Nghiên Cứu Xây Dựng Cơ Sở Dữ Liệu Trình Tự Gen Để Nhận Diện Nhanh Và Xác Định Mức Độ Đa Dạng Của Nhóm Lan Dendrobium Khu Vực Phía Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN NHƯ HOA NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU TRÌNH TỰ GEN ĐỂ NHẬN DIỆN NHANH VÀ XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ ĐA DẠNG CỦA NHĨM LAN DENDROBIUM KHU VỰC PHÍA NAM Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 42 02 01 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NƠNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2021 Cơng trình hoàn thành tại: TP HCM Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Dương Hoa Xô TS Trần Kim Định Phản biện 1: PGS TS Trịnh Ngọc Nam Phản biện 2: PGS TS Võ Thị Bạch Mai Phản biện 3: TS Huỳnh Thanh Tùng Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp Viện Khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp Miền Nam Ngày 21 tháng 12 năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư Viện Quốc gia Thư Viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Phong lan thực vật có hoa đẹp, màu sắc đa dạng, phong phú, nhiều đối tượng quan tâm Tại Việt Nam, phong lan họ phong phú đặc sắc hệ thực vật, có giá trị tài nguyên nhiều mặt kinh tế, đời sống người Lan Dendrobium chi có số lượng loài lớn thuộc họ Phong lan hệ thực vật Việt Nam, nhóm hoa lan yêu thích, tiêu thụ nhiều khắp Việt Nam Nhiều cơng trình nghiên cứu tiến hành nhằm bảo tồn đa dạng lồi lan, có Bộ sưu tập hoa lan Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Tp.HCM với gần 400 mẫu giống lan loại, có 190 mẫu giống thuộc chi lan Dendrobium Việc định danh hình thái cần mẫu vật với đầy đủ thành phần cấu tạo cây, đặc điểm hoa cung cấp thơng tin giúp đưa kết định danh tối ưu nhất, mẫu thu lúc có hoa Trong kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng việc phân định giống, loài, chí mức lồi thực vật, kỹ thuật mã vạch DNA đánh giá công cụ hữu dụng việc định danh loài thực vật, có lồi lan Đề tài nghiên cứu xác lập hệ thống mã vạch DNA để định danh phân loại đối tượng lan Dendrobium, sử dụng 40 mẫu giống Dendrobium có hoa khu vực miền Nam Việt Nam để tiến hành mô tả hình thái; giải trình tự vùng ITS, rbcL, matK, trnHpsbA 71 mẫu thuộc 25 loài Dendrobium 13 mẫu giống lai; sử dụng công cụ tin sinh học để phân tích mức độ đa dạng, mối quan hệ phát sinh lồi nhóm lan này; ứng dụng hệ thống trình tự để phân tích khả xác lập nguồn gốc bố mẹ số mẫu lan lai Mục tiêu đề tài Xây dựng sở liệu trình tự DNA - hệ thống mã vạch DNA để kiểm chứng đánh giá đa dạng di truyền số loài lan Dendrobium thu thập miền Nam Việt Nam Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học Đề tài xác định đa dạng di truyền nhóm lan Dendrobium khu vực phía Nam Việt Nam dựa vào đặc điểm hình thái DNA barcode Những thơng tin trình tự đăng ký GenBank, góp phần làm phong phú sở liệu lan Dendrobium từ làm tiền đề cho nghiên cứu sau Đề xuất marker tiềm giúp xác định nhanh loài lan Dendrobium nhằm bảo tồn nguồn gen quý Việt Nam 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu đề xuất sử dụng hệ thống mã vạch DNA nhằm phục vụ công tác nhận diện, định danh loài Dendrobium nhanh xác cơng tác bảo tồn quỹ gen Đối tượng phạm vi nghiên cứu 4.1 Đối tượng nghiên cứu Lan Dendrobium 4.2 Phạm vi nghiên cứu Nguồn vật liệu mẫu lan sử dụng từ Bộ sưu tập hoa lan Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp HCM, sản phẩm, kết thuộc đề tài “Sưu tập, nhập nội, chọn tạo nhân nhanh giống hoa lan phục vụ nội tiêu xuất khẩu” TS Dương Hoa Xô cộng nghiệm