Nghiên cứu xây dựng cơ sở dữ liệu trình tự gen để nhận diện nhanh và xác định mức độ đa dạng của nhóm lan dendrobium khu vực phía nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT B NÔ VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN NHƯ HOA NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU TRÌNH TỰ GEN ĐỂ NHẬN DIỆN NHANH VÀ XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ ĐA DẠNG CỦA NHÓM LAN DENDROBIUM KHU VỰC PHÍA NAM Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Dương Hoa Xô TS Trần Kim Định Tp Hồ Chí Minh – Năm 2021 NG V PT BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM -NGUYỄN NHƯ HOA NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU TRÌNH TỰ GEN ĐỂ NHẬN DIỆN NHANH VÀ XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ ĐA DẠNG CỦA NHĨM LAN DENDROBIUM KHU VỰC PHÍA NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NƠNG NGHIỆP Tp Hồ Chí Minh – Năm 2021 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn PGS TS Dương Hoa Xô TS Trần Kim Định Các số liệu kết trình bày luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình người khác Các kết người tham gia thực đồng ý cho phép sử dụng luận án Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm số liệu kết luận án Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng năm 2020 Nghiên cứu sinh Nguyễn Như Hoa ii LỜI CẢM ƠN Để hồn thành q trình học tập nghiên cứu mình, tơi nhận nhiều giúp đỡ từ gia đình, thầy cơ, đồng nghiệp, bạn bè ủng hộ, tạo điều kiện quan tổ chức Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Dương Hoa Xô - Giám đốc Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh - thầy hướng dẫn luận án, truyền đạt ý tưởng, định hướng nghiên cứu, kiến thức kinh nghiệm cho suốt q trình thực luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn đến TS Trần Kim Định - Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam - thầy hướng dẫn phụ, hướng dẫn, truyền đạt kiến thức đóng góp nhiều ý kiến quý báu suốt q trình thực luận án Tơi xin chân thành cảm ơn PGS TS Trần Hoàng Dũng giúp tơi tiếp cận với hướng nghiên cứu này, ln góp ý, giúp đỡ, động viên, khích lệ tơi suốt q trình thực luận án Tơi xin cảm ơn TS Huỳnh Hữu Đức theo sát, động viên đưa nhiều góp ý suốt q trình thực luận án Tôi xin trân trọng gởi lời cảm ơn đến: - Ban Giám hiệu trường Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa Sinh học trường Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh đồng nghiệp, sinh viên tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập, nghiên cứu, công tác trường - Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh, phịng Thực nghiệm trồng, phịng Cơng nghệ sinh học thực vật, TS Hà Thị Loan, KS Nguyễn Trường Giang hỗ trợ mẫu vật, trang thiết bị, hố chất q trình nghiên cứu Trung tâm - Ban lãnh đạo Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập - Các cán Viện Khoa học Kỹ thuật Nơng nghiệp Miền Nam hướng dẫn, góp ý, bổ sung kiến thức tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành thủ tục, hồ sơ trình đào tạo iii - GS TS Bùi Chí Bửu tất q thầy (giảng dạy tham gia Hội đồng báo cáo tiến độ, Hội đồng đánh giá nghiên cứu sinh) truyền đạt kiến thức, đóng góp nhiều ý kiến quý báu tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu - TS Trần Duy Dương (Viện Di truyền nông nghiệp), Th.S Vũ Thị Huyền Trang, Th.S Nguyễn Thành Công, CN Nguyễn Thanh Điềm, CN Lê Ngọc Điệp (khoa Công nghệ sinh học Trường đại học Nguyễn Tất Thành) hỗ trợ tơi nhiều để hồn thành luận án - Quý thầy cô giáo giảng dạy truyền đạt kiến thức cho qua giai đoạn học tập, anh chị em đồng nghiệp bạn bè thân hữu cộng tác hỗ trợ tơi suốt q trình học tập, làm việc nghiên cứu - Các nghệ nhân nhà vườn trồng lan giúp đỡ tạo điều kiện tối đa cho tơi q trình thu mẫu Cuối cùng, xin gởi lời tri ân sâu sắc tình cảm ấm áp đến Bố, Mẹ tất người thân yêu gia đình hết lòng động viên, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình trưởng thành, học tập nghiên cứu iv MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iv DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT xi MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu chung 2.2 Mục tiêu cụ thể Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn 4 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 4.1 Đối tượng nghiên cứu 4.2 Phạm vi nghiên cứu 5 Những đóng góp đề tài CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 1.1 Giới thiệu họ Phong lan 1.2 Giới thiệu lan Dendrobium 1.2.1 Vị trí phân loại 1.2.2 Sự phân bố v 1.2.3 Sự đa dạng phong phú lan Dendrobium 1.2.4 Đặc điểm hình thái lan Dendrobium 13 1.3 Thực trạng bảo tồn, nhận diện giống loài lan Dendrobium Việt Nam giới 16 1.4 Một số nghiên cứu đa dạng di truyền chi lan Dendrobium 20 1.4.1 Các thị sử dụng để phân tích đa dạng di truyền chi lan Dendrobium 20 1.4.2 Các nghiên cứu đa dạng di truyền chi lan Dendrobium 22 1.5 Mã vạch DNA ứng dụng nhận diện loài 27 1.5.1 Các vùng trình tự sử dụng để xây dựng mã vạch DNA 27 1.5.2 Các cơng trình xây dựng mã vạch DNA cho họ Lan chi Dendrobium 32 CHƯƠNG VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44 2.1 Vật liệu 44 2.2 Nội dung nghiên cứu 50 2.3 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 51 2.4 Hoá chất – thiết bị 52 2.4.1 Hoá chất 52 2.4.2 Thiết bị 52 2.5 Phương pháp nghiên cứu 52 2.5.1 Hệ thống hóa mẫu vật dựa đặc điểm hình thái 52 2.5.2 Xác định trình tự vùng DNA marker 54 2.5.3 Phân tích mức độ đa dạng di truyền nhóm lan Dendrobium trình tự DNA marker 62 2.5.4 Phân tích khả phân định lồi vùng trình tự 64 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 66 vi 3.1 Mơ tả xây dựng phân nhóm dựa đặc điểm hình thái giống lan Dendrobium 66 3.1.1 Mơ tả đặc điểm hình thái sơ giống lan Dendrobium 66 3.1.2 Phân nhóm dựa vào đặc điểm hình thái 40 mẫu lan Dendrobium 69 3.2 Xây dựng sở liệu mã vạch DNA cho 25 loài Dendrobium nghiên cứu 72 3.3 Kết khảo sát marker tiềm việc xác định loài lan Dendrobium khu vực phía Nam 103 3.4 Ứng dụng hệ thống DNA để khảo sát khả truy nguyên nguồn gốc bố, mẹ tổ hợp lan lai 108 3.4.1 Phân tích khả truy nguyên nguồn gốc bố, mẹ dựa trình tự vùng ITS 108 3.4.2 Phân tích khả truy nguyên nguồn gốc bố, mẹ dựa trình tự vùng matK 110 3.4.3 Phân tích khả truy nguyên nguồn gốc bố, mẹ dựa trình tự vùng trnH-psbA 112 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 114 Kết luận 114 Đề nghị 115 TÀI LIỆU THAM KHẢO 116 CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 