Nghiên Cứu Quá Trình Tạo Hệ Nhũ Tương Nano Tinh Dầu Tiêu Đen Và Ứng Dụng Bảo Quản Thực Phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA LÝ THỊ MINH HIỀN NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TẠO HỆ NHŨ TƯƠNG NANO TINH DẦU TIÊU ĐEN VÀ ỨNG DỤNG BẢO QUẢN THỰC PHẨM Ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số ngành: 62540101 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ TP HỒ CHÍ MINH - NĂM 2022 Cơng trình hồn thành Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM Người hướng dẫn : GS.TS Đống Thị Anh Đào Phản biện độc lập : Phản biện độc lập : Phản biện : Phản biện : Phản biện : GS.TS Nguyễn Cửu Khoa PGS.TS Phạm Văn Hùng PGS.TS Võ Đình Lệ Tâm Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án họp tại: Phòng B4 – 302 Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh Vào lúc 30 phút, ngày 23 tháng 06 năm 2022 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM - Thư viện Đại học Quốc gia Tp.HCM - Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Tạp chí quốc tế T D T Vinh, L T M Hien, and D T A Dao, “Formulation of black pepper (Piper nigrum L.) essential oil nanoemulsion via phase inversion temperature method,” Food Science and Nutrition, vol 8, no 4, pp 1741– 1752, 2020, DOI: 10.1002/fsn3.1422 L T M Hien, and D T A Dao, “Black pepper essential oil nanoemulsions formulation using EPI and PIT methods,” Journal of Food Processing and Preservation, vol 45, pp e15216, 2021, DOI: 10.1111/jfpp.15216 L T M Hien, T D Khoa, and D T A Dao, “Characterization of black pepper essential oil nanoemulsion fabricated by emulsion phase inversion method,” Journal of Food Processing and Preservation, vol 46, pp e16207, 2022, DOI: 10.1111/jfpp.16207 L T M Hien, and D T A Dao, “Antibacterial activity of black pepper essential oil nanoemulsion formulated by emulsion phase inversion method,” Current Research in Nutrition and Food Science, vol 10, no 1, pp 311-320, 2022, DOI: 10.12944/CRNFSJ.10.1.26 MỞ ĐẦU Hiện nay, kỹ thuật nano ứng dụng nhiều lĩnh vực hóa học, vật liệu, hóa dược, mỹ phẩm, thực phẩm, … Kỹ thuật nano giúp tạo vật liệu kích thước nanomet với nhiều đặc tính thuận lợi cho ứng dụng Đối với dược phẩm thực phẩm, kỹ thuật nano giúp phân tán, bảo quản tốt thành phần có hoạt tính sản phẩm, giúp thể hấp thu tốt kích thước phần tử nhỏ dễ thấm qua màng tế bào Trong đó, hệ nhũ tương nano cấu trúc vật lý phù hợp để phân tán hoạt chất khó hịa tan mơi trường nước Sự tạo thành hệ nhũ tương nano dầu nước nhằm bảo quản hoạt chất tinh dầu dễ bay oxy hoá cách bao bọc hợp chất lớp bề mặt phân pha tạo thành từ chất hoạt động bề mặt Các hợp chất tinh dầu thường khó hịa tan nước lại dễ bay nên khó phân tán giữ hoạt tính ổn định ứng dụng Hệ nano tinh dầu có khả phân tán, ổn định hoạt tính tinh dầu thực phẩm đồng thời ngăn cản tách pha theo thời gian Hệ nhũ tương nano tinh dầu nước nghiên cứu nhằm tạo giải pháp ổn định động học hệ môi trường có hàm lượng nước cao giúp kéo dài hiệu hoạt động tinh dầu thực phẩm Hạt tiêu đen loại gia vị phổ biến, tinh dầu từ hạt tiêu đen có giá trị sinh học cao, ứng dụng thực phẩm với vai trị tạo hương vị, chống oxy hố, kháng khuẩn,…nhưng chưa sử dụng rộng rãi để tạo hương vị, bảo quản thực phẩm Trên