thu năm 2011 Đề tài tiến hành: - Phân tích xây dựng phân nhóm dựa 72 đặc tính hình thái 40 mẫu giống lan Dendrobium - Phân tích vùng trình tự rbcL, matK, trnH-psbA, ITS 84 mẫu giống (gồm 71 mẫu giống lan thuộc 25 loài Dendrobium đại diện khu vực miền Nam Việt Nam 13 mẫu giống lan lai) Những đóng góp đề tài Đề tài cung cấp thơng tin trình tự marker (ITS, matK, rbcL, trnH-psbA) loài lan Dendrobium địa Việt Nam nghiên cứu vào sở liệu GenBank Trong đó, có trình tự vùng rbcL, trnH-psbA thuộc nhiều mẫu giống chưa có công bố hạn chế GenBank Bước đầu đánh giá đa dạng di truyền trình tự DNA marker nhóm lan Dendrobium khu vực miền Nam Việt Nam Đề xuất marker tiềm cho việc phân định loài lan Dendrobium Bố cục Luận án Luận án gồm 127 trang (không kể phần Phụ lục): Mở đầu (5 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu sở khoa học đề tài (38 trang), Chương 2: Vật liệu, nội dung phương pháp nghiên cứu (22 trang), Chương 3: Kết nghiên cứu thảo luận (48 trang), Kết luận đề nghị ( trang), Tài liệu tham khảo (12 trang), sử dụng 26 tài liệu Tiếng Việt 96 tài liệu Tiếng Anh Luận án có 11 bảng, 43 hình phụ lục, cơng trình cơng bố CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI Luận án tham khảo tóm lược tài liệu Tiếng Việt Tiếng Anh , với nội dung liên quan bao gồm: Giới thiệu họ Phong lan, Giới thiệu lan Dendrobium, Thực trạng bảo tồn, nhận diện giống lan Dendrobium Việt Nam giới, Một số nghiên cứu đa dạng di truyền chi lan Dendrobium, Mã vạch DNA ứng dụng nhận diện loài 1.1 Giới thiệu họ Phong lan Theo Takhtajan năm 1987, họ Phong lan (Orchidaceae) họ thực vật lớn lớp Một mầm (Monocotylendoneae) họ lớn thứ hai (chỉ sau họ Cúc - Asteraceae) ngành Thực vật hạt kín (Angiospermae) 1.2 Giới thiệu lan Dendrobium 1.2.1 Vị trí phân loại Giới Plantae Ngành Angiospermae (Magnoliophyta) Lớp Monocotylendones (Liliopsida) Bộ Asparagales Họ Orchidaceae Họ phụ Epidendroideae Tông Epidendreae Chi Dendrobium 1.2.2 Sự phân bố Lan Dendrobium tìm thấy Đơng bán cầu, từ châu Úc, xuyên suốt Nam Thái Bình Dương, Philippine, Ấn Độ, số xuất Nhật Bản xuất nhiều Đông Nam Á 1.2.3 Sự đa dạng phong phú lan Dendrobium Chi lan Dendrobium có khoảng 1600 loài, đa dạng màu sắc, kiểu dáng, kích thước thích nghi với điều kiện sinh thái khác 1.2.4 Đặc điểm hình thái lan Dendrobium 1.3 Thực trạng bảo tồn, nhận diện giống loài lan Dendrobium Việt Nam giới Trên giới, hoạt động bảo tồn lan quan tâm tiến hành nhiều trung tâm dự án chuyên biệt Các nghiên cứu theo hướng nhân giống in vitro nhằm bảo tồn loài thuộc chi lan Dendrobium nhà khoa học quan tâm Cùng với để cơng tác thực có hiệu việc định danh xác mẫu vật công đoạn quan trọng Phương pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời thực tế, nhiều trường hợp gặp khó khăn công tác định danh Bằng cách khai thác tiến di truyền học phân tử, công nghệ trình tự nucleotide tin sinh học, mã vạch DNA cho phép nhận diện cách nhanh chóng xác giống lồi biết lấy thơng tin từ chúng 1.4 Một số nghiên cứu đa dạng di truyền chi lan Dendrobium 1.4.1 Các thị sử dụng để phân tích đa dạng di truyền chi lan Dendrobium Rất nhiều loại thị sử dụng để phân tích đa dạng di truyền cho quần thể, lồi sinh vật thị hình thái, thị tế bào học, thị hoá sinh, thị DNA Ngày nay, thị phân tử xem công cụ đánh giá đa dạng di truyền hiệu chúng khơng bị ảnh hưởng điều kiện mơi trường, kiểu hình Có nhiều kỹ thuật, loại thị phân tử khác nhau, số thị sử dụng để phân tích đa dạng di truyền cho họ Lan AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), RAPD (Randomly Amplified