăng sinh chủng Ps01 4.2.4 Ảnh hưởng nguồn nitrogen bổ sung [38], [40] Nitrogen thành phần quan trọng cấu tạo nên thể tế bào Nguồn nitrogen thường vi sinh vật sử dụng protein sản phẩm thủy phân protein (peptone, peptide, amino acid…), muối ammoni, nitrate, N phân tử… Pseudomonas sp sử dụng nguồn nitrogen vô hữu khác peptone, tryptone, urea, ammonium acetate, ammonium chloride, ammonium sulphate, ammonium phosphate, ammonium, potassium nitrate… Trong đề tài này, khảo sát ảnh hưởng số nguồn nitrogen khác để chọn lọc nguồn nitrogen thích hợp cho tăng sinh chủng Ps01 Mẫu đối chứng không bổ sung nguồn nitrogen Khối lượng sinh khối sau ni cấy trình bày bảng 4.13 51 Bảng 4.13 Ảnh hưởng nguồn nguồn nitrogen bổ sung lên tăng sinh chủng Ps01 Amonium chloride Lượng sinh khối khô 50ml môi trường tăng sinh (mg) 100,7 ± 0,92 Amonium sunfate 47,9 ± 0,31 Nguồn nitrogen Amonium phosphate 100,2 ± 0,74 Amonium nitrate 65,5 ± 1,51 Potassium nitrate 58,4 ± 1,29 Cao men 123,8 ± 0,49 Cao thịt 133,3 ± 0,82 Peptone 156,2 ± 0,84 Đối chứng 25,5 ± 0,63 Khối lượng sinh khối (mg/50ml) 180 160 140 120 100 80 60 40 20 Đối chứng Amonium Amonium Amonium Amonium Potassium Cao men Cao thịt chloride sunfate phosphate nitrate nitrate Peptone Nguồn nitrogen Biểu đô 4.10 Ảnh hưởng nguồn nitrogen bổ sung lên tăng sinh chủng Ps01 52  Nhận xét Chúng nhận thấy nguồn nitrogen bổ sung có ảnh hưởng đến khả tăng sinh chủng Ps01 (Bảng 4.13) Dựa vào biểu đồ 4.10, nhận thấy mẫu đối chứng khối lượng sinh khối thu nhỏ rõ rệt so với mơi trường có bổ sung nguồn nitrogen Bên cạnh đó, tăng sinh Ps01 mẫu đối chứng chủng có khả cố định nitrogen Tuy nhiên lượng sinh khối thấp chúng cần lượng định nguồn nitrogen để tăng sinh nhận thấy nuôi Ps01 mơi trường có bổ sung amonium sunfat khối lượng sinh khối thu thấp (47,9 mg) Khối lượng sinh khối thu cao (156,2 mg) với môi trường bổ sung nguồn nitrogen peptone Kết khảo sát cho thấy chủng Ps01 có nhu cầu nguồn nitrogen bổ sung tương tự với tăng sinh chủng P fluorescens Zeniat (2010) Weidenborner (1993) báo cáo Với kết trên, chúng tơi chọn peptone nguồn nitrogen thích hợp cho tăng sinh chủng Ps01 4.2.5 Ảnh hưởng nồng độ nitrogen bổ sung Tiến hành nuôi cấy chủng Ps01 môi trường chọn lọc mục 4.2.4 với nồng độ Khối lượng sinh khối (mg/50ml) peptone bổ sung thay đổi từ 0% đến 3% Kết khảo sát trình bày bảng 4.14 160 140 120 100 80 60 40 20 0 0,5 1,5 2,5 Nồng độ peptone (%) Biểu đô 4.11 Ảnh hưởng nồng độ nitrogen bổ sung lên tăng sinh chủng Ps01 53 Bảng 4.14 Ảnh hưởng nồng độ nitrogen bổ sung lên tăng sinh chủng Ps01 Nồng độ peptone bổ sung (%) Lượng sinh khối khô 50ml môi trường tăng sinh (mg) 24,1 ± 2,65 0,5 63,1 ± 2,17 1,0 144,8 ± 3,27 1,5 146,8 ± 0,72 2,0 141,7 ± 3,86 2,5 132,3 ± 2,31 3,0 123,7 ± 6,54  Nhận xét Các kết thu cho thấy nồng độ peptone ảnh hưởng đến khả tăng sinh chủng Ps01, nồng độ peptone thay đổi lư ợng sinh khối Ps01 thu thay đổi theo Dựa vào biểu đồ 4.11, nhận thấy lượng sinh khối chủng Ps tăng theo nồng độ peptone từ đến 1,5% đạt cực đại 1,5% sau giảm dần tiếp tục tăng nồng độ peptone bổ sung vào môi trường Môi trường không bổ sung peptone cho khả tăng sinh thấp rõ rệt Như vậy, nồng độ peptone môi trường cao dẫn đến ức chế trình tăng sinh Ps01 Tuy nhiên, theo nghiên cứu Zeniat cộng (2010), chủng P fluorescnes tăng sinh cho lượng sinh khối cao nồng độ 