sở đó, chúng tơi thực đề tài: “NGHIÊN CỨU Q TRÌNH TẠO HỆ NHŨ TƯƠNG NANO TINH DẦU TIÊU ĐEN VÀ ỨNG DỤNG BẢO QUẢN THỰC PHẨM” Trong nghiên cứu này, tinh dầu tiêu đen sử dụng làm hoạt chất hệ nhũ tương nano với kích thước hạt mong muốn bé 100 nm Chế phẩm nano nhũ tương từ tinh dầu tiêu đen tạo thành đảo pha với phương pháp lượng thấp, sử dụng chủ yếu lượng hóa học nội hệ để tạo thành giọt có kích thước nano, giúp hệ nhũ tương nano tinh dầu phân tán tốt môi trường nước thực phẩm, hạn chế bay tinh dầu đồng thời làm tăng hoạt tính kháng khuẩn Phương pháp đảo pha sử dụng có ưu điểm tiêu tốn lượng, quy trình công nghệ đơn giản thiết thực Mục tiêu tổng quát Xây dựng quy trình tạo thành hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen có nguồn gốc từ Việt Nam để đa dạng hoá sản phẩm nano tinh dầu sản phẩm từ tinh dầu tiêu đen nhằm áp dụng thiết thực việc đảm bảo chất lượng thực phẩm nâng cao giá trị kinh tế cho nguồn nguyên liệu Việt Nam Nội dung nghiên cứu - Quá trình tạo hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen phương pháp nhiệt độ đảo pha (PIT – phase inversion temperature method): khảo sát trình tạo giọt nhũ tương thay đổi nhiệt độ cách đột ngột với lượng học gây nên nghich đảo pha, tạo nên thay đổi hình thái kích thước từ macro đến nano giọt tinh dầu tiêu đen chất nhũ hoá Tween 80, tạo hệ nhũ tương nano dầu nước - Quá trình tạo hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu phương pháp điểm đảo pha (EPI – emulsion phase inversion method): thành phần pha liên tục tinh dầu có chứa chất nhũ hoá Tween 80 thay đổi nước bổ sung chậm với tỷ lệ phù hợp tác động lượng nhỏ lượng học, hệ chuyển dần sang khác trạng thái khác từ nhũ tương nước dầu sang trạng thái gel cuối hệ nhũ tương nano dầu nước - Xác định khả kháng khuẩn hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen phương pháp pha loãng nhằm xác định số nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), nồng độ tiêu diệt tối thiểu (MBC) số vi sinh vật thường gặp thực phẩm - Ứng dụng nano tinh dầu tiêu đen trình bảo quản sản phẩm thịt Ý nghĩa khoa học thực tiễn - Ý nghĩa thực tiễn: xác định khả tạo thành nhũ tương nano tinh dầu từ nguồn tinh dầu hạt tiêu đen Đaknông Việt Nam; sản phẩm nano tinh dầu tiêu đen đa dạng sản phẩm tinh dầu tiêu, sử dụng phổ biến, đặc biệt giá trị cảm quan tính kháng khuẩn cho thực phẩm, cụ thể thịt sản phẩm chế biến từ thịt - Ý nghĩa khoa học: xác định phương pháp chế tạo hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu phương pháp lượng thấp kết hợp sử dụng lượng nội hệ để tạo thành giọt nhũ nano nhằm làm tăng khả phân tán giảm thất thoát tinh dầu ứng dụng thực phẩm, đảm bảo hoạt tính hệ nano tinh dầu tiêu Tính đề tài Xác định nguồn tinh dầu tiêu hạt tiêu đen Việt Nam phù hợp công nghệ sản xuất hệ nhũ tương nano tinh dầu phương pháp điểm đảo pha (EPI), tạo nên sản phẩm giọt nhũ tương có kích thước nhỏ, 20 nm, ổn định tính chất khoảng thời gian tháng, có đặc tính sinh học kháng loại vi khuẩn Escherichia coli, Salmonella enterica vi sinh vật hiếu khí phát triển thịt sản phẩm từ thịt CHƯƠNG 1.1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Hệ nhũ tương nano Thuật ngữ nhũ tương nano dùng để định nghĩa hệ nhũ tương có kích thước giọt