Polymorphism DNA), RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms), SSRs (Microsatellite or Simple Sequence Repeats), ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat) phương pháp sử dụng liệu trình tự DNA 1.4.2 Các nghiên cứu đa dạng di truyền chi lan Dendrobium Với kỹ thuật công nghệ sinh học phát triển mạnh, nhà khoa học Singapore, Đài Loan, Thái Lan đẩy mạnh nghiên cứu đối tượng thị SSR, AFLP, RAPD, ISSR, RFLP 1.5 Mã vạch DNA ứng dụng nhận diện loài Mã vạch DNA nhiều trình tự gen lấy từ mẫu gen chuẩn hóa gen, dùng để xác định loài, ứng dụng để nhận dạng loài áp dụng động vật 1.5.1 Các trình tự sử dụng để xây dựng mã vạch DNA Ở thực vật, DNA nhân, lục lạp ty thể nghiên cứu để sử dụng phân tích định danh phân tử Trong đó, gen ty thể tiến hóa với tốc độ chậm nhất, gen lục lạp với tốc độ nhanh hệ gen nhân với tốc độ nhanh Trong nghiên cứu Kress cộng (2005), hai vùng gen đề xuất ứng viên tiềm cho ứng dụng mã vạch DNA thực vật có hoa, vùng ITS trnH-psbA Tổ chức Kew, Royal Botanic Gadens, Anh, đề xuất ứng cử viên chọn làm DNA barcode cho thực vật vùng gen matK, rpoC1, rpoB, accD YCF5, sau đề nghị có phối hợp gen rpoC1 + rpoB + matK rpoC1 + matK + trnH-psbA với để DNA barcoding hiệu Tổ chức CBOL đề xuất kết hợp matK rbcL mã vạch cho thực vật (2009) Tổ chức China Plant BOL Group đề xuất việc bổ sung vùng ITS kết hợp với matK + rbcL mã vạch cho thực vật (2011) Hội thảo quốc tế lần thứ Barcode cho sống đề nghị sử dụng trình tự để làm mã vạch cho thực vật matK + rbcL + psbA-trnH Kế thừa kết nghiên cứu trên, đề tài định chọn trình tự để phân định, phân tích đa dạng di truyền cho lồi Dendrobium nghiên cứu ITS, rbcL, matK, psbA – trnH 1.5.2 Các cơng trình xây dựng mã vạch DNA cho họ Lan chi Dendrobium Ngay sau khái niệm mã vạch DNA đời, nhiều cơng trình Việt Nam giới tập trung vào việc thiết lập liệu DNA cho sinh vật địa có lồi lan Nhiều nghiên cứu tiến hành khảo sát trình tự vùng ITS, ITS1, ITS2, psbAtrnH, matK, rbcL, rpoB, rpoC, Đại đa số cơng trình cho thấy mã vạch thuộc hệ gen lục lạp có khả phân định thấp so với mã vạch thuộc hệ gen nhân, ITS có tỉ lệ phân định cao nhất, mã vạch có kết hợp nhiều trình tự điều kiện tiên cho mã vạch thực vật nói chung, Dendrobium nói riêng Các cơng trình nghiên cứu kết luận trình tự ITS, psbAtrnH sử dụng làm marker tiềm để xác định loài lan Dendrobium, matK rbcL vùng có mức độ bảo tồn cao hơn, dùng làm liệu để phân tích mối quan hệ phát sinh lồi kết hợp với trình tự khác để làm mã vạch CHƯƠNG VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, thời gian, địa điểm nghiên cứu • Vật liệu: lan Dendrobium - Mơ tả hình thái: 40 mẫu giống lan Dendrobium thuộc Bộ sưu tập hoa lan Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Tp HCM - Giải trình tự: sử dụng mẫu bánh tẻ 84 mẫu giống lan Dendrobium Trong đó: 71 mẫu giống 25 lồi Dendrobium địa để xây dựng sở liệu mã vạch DNA, 13 mẫu giống lai để ứng dụng truy nguyên nguồn gốc bố mẹ giống lai • Thời gian, địa điểm: 8/2014 – 8/2018, Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp HCM 2.2 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Mô tả, xây dựng phát sinh dựa đặc điểm hình thái Nội dung 2: Xây dựng hệ thống mã vạch DNA cho mẫu vật nghiên cứu Nội dung 3: Đánh giá đa dạng di truyền nhóm lan Dendrobium trình tự DNA marker Nội dung 4: Ứng dụng hệ thống DNA để truy xuất nguồn gốc bố, mẹ tổ hợp lan lai Trung tâm Công nghệ sinh học Tp HCM thực số giống lai khác 2.3 Phương pháp nghiên cứu 11 Sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 0,8%, 120V, 