128 PHỤ LỤC PL-1 vii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Các vùng hệ thực vật chấp nhận để mô tả phân bố lan bảng trích yếu Hình 1.2 Các dạng thân lan Dendrobium 10 Hình 1.3 Các nhóm lan Dendrobium 11 Hình 1.4 Đặc điểm rễ, thân, giả hành, lá, hoa, hạt chi lan Dendrobium 15 Hình 1.5 Cấu trúc vùng ITS Dendrobium 31 Hình 2.1 Quy trình thực nội dung nghiên cứu 51 Hình 2.2 Quá trình hiệu chỉnh trình tự giải mồi xi SeaView 59 Hình 2.3 Quá trình hiệu chỉnh trình tự giải mồi ngược SeaView 59 Hình 2.4 Quá trình thống trình tự SeaView 60 Hình 2.5 Giao diện trang chủ NCBI 60 Hình 2.6 Giao diện BLAST 61 Hình 3.1 Kết giải phẫu ghi nhận hình ảnh mẫu giống Dendrobium: D anosmum D findlayanum 68 Hình 3.2 Cây phân nhóm dựa 72 đặc điểm hình thái 40 mẫu giống lan Dendrobium 69 Hình 3.3 Kết PCR khuếch đại vùng rbcL với cặp mồi aF/aR 72 Hình 3.4 Kết PCR khuếch đại vùng matK với cặp mồi matK390F/ 1326R 73 Hình 3.5 Kết PCR khuếch đại vùng trnH-psbA với cặp mồi trnH-psbA F/ trnH-psbA R 74 Hình 3.6 Kết PCR khuếch đại vùng ITS với cặp mồi ITS1F/ITS4R 74 Hình 3.7 Kết so sánh trình tự vùng rbcL mẫu 26TT (D venustum) với sở liệu GenBank 78 Hình 3.8 Kết so sánh trình tự vùng ITS mẫu 13TT (D chrysotoxum) với sở liệu GenBank 79 viii Hình 3.9 Kết so sánh trình tự vùng matK mẫu 13TT (D chrysotoxum) với sở liệu GenBank 79 Hình 3.10 Kết so sánh trình tự vùng ITS mẫu 14DT (D farmeri) với sở liệu GenBank 80 Hình 3.11 Kết so sánh trình tự vùng matK mẫu 14DT (D farmeri) với sở liệu GenBank 80 Hình 3.12 Kết so sánh trình tự vùng ITS mẫu 6DT (D anosmum) với sở liệu GenBank 81 Hình 3.13 Kết so sánh trình tự vùng matK mẫu 6DT (D anosmum) với sở liệu GenBank 81 Hình 3.14 Kết so sánh trình tự vùng ITS mẫu 28TT (D primulinum) với sở liệu GenBank 81 Hình 3.15 Kết so sánh trình tự vùng matK mẫu 28TT (D primulinum) với sở liệu GenBank 82 Hình 3.16 Kết so sánh trình tự vùng trnH-psbA mẫu 6TT (D anosmum) với sở liệu GenBank 82 Hình 3.17 Kết align trình tự vùng rbcL lồi D crystallinum, 83 Hình 3.18 Cây phát sinh lồi xây dựng từ trình tự vùng rbcL lồi D crystallinum, D pulchellum D signatum nghiên cứu 84 Hình 3.19 Cây phát sinh lồi dựa trình tự vùng rbcL 36 mẫu lan Dendrobium nghiên cứu 90 trình tự tham khảo với thuật toán Maximum Likelihood 85 Hình 3.20 Cây phát sinh lồi dựa trình tự vùng matK 69 mẫu lan Dendrobium nghiên cứu 91 trình tự tham khảo với thuật toán Maximum Likelihood 87 Hình 3.21 Cây phát sinh lồi dựa trình tự vùng trnH-psbA 58 mẫu lan Dendrobium nghiên cứu 13 trình tự tham khảo với thuật tốn Maximum Likelihood 90 ... dựng sở liệu trình tự gen để nhận diện nhanh xác định mức độ đa dạng nhóm lan Dendrobium khu vực phía Nam? ?? nhằm hướng đến việc xác lập hệ thống mã vạch DNA để định danh phân loại đối tượng lan Dendrobium. .. DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM -NGUYỄN NHƯ HOA NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU TRÌNH TỰ GEN ĐỂ NHẬN DIỆN NHANH VÀ XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ ĐA DẠNG CỦA... chứng đánh giá đa dạng di truyền số loài lan Dendrobium thu thập miền Nam Việt Nam 2.2 Mục tiêu cụ thể Xây dựng liệu trình tự DNA cho số lồi lan Dendrobium khu vực phía Nam dựa trình tự DNA marker