nhũ tương đối nhỏ (< 200 nm) so với hệ nhũ tương truyền thống ( > 200 nm) Hệ nhũ tương nano có đặc tính khơng ổn định nhiệt động học hệ nhũ tương macro ổn định động học (kinetical stablization) Các thuật ngữ khác mô tả hệ nhũ tương nano hệ nhũ tương mini , “hệ nhũ tương ultrafine”, hay hệ nhũ tương micro “submicron emulsions” Vì kích thước giọt nhỏ nên trọng lực tác động lên giọt phân tán thường thấp Từ hệ nhũ tương nano thường chậm bị tách pha hệ nhũ tương truyền thống Với cân lực, hệ nhũ tương nano bảo quản thời gian dài Hệ nhũ tương nano phù hợp cho trình thẩm thấu nhanh chất có hoạt tính (trong dược hay thực phẩm) kích thước giọt nhỏ diện tích bề mặt tiếp xúc lớn pha phân tán Hệ nhũ tương nano thường mô tả suốt hay mờ khơng có hay tán xạ ánh sáng kích thước giọt nhỏ bước sóng ánh sáng nhìn thấy Thơng thường để tạo thành hệ nhũ tương nano thường cần lượng lớn nồng độ chất nhũ hóa cao nhũ tương macro để giúp phân tán giọt nhũ với đường kính nhỏ đồng ổn định hệ theo thời gian Có hai nhóm phương pháp để tạo thành hệ nhũ nano: nhóm phương pháp lượng cao (áp suất cao, siêu âm cường độ cao, đồng hoá tốc độ cao,…) nhóm phương pháp lượng thấp (tạo nhũ ngẫu nhiên, chuyển pha nhiệt độ, đảo pha thay đổi tỷ lệ pha,…) 1.2 Tinh dầu tiêu đen hoạt tính sinh học Tiêu đen loại gia vị dùng phổ biến thực phẩm nhiều quốc gia giới Tiêu trồng khu vực Nam Á Đông Nam Á Ấn Độ, Indonesia, Malaysia, Thái Lan, Campuchia,…Ngoài khu vực Châu Á vùng canh tác tiêu bao gồm Brazil, Mexico,… Tiêu có tên khoa học Piper nigrum L., loại thân leo Giá trị tiêu đen tuỳ thuộc hàm lượng piperine tinh dầu Hàm lượng tinh dầu tiêu thường khoảng 2,0 – 7,0% hàm lượng piperine dao động từ 2,0 – 7,4% Thành phần tinh dầu tiêu bao gồm số nhóm chất sau: monoterpene dẫn xuất; sesquiterpene dẫn xuất hợp chất hàm lượng thấp khác Trong số nghiên cứu gần đây, tinh dầu tiêu đen tự hay hệ nhũ tương hệ nhũ tương nano minh chứng có hoạt tính sinh học ứng dụng thực phẩm dược phẩm Quan trọng khả kháng khuẩn tinh dầu tiêu đen thể loại vi sinh vật thực phẩm E coli, Salmonella, Bacillus, Candida, Aspergillus,… Cơ chế kháng khuẩn hợp chất tinh dầu tiêu đen αpinene, β-pinene, 3-carene, limonene caryophyllene ngày quan tâm nghiên cứu nhiều CHƯƠNG 2.1 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu Tinh dầu tiêu đen mua từ nhà cung cấp Cơng ty An Phong, Daknong Hóa chất: Tween 20, Tween 80, DMSO cung cấp Bio Basic, Canada; Tween 40, Tween 60, DPPH, thuốc nhuộm Tetrazolium Chloride (TTC) cung cấp Sigma-Aldrich Môi trường nuôi cấy vi sinh: Trypton Soy Agar (TSA), Trypton Soy Broth (TSB), Nutrient agar (NA), Nutrient Broth (NB), Endo agar (EA) Xylose lysine deoxycholate agar (XLDA) cung cấp HiMedia Chủng vi sinh vật sử dụng gồm: Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Salmonella enterica ATCC 14028 Staphylococcus aureus ATCC 25823 Nguyên liệu thịt nạc đùi heo, thịt ức gà thịt bị xay dùng thí nghiệm mua từ cửa hàng thịt VISSAN ngày tiến hành thí nghiệm Mẫu thịt mang bảo quản điều kiện lạnh (5oC) không trước tiến hành thí nghiệm 2.2 Các quy trình tạo hệ nhũ tương nano 2.2.1 Quy trình tạo thành hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen phương pháp nhiệt độ đảo pha (PIT) Trong trình tạo hệ nhũ tương tinh dầu tiêu đen phương pháp nhiệt độ đảo pha (PIT – phase inversion temperature), lượng tinh dầu tiêu đen xác định trộn vào chất nhũ hóa với tỷ lệ phù hợp tạo thành hỗn hợp đồng cách khuấy từ tốc độ 800 vịng/phút 10 phút Q trình khuấy đảo thực liên tục suốt q trình tạo mẫu Sau đó, hệ nhũ tương macro dầu nước tạo thành cách cho từ từ hỗn hợp tinh dầu – chất nhũ hoá vào cốc chứa nước cất định lượng sẵn, cho tổng lượng mẫu khoảng 40 – 100 mL lần tạo mẫu Trong trình tạo hệ nhũ tương macro, để tăng khả phân tán pha dầu nước, hỗn hợp trì khuấy kết hợp gia nhiệt nhiệt độ 50oC Hệ nhũ tương macro tiếp tục gia nhiệt lên đến nhiệt độ 70 – 80oC với tốc độ gia nhiệt 2oC/ phút Khi hỗn hợp đạt đến nhiệt độ đảo pha (PIT), hỗn hợp giảm dần độ đục trở nên suốt Tiếp tục trình gia nhiệt để nhiệt độ hỗn hợp cao nhiệt độ điểm đảo pha khoảng - 5oC tiến hành làm lạnh nhanh Hỗn hợp làm lạnh nhanh đến 25oC cách ngâm toàn cốc chứa hỗn hợp vào bể nước lạnh nhiệt độ 5oC Quá trình làm lạnh nhanh thực thiết bị khuấy từ, hỗn hợp khuấy liên tục 30 phút để tăng hiệu trình trao đổi nhiệt giúp hệ đồng Mẫu sau tạo thành giữ ổn định 24 trước tiến hành phân tích cần thiết 2.2.2 Quy trình tạo thành hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen phương pháp điểm đảo pha (EPI) Phương pháp điểm đảo pha (Emulsion phase inversion– EPI) phương pháp tạo nhũ tương nano lượng thấp dựa đảo pha hệ nhiệt độ cố định, thường nhiệt độ phòng Sự đảo pha thực nhờ thay đổi tỷ lệ thành phần pha dầu nước hệ nhũ Ở nghiên cứu này, trình tạo nhũ nano tinh dầu tiêu đen phương pháp điểm đảo pha thực qua bước sau Chất nhũ hoá tinh dầu tiêu đen định lượng phù hợp (tuỳ thí nghiệm) khuấy trộn thiết bị khuấy từ để tạo thành hỗn hợp đồng Tốc độ khuấy trì ổn định 800 vịng/ phút nhằm mục đích phân tán thành phần Nước cất định lượng trước thêm vào hỗn hợp chất nhũ hoá – tinh dầu cách chuẩn độ với tốc độ ổn định từ 0,5 – 1,0 mL/ phút hết Trong trình bổ sung nước cất, hệ thay đổi qua nhiều trạng thái tuỳ thuộc hàm lượng nước thêm vào hệ giai đoạn Khi hàm lượng nước đủ lớn, hệ hoàn toàn đồng trạng thái nhũ tương nano D/N với đặc điểm không màu suốt hay mờ đục 2.3.3.3 Thí nghiệm 8: So sánh ổn định theo thời gian mẫu nano tinh dầu tiêu đen nhiệt độ bảo quản thay đổi Mẫu nhũ tương nano PIT EPI lưu điều kiện nhiệt độ: 30oC 5oC thời gian 28 ngày Trong thời gian theo dõi mẫu đánh giá tiêu độ đục (cm-1), kích thước giọt nhũ (nm) 2.3.3.4 Thí nghiệm 9: So sánh ổn định mẫu nano tinh dầu tiêu đen tác động trình ly tâm Mẫu nhũ tương nano PIT EPI đem ly tâm tốc độ 825xg; 1.467xg hay 2.292xg (tương ứng với tốc độ điều chỉnh thiết bị 3.000; 4.000 5.000 vòng/ phút) thời gian 10 phút Các mẫu sau ly tâm đo độ đục (cm-1), kích thước giọt (nm) số đa phân tán để đánh giá biến đối đặc điểm hố lý 2.3.3.5 Thí nghiệm 10: So sánh hiệu mang tinh dầu mẫu nano tinh dầu tiêu đen Mẫu nhũ tương nano PIT EPI xác định hiệu suất mang tinh dầu chứa mẫu thời điểm 24 giờ, tuần, tuần, tuần tuần sau tạo thành phương pháp chưng cất lôi nước 2.3.4 2.3.4.1 Phần 4: Khảo sát q trình hồn thiện hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen tạo thành phương pháp điểm đảo pha (EPI) Thí nghiệm 11: Khảo sát ảnh hưởng điều kiện ổn định q trình lạnh đơng – rã đơng đến hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen Mẫu nano tinh dầu EPI giữ ổn định 24 điều kiện: 30oC -15oC Mẫu ổn định -15oC rã đơng hồn tồn nhiệt độ phịng trước phân tích Các tiêu đánh giá: độ đục mẫu (cm-1), kích thước giọt (nm), số đa phân tán, đặc tính nhiệt DSC – TGA, phân tích thành phần hố học GC – MS xác định hoạt tính chống oxy hố với thơng số IC50 phản ứng với gốc tự DPPH Sau đó, mẫu tiếp tục theo dõi thay đổi theo thời gian đánh giá mức độ ổn định pha loãng với nước cất tỷ lệ 1:10; 1:20; 1:30; 1:40 1:50 10 2.3.4.2 Thí nghiệm 12: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lạnh đông đến hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hồn tồn yếu tố: Nhiệt độ ổn định mẫu -15; -20; -25 oC (Bảng 2.7) Các tiêu đánh giá: độ đục mẫu, kích thước giọt số đa phân tán 2.3.4.3 Thí nghiệm 13: Khảo sát ảnh hưởng thời gian lạnh đông đến hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn yếu tố: Thời gian ổn định mẫu -15 (oC): – ngày (Bảng 2.8) Các tiêu đánh giá: độ đục mẫu, kích thước giọt số đa phân tán 2.3.4.4 Thí nghiệm 14: Khảo sát ảnh hưởng loại chất nhũ hoá Tween đến hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hồn tồn yếu tố: Loại chất nhũ hố sử dụng Tween 20 – Tween 40 – Tween 60 – Tween 80 (Bảng 2.9) Chỉ tiêu đánh giá: độ đục mẫu, kích thước giọt số đa phân tán Ngồi ra, mẫu gel tạo thành giai đoạn trung gian đánh giá cảm quan khảo sát hình thái vi cấu trúc với kỹ thuật SEM 2.3.4.5 Thí nghiệm 15: Khảo sát số tính chất hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen hoàn chỉnh thời gian lưu mẫu Trong tháng lưu mẫu, mẫu phân tích kích thước giọt tháng đánh giá khả kháng oxy hoá thời điểm sau tháng sau tháng Ngoài ra, mẫu lưu sau tháng phân tích thành phần hố học phương pháp GC – MS 2.3.5 2.3.5.1 Phần 5: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn ứng dụng hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen trình bảo quản thịt Thí nghiệm 16: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen phương pháp pha lỗng Trong thí nghiệm này, chủng vi khuẩn (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica Staphylococcus aureus) sử dụng để đánh giá khả kháng khuẩn hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen 11 phương pháp pha loãng xác định MIC MBC Ngoài ra, mẫu tinh dầu tiêu đen tự kháng sinh amoxicillin dùng mẫu đối chứng 2.3.5.2 Thí nghiệm 17: Khảo sát hoạt tính ức chế vi khuẩn hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen thịt heo gây nhiễm Mẫu nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen tiếp tục đánh giá hoạt tính kháng khuẩn thịt heo gây nhiễm hai chủng vi khuẩn E coli S enterica 2.3.5.3 Thí nghiệm 18: Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen đến thịt heo – thịt gà bảo quản lạnh Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hồn tồn yếu tố: Hàm lượng mẫu nano tinh dầu tiêu đen bổ sung 0; 1; (% v/w) (Bảng 2.11) Thí nghiệm tiến hành riêng loại thịt: thịt gà, thịt heo 2.3.5.4 Thí nghiệm 19: Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đến sản phẩm thịt bò xay bảo quản lạnh Thí nghiệm yếu tố bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Yếu tố: Hàm lượng mẫu nano tinh dầu tiêu đen 0; 0,5; 1,0; 2,0; 5;0 (%) (Bảng 2.12) 12 CHƯƠNG 3.1 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN Thành phần hoá học tinh dầu tiêu đen Tổng 29 chất thành phần tìm thấy mẫu tinh dầu tiêu đen nguyên liệu sử dụng nghiên cứu Trong hợp chất phát được, có chất chiếm hàm lượng cao tạo thành đỉnh lớn sắc ký đồ thời gian lưu (phút): 7,27; 9,10; 10,82; 11,82; 29,08, cụ thể hợp chất α-pinene, βpinene, 3-carene, D-limonene caryophyllene Tổng hàm lượng hợp chất chiếm đến 79,11% tổng mẫu tinh dầu Các hợp chất có hàm lượng thuộc nhóm trung bình (1-5%) gồm có hợp chất: β-myrcene, α-phellandrene, p-cimene, δ-elemene, α-copaene, humulene, δcadinene, caryophyllene oxide Với tổng hàm lượng chất nhóm 15,12% Cịn lại hợp chất tìm thấy với hàm lượng thấp ( 60% ổn định với thông số SOR 2,0 2,5 Tuy nhiên, để giảm thiểu hàm lượng chất nhũ hoá sử dụng, SOR 2,0 chọn lựa để thực thí nghiệm sau 3.4 Phần 3: Kết so sánh tính chất hệ nhũ tương nano tạo thành hai phương pháp đảo pha PIT EPI 3.4.1 3.4.1.1 Thí nghiệm 6: Kết so sánh đặc điểm hố học hình thái hệ nhũ tương nano tạo thành phương pháp đảo pha Thành phần hoá học hệ nhũ tương tạo thành phương pháp chuyển pha Kết phân tích GC – MS cho thấy hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen tạo thành hai phương pháp đảo pha bảo tồn hợp chất quan trọng chứa hàm lượng cao đảm bảo hoạt tính sinh học hệ Tuy nhiên mẫu nhũ tương nano PIT số chất có hàm lượng thấp thất q trình khuấy gia nhiệt đồng thời tạo mẫu 15 Với kết phân tích FT-IR cho thấy tồn hầu hết nhóm chức Tween 80 tinh dầu tiêu đen hệ nhũ tương nano tạo thành phương pháp đảo pha (EPI PIT) Ngoài ra, trì có mặt nhóm chức cho thấy thành phần quan trọng tinh dầu không trình tạo thành hệ nhũ tương nano dù q trình thực có hay khơng có gia nhiệt Như đảm bảo hệ tạo thành trì hoạt tính sinh học so với tinh dầu nguyên liệu 3.4.1.2 Hình thái vi cấu trúc hệ nhũ tương nano tạo thành phương pháp đảo pha Với mẫu nhũ tương nano PIT, hình thái cho thấy giọt nhũ khơng có cấu trúc hình cầu, có hình dạng góc cạnh với kích thước khơng đồng với kích thước giọt nhìn dao động từ 100 nm đến 500 nm Giọt nhũ tương nano EPI có cấu trúc hình cầu đồng với kích thước bé 50 nm cho hầu hết giọt Theo kết hình thái vi cấu trúc giọt nhũ, hệ nhũ tương EPI phù hợp để sử dụng bảo quản thời gian dài 3.4.2 Thí nghiệm 7: Kết so sánh ổn định tác động nhiệt độ cao đến mẫu nano tinh dầu tiêu đen Như vậy, hai mẫu nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen tạo thành phương pháp đảo pha cho thấy ổn định sau chu kỳ nâng hạ nhiệt từ 100oC xuống nhiệt độ phòng Các mẫu bắt đầu ổn định thể qua thay đổi độ đục sau chu kỳ tăng số kích thước giọt trung bình với số đa phân tán rõ rệt sau chu kỳ gia nhiệt lần Trong đó, mức độ ổn định nhiệt sau chu kỳ mẫu EPI nhiều so với mẫu PIT Và sau chu kỳ xử lý nhiệt hai mẫu hoàn toàn ổn định thể qua tách pha 3.4.3 Thí nghiệm 8: Kết so sánh ổn định theo thời gian mẫu nano tinh dầu tiêu đen nhiệt độ bảo quản thay đổi 16 Hình 3.2 Sự phân bố kích thước giọt nhũ tương sau tuần lưu mẫu 30oC Kích thước giọt mẫu PIT tăng cao (193,3 nm) với số đa phân tán 0,670 Trong mẫu EPI sau tuần bảo quản nhiệt độ phịng kích thước giọt tăng đến 57,7 nm số đa phân tán 0,568 Điều cho thấy mẫu EPI đạt trạng thái