65mA 20 phút 2.3.2.4 Giải trình tự Giải trình tự chiều phương pháp Sanger sequencing 2.3.2.5 Hiệu chỉnh trình tự Trình tự thơ hiệu chỉnh phần mềm FinchTV để loại bỏ vùng mơ hồ kiểm tra mức độ tin cậy peak tín hiệu; BLAST sở liệu NCBI để kiểm tra mức độ tương đồng, xác định xác nguồn gốc trình tự; gióng cột phần mềm SeaView 4.0 nhằm phân tích sai khác trình tự Trình tự vùng ITS2 tách từ trình tự vùng ITS (JN388570.1) 2.3.3 Đánh giá đa dạng di truyền nhóm lan Dendrobium trình tự DNA marker Việc đánh giá mức độ đa dạng di truyền dựa mức độ phân nhánh phát sinh dựa vùng trình tự theo cách marker riêng lẻ ghép cặp marker với Cây phát sinh xây dựng thuật tốn Maximum Likelihood với mơ hình Kimura-2 thơng số với 1.000 lần lặp lại phần mềm MEGA 7.0 2.3.4 Đánh giá khả phân định lồi marker Các vùng trình tự marker khảo sát dựa khả phân định phát sinh, kết hợp với việc phân tích đoạn In-del, phương pháp “Best Match / Best Close Match” để chọn marker tiềm Phân tích In-del dựa đột biến thêm nucleotide (insertion) đột biến nucleotide (deletion) Phương pháp “Best Match/ Best Close Match” dựa so sánh khoảng cách di truyền trình tự phân tích 12 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Mô tả xây dựng phân nhóm dựa đặc điểm hình thái giống lan Dendrobium 3.1.1 Mơ tả đặc điểm hình thái sơ giống lan Dendrobium Đề tài mơ tả hình thái 40 mẫu giống lan Dendrobium (37 mẫu Dendrobium địa giống lai ) Mỗi mẫu giống ghi nhận 72 đặc điểm hình thái dựa khảo nghiệm DUS hình ảnh thực tế, rõ nét, độ phân giải cao, Từ việc phân tích hình thái, nghiên cứu nhận thấy nhầm lẫn định danh mẫu giống Thuỷ tiên vàng (D thyrsiflorum Lindl.) điều chỉnh thành Thuỷ tiên hồng lạp (D chrysotoxum Lindl.) 3.1.2 Phân tích mối quan hệ di truyền 40 mẫu lan Dendrobium nghiên cứu Cây phân nhóm dựa 72 đặc điểm hình thái phần thể mối quan hệ di truyền 40 mẫu giống Dendrobium nghiên cứu Bên cạnh đó, số lồi có hình thái giống nhau, mối quan hệ gần gũi kết thể phân nhóm chưa phản ánh điều Cụ thể, kết phân nhóm chia 40 mẫu nghiên cứu thành nhóm: Nhóm I: D amabile D palpebrae Nhóm II gồm nhóm nhỏ: Nhóm IIA có 17 đại diện có mẫu D hemcoglossum có dạng thân thịng; nhóm IIB có 21 đại diện có tới 10 mẫu có dạng thân thịng D anosmum (7,8,9,10), D aphyllum (11,12) D parishii (28) có tương đồng nhiều hình thái, có mối quan hệ tiến hóa gần gũi 13 lồi lai hình thành từ D anosmum D aphyllum xếp chung thành nhóm Tuy nhiên, lai Hoàng thảo trầm hồng (D anosmum x D parishii) lại tách riêng thuộc nhóm khác chung với D hercoglossum, D heterocarpum D venustum Long tu (D primulinum) long tu đá (D crepidatum) có tương đồng nhiều hình thái nên tách riêng thành nhánh nhỏ nhóm IIB Mẫu Thái bình lai (D Gaston sunray) có nguồn gốc lai (D pulchellum x D chrysotoxum) D pulchellum, phân nhóm hình thái, mẫu Thái bình lai nhóm IIA, với D chrysotoxum, cịn D pulchellum thuộc nhóm IIB 3.2 Xây dựng hệ thống mã vạch DNA 3.2.1 Kết khuếch đại vùng trình tự Đề tài xây dựng sở liệu trình tự DNA 71 mẫu giống đại diện cho 25 lồi Dendrobium địa khu vực phía Nam Việt Nam DNA tổng số 71 mẫu sử dụng làm khuôn để khuếch đại vùng ITS, matK, trnH-psbA, rbcL Phân tích kết điện di cho thấy, phần lớn băng sáng, rõ, khơng có tượng đa băng xảy ra, cặp mồi bắt cặp đặc hiệu với vùng trình tự tương ứng Các vùng trình tự mục tiêu khuếch đại thành cơng, có kích thước phù hợp với kết báo cáo trước 14 Bảng 3.1 Thống kê kết khuếch đại vùng trình tự nghiên cứu Kích thước sản Barcode PCR PCR ratio (%) ITS 71/71 100 700-800 matK 69/71 97,18 900 - 1000 rbcL 36/36 100 