1% với nguồn nitrogen peptone Điều cho thấy chủng Pseudomonas khác sử dụng nguồn nitrogen với nồng độ khác Với kết này, chọn nồng độ peptone để bổ sung vào môi trường tăng sinh chủng Ps01 1,5% 4.2.6 Ảnh hưởng nồng độ khoáng MgSO4 bổ sung [37] Nguyên tố khoáng Mg2+ nguyên tố có tác động lớn đến việc hình thành tế bào hoạt động sinh lý vi sinh vật [1] Hơn nữa, MgSO4 thành phần môi trường King’s B, môi trường chọn lọc cho 54 phát triển Pseudomonas sp Vì vậy, tiến hành khảo sát ảnh hưởng MgSO4 bổ sung lên tăng sinh Ps01 cách bổ sung MgSO4.7H2O vào môi trường nuôi cấy với nồng độ khác Bảng 4.15 Ảnh hưởng nồng độ MgSO4.7H2O bổ sung lên tăng sinh Ps01 Nồng độ MgS04.7H2O (g/l) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 Lượng sinh khối khô 50ml môi trường tăng sinh (mg) 75,5 ± 0,16 96,8 ± 0,49 117,9 ± 0,82 120,2 ± 0,91 119,2 ± 0,52 144,1 ± 0,25 143,5 ± 0,57 145,2 ± 0,21 153,1 ± 0,29 147,4 ± 0,26 147,1 ± 0,09 Khối lượng sinh khối (mg/50ml) 160 140 120 100 80 60 40 20 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 Nồng độ MgS04.7H2O (%) Biểu đô 4.12 Ảnh hưởng nồng độ MgS04.7H2O bổ sung lên tăng sinh chủng Ps01 55  Nhận xét: Từ kết bảng cho thấy việc thay đổi nồng độ MgS04.7H2O ảnh hưởng đến khả tăng sinh chủng Ps01 Trong đó, nhận thấy khả tăng sinh tăng lên tăng nồng độ MgS04.7H2O từ 0,1 đến 0,8 g/l so với nghiệm thức không bổ sung MgS04.7H2O (Biểu đồ 4.11) Sau đó, tăng nồng độ MgS04.7H2O lên mức 0,9 g/l g/l khả tăng sinh có xu hướng giảm xuống Ở nồng độ MgS04.7H2O 0,8 g/l, khối lượng sinh khối khô thu lớn (153,1 mg) lượng sinh khối khô thu thấp không bổ sung MgSO4.7H2O vào môi trường (75,5 mg) (Biểu đồ 4.11) Kết tương đồng với nghiên cứu Pseudomonas putida SKG – Vinayakvà cộng (2011), cho thấy P putida tăng sinh tốt môi trường bổ sung MgSO4.7H2O với nồng độ khoảng – 10 g/l Như vậy, qua trình khảo sát, chúng tơi chọn nồng độ MgSO4.7H2O bổ sung thích hợp cho tăng sinh chủng Ps01 0,8 g/l 56 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua kết thí nghiệm, chúng tơi rút kết luận sau: 5.1.1 Khả đối kháng chủng Pseudomonas với chủng nấm bệnh Có số chủng Pseudomonas nghiên cứu có khả đối kháng với chủng nấm bệnh Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, Phytophthora capsici, Fusarium oxysporum, Fusarium ambrosium, Brachycladium papaveris Gilbertella persicaria) P putida Ps01 P aeruginosa BL 2.2 Trong đó, chủng Ps01 cho hiệu đối kháng cao đạt từ 49,17% - 76,67% với tất chủng nấm bệnh nuôi cấy đồng thời 5.1.2 Điều kiện mơi trường thích hợp cho nuôi cấy tăng sinh chủng P putida Ps01 Thành phần môi trường điều kiện nuôi cấy chủng P putida Ps01: Peptone 1,5% K2HPO4 0,15% MgSO4.7H2O 0,08% Saccharose 1% pH Điều kiện nuôi cấy: nuôi cấy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút liên tục 48 5.2 Đề nghị Qua q trình nghiên cứu, chúng tơi nhận thấy để kết thí nghiệm có ý nghĩa thiết thực hơn, cần giải vấn đề như: Đánh giá hiệu kiểm soát nấm bệnh P putida Ps01 trồng nhằm tìm điều kiện sửa dụng thích hợp Nghiên cứu nuôi cấy tăng sinh quy mô sản xuất nhằm thu nhận chế phẩm với số lượng lớn nghiên c ứu phương pháp bảo quản chế phẩm thu Chủng P putida Ps01 có khả ức chế tốt với chủng nấm bệnh nghiên cứu Tuy nhiên, với chủng nấm bệnh hiệu đối kháng Ps01 khác Vì vậy, cần khảo sát khả ức chế chủng Ps01 với số loại nấm bệnh gây hại trồng khác