ổn định hệ nhũ tương nano sau tuần 3.4.4 Thí nghiệm 9: Kết so sánh ổn định mẫu nano tinh dầu tiêu đen tác động trình ly tâm Cả hai hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen tạo thành ổn định điều kiện ly tâm 3000 4000 vòng/phút thời gian – 10 phút thí nghiệm mà khơng nhận thấy tách pha 3.4.5 Thí nghiệm 10: Kết khảo sát hiệu mang tinh dầu mẫu nano tinh dầu tiêu đen Hiệu suất mang tinh dầu mẫu xác định phương pháp chưng cất lôi nước tương ứng khoảng 70-75% hệ nhũ tương EPI 45-50% hệ nhũ tương PIT tuần khảo sát 3.5 Phần 4: Kết khảo sát trình hồn thiện hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen tạo thành phương pháp điểm đảo pha (EPI) 3.5.1 Thí nghiệm 11: Ảnh hưởng điều kiện ổn định q trình lạnh đơng – rã đơng đến hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen Các mẫu nano tinh dầu tiêu đen ổn định 30oC -15oC cho thấy đồ thị nhiệt động học hoàn toàn khác biệt so với tinh dầu Tween 80 Các đỉnh thu nhiệt 17 xuất 131,14oC (mẫu đối chứng), đỉnh thu nhiệt mẫu trải qua lạnh đông – rã đông 113,10oC Các nhiệt độ thể bay nước minh chứng đồ thị TGA với giảm khối lượng sau đỉnh thu nhiệt tương ứng 59,55% 71,39% Sự tăng nhiệt độ sôi nước cao 100oC cho thấy có phân tán tốt pha dầu hệ Trong thời gian lưu mẫu tuần, mẫu đối chứng - mẫu ổn định nhiệt độ phòng bắt đầu tách pha quan sát tuần thứ thể thành hệ ổn định với số đa phân tán cao tuần (PdI = 3,088) Trong mẫu trải qua q trình lạnh đơng - rã đơng trì trạng thái ổn định (Z < 20 nm PdI < 0,7) sau thời gian tuần Hai mẫu phân tích GC – MS sau tháng lưu mẫu Kết cho thấy hợp chất quan trọng trì với hàm lượng cao Tuy nhiên gia tăng nhiều dẫn xuất caryophyllene mẫu đối chứng cho thấy mẫu trải qua lạnh đông ổn định chất hoá học Khả kháng oxy hoá tinh dầu tự mẫu nano thí nghiệm cho thấy hoạt tính kháng khơng cao Tuy nhiên mẫu nano trải qua lạnh đông bảo tồn thành phần hoá học tốt nên hoạt tính cao tinh dầu mẫu đối chứng với IC50 = 18,99 mg/mL so với 20,84 20,98 mg/mL Ngoài ra, ổn định mẫu nano tinh dầu trải qua đông lạnh – rã đông đánh giá Kết cho thấy sau pha loãng, tỷ lệ pha loãng với hàm lượng nước cao (1:40 1:50) có gia tăng PdI, mẫu dần đồng nhất, nhiên kích thước giọt trung bình bé 20 nm 3.5.2 Thí nghiệm 12: Ảnh hưởng nhiệt độ lạnh đông đến hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen Kết phân tích số liệu cho thấy khơng có khác biệt nghiệm thức nhiệt độ đông lạnh khác Trong đó, kích thước giọt nhũ tương 20 nm số đa phân tán dao động từ 0,2 đến 0,6 Tuy nhiên, để tiết kiệm lượng sử dụng, nhiệt độ -15oC chọn lựa cho trình xử lý mẫu ứng dụng thành thơng số q trình thí nghiệm sau 18 3.5.3 Thí nghiệm 13: Ảnh hưởng thời gian lạnh đông đến hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen Kết phân tích cho thấy, thời gian lạnh đơng khơng ảnh hưởng độ đục kích thước mẫu, nhiên tạo khác biệt số đa phân tán Trong số đa phân tán mẫu đơng lạnh từ đến ngày có giá trị thấp từ bé 0,2 Thời gian đông lạnh kéo dài làm thay đổi số đa phân tán Như vậy, thời gian đông lạnh hiệu để ổn định hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen 15oC ngày, vừa đảm bảo tính chất ổn định vừa tiết kiệm lượng sử dụng q trình làm lạnh 3.5.4 Thí nghiệm 14: Ảnh hưởng loại chất nhũ hố khơng ion