600 trnH-psbA 58/71 81,69 900 - 1000 phẩm PCR (bp) 3.2.2 Phân tích thiết lập sở liệu trình tự DNA cho số giống lan Dendrobium nghiên cứu Bảng 3.2 Thống kê kết giải trình tự vùng nghiên cứu Barcode Sequencing Kích Vị trí Vị trí Sequencing thước bảo biến ratio trình tự tồn đổi (%) sau hiệu chỉnh rbcL 36/36 100,00 500 475 25 matK 69/69 100,00 822 734 88 58/58 100,00 784 725 59 71/71 100,00 639 276 363 trnHpsbA ITS Tất trình tự sau hiệu chỉnh, BLAST với sở liệu GenBank Đại đa số kết trình BLAST 15 trình tự Dendrobium, với giá trị độ bao phủ, giá trị độ tương đồng cao Điều cho thấy mẫu thu thập đáng tin cậy, khơng bị lẫn tạp, q trình bảo quản mẫu tốt, đạt độ tin cậy cao Trong tất mẫu BLAST, có trình tự rbcL mẫu thuộc loài Trường sơn (D venustum) cho kết BLAST tương đồng với trình tự rbcL lồi thuộc chi Bulbophylum Kết giải thích trình tự vùng rbcL có độ bảo tồn cao Kết BLAST cho thấy mẫu D thyrsiflorum D chrysotoxum, mẫu có kí hiệu 6TT 6DT D anosmum khơng phải D aphyllum, mẫu 28TT D primulinum khơng phải D capillipes Các trình tự phân tích đăng ký Genbank 3.2.2.1 Phân tích thiết lập sở liệu trình tự DNA cho số giống lan Dendrobium marker đơn 3.2.2.1.1 Kết phân tích DNA barcode rbcL đánh giá đa dạng di truyền cho mẫu nghiên cứu với barcode Trong trình nghiên cứu, khuếch đại giải trình tự vùng rbcL với mẫu thuộc loài, kết align phát sinh lồi cho thấy chí khơng có biến đổi đại diện thuộc lồi Sau đó, lồi khác phân tích với đại diện cho lồi cho kết gần khơng có khác biệt trình tự rbcL mẫu thuộc lồi Do đó, đề tài giải trình tự vùng rbcL cho 36 mẫu đại diện cho 25 loài Dendrobium khu vực phía Nam nghiên cứu Trình tự rbcL vùng có mức độ bảo tồn cao, khác biệt trình tự thấp nên trình tự phát sinh rbcL nằm trải dài có nhánh Số lượng lồi phân định thấp (7/25 loài) 16 gồm: D aloifolium, D crumenatum, D aphyllum, D capillipes, D crystallinum, D secundum D venustum Như vậy, vùng rbcL có giá trị xây dựng mã vạch, dùng để nhận diện mức chi họ, sử dụng kết hợp với mã vạch khác để xác định mức loài 3.2.2.1.2 Kết phân tích DNA barcode matK đánh giá đa dạng di truyền cho mẫu nghiên cứu với barcode Trong số gen lục lạp, matK gen tiến hố nhanh nhất, có kích thước khoảng 1550 bp mã hóa cho enzyme maturase Do matK tiến hố nhanh có mặt hầu hết thực vật nên sử dụng thị nghiên cứu mối quan hệ loài phát sinh loài thực vật Trong nghiên cứu này, phát sinh xây dựng từ 69 trình tự vùng matK 25 lồi Dendrobium nghiên cứu cho thấy: D hercoglossum, D signatum, D nobile, D fimbriatum, D chrysotoxum, D devonianum, D pulchellum, D crystallinum, D primulinum, D aphyllum, D anosmum D cretaceum có mối quan hệ gần gũi D capillip, D sulcatum, D hancokii, D venustum thuộc nhánh Các loài D crumenatum, D aloifolium, D intricatum, D secundum loài D amabile, D densiflorum, D farmeri tạo thành nhóm riêng biệt Cây phát sinh từ vùng matK cho thấy mẫu nghiên cứu phân thành nhánh riêng biệt với trình tự từ GenBank bao gồm: D aloifolium, D amabile, D aphyllum, D capillipes, D chrysotoxum, D crumenatum, D crystallinum, D intricatum, D 17 sulcatum, D hancockii, D pulchellum D venustum Mức độ phân định loài matK (12/25 loài) cao so với rbcL (7/25 lồi) Vùng matK phân định tốt chúng tiến hóa nhanh mức độ bảo tồn thấp vùng rbcL 3.2.2.1.3 Kết phân tích DNA barcode trnH-psbA đánh giá đa dạng di truyền cho mẫu nghiên cứu với barcode Cây phát sinh xây dựng từ 58 trình tự vùng trnH-psbA 25 loài nghiên cứu cho thấy: D fimbriatum, D chrysotoxum, D devonianum, D primulinum, D aphyllum, D anosmum, D cretaceum, D salaccence, D intricatum, D secundum, D sulcatum, D parishii, D primulinum tạo thành nhóm riêng biệt có mối quan hệ gần với nhóm khác gồm loài D hercoglossum, D signatum, D nobile, D pulchellum, D crystallinum, D tortile, D densiflorum, D venustum D farmeri D amabile nằm riêng lẻ D aloifolium D crumenatum có mối quan hệ gần gũi Số lượng loài phân định thấp (8/25 loài trnH-psbA) gồm: D aloifolium, D amabile, D aphyllum, D sulcatum, D crumenatum, D salaccense, D pulchellum D venustum Dữ liệu vùng trình tự lồi Dendrobium thuộc GenBank cịn hạn chế, nên việc nhận định lồi phân định chưa rõ ràng 3.2.2.1.4 Kết phân tích DNA barcode ITS đánh giá đa dạng di truyền cho mẫu nghiên cứu với barcode 18 Trình tự vùng ITS cho phát sinh loài 25 loài Dendrobium cho thấy D hercoglossum, D signatum, D nobile, D fimbriatum, D chrysotoxum, D devonianum, D pulchellum, D crystallinum, D primulinum, D aphyllum, D anosmum, D cretaceum, D tortile, D hancokii, D intricatum D secundum có quan hệ gần gũi với gần với loài Hoàng thảo Thuỷ tiên D amabile, D sulcatum, D densiflorum D farmeri D venustum tách thành nhóm riêng D crumenatum D aloifolium có quan hệ gần gũi với Cây phát sinh từ vùng ITS phân định 16/25 loài: D aloifolium, D amabile, D aphyllum, D capillipes, D chrysotoxum, D crumenatum, D crystallinum, D densiflorum, D farmeri, D intricatum, D parishii, D pulchellum, D hancockii, D secundum, D sulcatum D venustum Kết phân tích phát sinh cho thấy mẫu D salaccense (24DT – Hoàng thảo trúc) nghiên xác định lại tên khoa học thành D hancockii (Hoàng trúc lan); loài D fimbriatum phân thành hướng khác tiến hóa; hai lồi D signatum D tortile có tương đồng mặt phân tử đặc điểm hình thái, lồi phải mối quan hệ di truyền chặt chẽ Đề tài thu nhận trình tự vùng ITS2 từ vùng ITS, ITS2 báo cáo vùng tiềm việc phân định lồi Kết phân tích trình tự ITS2 nghiên cứu cho thấy ITS2 có tỷ lệ vị trí biến đổi cao so với ITS, nhiên so sánh phát sinh dựa ITS ITS2 không thấy khác biệt chúng Từ cho thấy vùng ITS2 xem marker tiềm cho việc phân tích đa dạng di truyền nhóm lan Dendrobium 19 Tóm lại, với mã vạch nhất, ITS ứng cử viên tốt cho loài thuộc chi Dendrobium 3.2.2.2 Kết phân tích đánh giá đa dạng di truyền mẫu nghiên cứu với vùng marker ghép Kết phân tích phát sinh cho thấy tiến hành ghép cặp cho kết phân định loài lần lượt: ITS-matK (18/25), ITS-rbcL (18/25), ITS-trnHpsbA (15/25), matK-rbcL (18/25), matK-trnH-psbA (18/25), rbcL- trnHpsbA (16/25) Việc bắt cặp vùng ITS với vùng DNA lại cho kết phân định, độ tin cậy nhánh cao so với gen riêng lẻ: matK, rbcL trnH-psbA Đặc biệt, bắt cặp ITS-matK phân định thêm loài D cretaceum D primulinum so với trình tự ITS riêng lẻ Kết phân định loài dựa tổ hợp ghép marker lần lượt: ITSmatK-rbcL (18/25), ITS-matK-trnH-psbA (18/25), ITS-rbcL-trnH-psbA (19/25), matK-rbcL-trnH-psbA (18/25), ghép marker 19/25 Trong số thử nghiệm xây dựng phát sinh lồi việc ghép trình tự 2-4 marker, ITS-rbcL-matK-trnH-psbA cho thấy phân định loài tốt (19/25), tốt so với mã vạch ITS Nghiên cứu đề xuất mã vạch ITS-rbcL-matK-trnH-psbA nên lựa chọn việc mã hố lồi Dendrobium 3.3 Kết khảo sát marker tiềm việc xác định lồi lan Dendrobium khu vực phía Nam Nghiên cứu khảo sát vùng trình tự marker tiềm việc phân định loài kết hợp phương pháp dựa phát sinh chủng loại, thông tin vùng In-del, phương pháp “Best Match/ Best Close Match” 20 Bảng 3.3 Kết phân tích thơng số marker ITS, ITS2, matK, rbcL, trnH-psbA việc phân định lồi Dendrobium Trình tự Kích thước (bp) Số mẫu Số loài ITS 639 71 25 ITS 252 71 25 mat K 822 69 25 rbc L 501 35 22 trn Hpsb A 784 58 25 Variable site Parsimo ny Singleton (%) (%) (%) 363 344 19 (56,80) (53,83) (2,97) 168 156 12 (66,66) (61,90) (4,76) 88 62 26 (10,70) (7,54) (2,46) 26 18 (5,18) (3,60) (1,58) 59 41 18 (7,52) (5,22) (2,30) Số loài phân định dựa phát sinh Số loài phân định dựa phát sinh đoạn In-del 16/25 18/25 16/25 16/25 12/25 12/25 7/25 7/25 8/25 8/25 Indel Phân tích thơng tin vị trí In – del cho thấy phân định lồi D cretaceum D primulinum thông tin vị trí In-del trình tự ITS vị trí nucleotide 86, 89, 221-222, vị trí khơng nằm trình tự vùng ITS2 Mặc dù vùng ITS đa dạng so với ITS2, trình tự (15 vị trí) chứa nhiều vị trí In-del so với ITS2 (12 vị trí) Kết “Best Match/ Best Close Match” cho thấy vùng ITS2 có số lượng trình tự “Correct matchs” cao nhất, ITS, trnHpsbA matK, vùng rbcL cho kết thấp marker 21 khảo sát Khi dùng phương pháp “Best Close Match” với giá trị ngưỡng 3%, vùng ITS ITS2 cho kết (49 trình tự phân định được) cao marker khảo sát Khi so sánh phương pháp “Best Match / Best Close Match” với phương pháp dùng phát sinh kết hợp với thông tin In-del có tương đồng kết thu vùng ITS2 (66,66 %) ITS (56,80 %) cho kết đa hình nucleotide (dựa vị trí Variable) cao so sánh với vùng matK (10,70 %), trnH-psbA (6,52 %) rbcL (5,18 %) Trong vùng ITS2 có mức độ đa hình cao so với vùng trình tự ITS Từ đó, nghiên cứu đề xuất vùng ITS ITS2 marker tiềm cho việc xác định nhanh nhóm lan Dendrobium 3.4 Kết ứng dụng hệ thống DNA để phân tích khả xác lập nguồn gốc bố, mẹ tổ hợp lan lai Kết phát sinh xây dựng dựa trình tự vùng ITS cho thấy mẫu giống lan lai Thái Lan nằm riêng phần phát sinh, tách biệt với mẫu Dendrobium địa nghiên cứu Khi bổ sung trình tự vùng ITS tổ hợp lai Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp.HCM, tổ hợp lai nằm nhóm với lan lai Thái Lan Đối với mẫu giống lan lai có nguồn gốc hoàn toàn từ lan địa, chúng nằm chung nhóm với mẫu cho nguồn gốc bố mẹ chúng Tuy nhiên, trình tự vùng ITS khơng thể giúp xác lập nguồn gốc bố mẹ cho mẫu lai Kết phát sinh xây dựng dựa trình tự vùng matK cho thấy mẫu giống lan lai Thái Lan nằm riêng phần phát sinh, tách biệt với mẫu Dendrobium địa nghiên cứu Khi bổ sung trình tự vùng matK tổ hợp lai 22 Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp.HCM, tổ hợp lai nằm nhóm với lan lai Thái Lan Kết hoàn toàn phù hợp với báo cáo Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp.HCM, tạo tổ hợp lai sử dụng lai có nguồn gốc nhập nội từ Thái Lan làm mẹ, điều lần khẳng định D Burana white có nguồn gốc mẹ L1 12; D Burana stripe có nguồn gốc mẹ 207 Riêng mẫu 88 nằm chung nhóm với D Shavin white D Charming white nên trình tự vùng matK khơng giúp tái tái xác lập vai trị bố mẹ trường hợp Trình tự vùng matK giúp khẳng định D pulchellum giữ vai trò mẹ nguồn gốc tạo D Gatton sunray Phân tích vùng trình tự trnH-psbA giúp xác định vai trò bố mẹ trường hợp Giã hạc Châu Như Vị trí lồi phát sinh cho thấy D anosmum có nguồn gốc mẹ trình lai tạo Giã hạc Châu Như Tóm lại, trình tự vùng matK, trnH-psbA sử dụng để tái xác nhận vai trò bố mẹ cho số giống lai Nghiên cứu ứng dụng hệ thống trình tự DNA matK, trnH-psbA tái xác nhận nguồn gốc bố mẹ tổ hợp lan lai giống lan lai khác Trong đó, tổ hợp lan lai Trung tâm công nghệ sinh học Tp HCM, giống lan lai khác xác định giống/ lồi giữ vai trị nguồn gốc bố, giống/ lồi giữ vai trị nguồn gốc mẹ 23 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ Kết luận Trên sở kết nghiên cứu thu nhận, đến kết luận sau: Xây dựng sở liệu đặc điểm hình thái, hình ảnh minh họa phân nhóm cho 40 mẫu lan Dendrobium khu vực phía Nam Việt nam Đây sở liệu đáng tin cậy, phục vụ cho việc so sánh, đánh giá nhận diện mẫu lan thuộc chi Dendrobium Có 25 lồi lan Dendrobium địa chọn lọc để phân tích vùng trình tự ITS, matK, rbcL trnH-psbA Bộ liệu gồm trình tự thu nhận nghiên cứu so sánh với sở liệu GenBank đáng tin cậy dùng để xác định mối quan hệ họ hàng lồi Dendrobium Từ sở đăng kí 245 liệu trình tự GenBank (Phụ lục 6), có 36 trình tự vùng rbcL, 76 trình tự vùng ITS, 72 trình tự vùng matK, 61 trình tự vùng trnH-psbA (tất trình tự nghiên cứu 25 lồi địa số trình tự loài lai) Đặc biệt, liệu đóng góp trình tự vùng rbcL, 44 trình tự vùng trnH-psbA lồi chưa cơng bố GenBank, tất trình tự đăng kí có nguồn gốc Việt Nam Các kết sở cho nghiên cứu thị DNA barcode đa dạng cho loài lan Dendrobium Phân tích DNA barcode đánh giá đa dạng di truyền cho 25 lồi lan Dendrobium với trình tự ITS, matK, rbcL trnHpsbA cho thấy 19 loài lan Dendrobium xác định, nhiều lồi có mức độ đa dạng trình tự cao mẫu thuộc 24 lồi Trình tự vùng ITS (hoặc ITS2) có mức độ đa dạng di truyền cao vùng cịn lại sử dụng để nhận diện xác định mức độ đa dạng loài lan Dendrobium, cho lồi lan Dendrobium nói chung Trong nghiên cứu này, việc kết hợp vùng trình tự làm mã vạch 25 loài Dendrobium cho kết nhận diện loài tốt (19/25 loài) với độ tin cậy cao Khảo sát khả truy nguyên nguồn gốc bố mẹ cho 5/7 mẫu giống Dendrobium lai trình tự vùng matK, trnH-psbA Đây liệu để đánh giá mẫu giống công tác lai tạo bổ sung vào hồ sơ lý lịch tổ hợp lan Dendrobium lai Đề nghị - Phát triển sở liệu phân tử (trình tự vùng ITS, rbcL, matK, trnH-psbA) đồng cho loài lan khác thuộc chi Dendrobium, loài thuộc chi khác họ phong lan có giá trị thẩm mỹ, kinh tế Phalaenopsis, Aerides, Coelogyne - Nghiên cứu ứng dụng công nghệ NGS để đánh giá đa dạng nhận diện lồi cho nhóm lan Dendrobium CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Trong nước • Nguyễn Như Hoa, Trần Hồng Dũng, Dương Hoa Xơ, Huỳnh Hữu Đức 2017 Phân tích mối quan hệ phát sinh chủng loài số mẫu lan Dendrobium dựa trình tự vùng ITS “Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nơng nghiệp Việt Nam”,12(85): tr 41-46 • Nguyễn Như Hoa 2018 Phân tích trình tự vùng ITS số lồi Hồng thảo Thủy Tiên “Tạp chí Khoa học tự nhiên công nghệ trường Đại học Sư pham Tp HCM”, 15(6): tr 149-155 Quốc tế • Nhu-Hoa Nguyen, Huyen-Trang Vu, Ngoc-Diep Le, ThanhDiem Nguyen, Hoa-Xo Dương, Hoang-Dung Tran (2020), “Molecular identification and evaluation of the genetic diversity of Dendrobium species collected in Southern Vietnam” Biology 2020, 9(4), 76; https://doi.org/10.3390/biology9040076 • Nhu-Hoa Nguyen, Tuan-Loc Le, Huyen-Trang Vu, KimDinh Tran, Hop Tran, Hoa-Xo Dương, Hoang-Dung Tran (2020), “Analysis and Categorization of Several Dendrobium Species Based on Morphological Traits” Annual Research & Review in Biology, 35(3), https://doi.org/10.9734/arrb/2020/v35i330205 97-114; ... nhiều lồi có mức độ đa dạng trình tự cao mẫu thuộc 24 lồi Trình tự vùng ITS (hoặc ITS2) có mức độ đa dạng di truyền cao vùng cịn lại sử dụng để nhận diện xác định mức độ đa dạng loài lan Dendrobium, ... thuộc nhóm IIB 3.2 Xây dựng hệ thống mã vạch DNA 3.2.1 Kết khu? ??ch đại vùng trình tự Đề tài xây dựng sở liệu trình tự DNA 71 mẫu giống đại diện cho 25 lồi Dendrobium địa khu vực phía Nam Việt Nam. .. ứng dụng nhận diện lồi Mã vạch DNA nhiều trình tự gen lấy từ mẫu gen chuẩn hóa gen, dùng để xác định loài, ứng dụng để nhận dạng loài áp dụng động vật 1.5.1 Các trình tự sử dụng để xây dựng mã