đến hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen Kết hợp quan sát khác biệt trạng thái gel trạng thái nhũ tương tạo thành với kết đo đạc kích thước giọt, Tween 60 Tween 80 cho hệ nano có kích thước giọt bé (24,60 nm 19,57 nm) số đa phân tán thấp Ngoài ra, Tween 80 tạo thành hệ với chất lượng ổn định độ lệch chuẩn kích thước giọt lần lặp lại thấp (SD=0,85) Do đó, Tween 80 chất hoạt động bề mặt phù hợp để tạo thành hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen điều kiện thí nghiệm đề tài 3.5.5 Thí nghiệm 15: Kết khảo sát hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen hoàn chỉnh thời gian lưu mẫu Số liệu kích thước giọt nhũ mẫu nano tinh dầu tiêu thời gian tháng theo thời gian khơng có thay đổi đáng kể (< 20 nm) Tuy nhiên, số đa phân tán có khác biệt tăng từ 0,087 đến 0,608 Chỉ số bé 0,7, nên hệ đánh giá ổn định sau tháng Sau tháng lưu mẫu, thành phần hố học có biến đổi nhẹ nhiên thành phần quan trọng chiếm hàm lượng cao với tạo thành ghi nhận dẫn xuất từ caryophylene caryophyllene oxide (5%) caryophylladienol II (0,15%) 19 Chỉ số IC50 thể hoạt tính kháng oxy hố tăng lên theo thời gian cho thấy giảm hoạt tính hệ Cụ thể tăng từ 18,99 mg/mL tăng lên 22,25 mg/mL (sau tháng) 28,77 mg/mL (sau tháng) 3.6 Phần 5: Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn ứng dụng hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen trình bảo quản thịt 3.6.1 Thí nghiệm 16: Hoạt tính kháng khuẩn hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen dánh giá phương pháp pha loãng Với số MIC MBC thu được, mẫu nhũ tương nano tinh dầu thể hoạt tính kháng tốt so với tinh dầu tự loại vi khuẩn khảo sát Trong đó, khả kháng tốt nano tinh dầu tiêu đen E coli S enterica, sau đến P aeruginosa, ức chế với S aureus Ngoài ra, mẫu đối chứng dương amoxicillin thể hoạt tính tốt tương đương mẫu nano E coli S enterica 3.6.2 Thí nghiệm 17: Hoạt tính ức chế vi khuẩn hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen thịt heo gây nhiễm Dựa số lượng khuẩn lạc xác định được, mẫu thịt heo nhúng dung dịch nano có khả hạn chế phát triển E coli gây nhiễm ngày bảo quản lạnh so với mẫu đối chứng không nhúng Tương tự phương pháp thực hiện, dung dịch nano tinh dầu cho thấy hiệu ức chế S enterica gây nhiễm thịt heo tốt có khác biệt suốt ngày bảo quản lạnh so với mẫu đối chứng 3.6.3 Thí nghiệm 18: Ảnh hưởng hàm lượng nano tinh dầu tiêu đen đến thịt ướp gia vị bảo quản lạnh Với mẫu thịt gà, hàm lượng nano bổ sung mẫu thịt gà tăng từ 1% đến 2% mật độ vi sinh vật hiếu khí giảm có ý nghĩa thống kê Và sau ngày bảo quản, mật độ vi sinh vật hiếu khí mẫu thịt gà có bổ sung nano tinh dầu tiêu đen có mật độ bé Log CFU/g nghĩa bé 105 CFU/g, mẫu thịt ướp gia vị đối chứng mật độ vi sinh vật tăng nhanh vượt Log CFU/g ngày thứ bảo quản 20 Với mẫu thịt heo khơng ướp nano tinh dầu tiêu đen, có gia tăng mật độ vi sinh vật hiếu khí nhanh đạt 5,1 Log CFU/g từ ngày thứ tiếp tục tăng đến 5,17 Log CFU/g ngày thứ Với mẫu chứa nano tinh dầu, tốc độ tăng mật độ vi sinh vật chậm hơn, sau ngày mật độ bé 5,0 Log CFU/g So sánh nghiệm thức chứa nano tinh dầu, có khác biệt mật độ vi sinh vật ngày hai hàm lượng nano tinh dầu Tuy nhiên, ngày khơng có khác biệt mật độ vi sinh vật hiếu khí bổ sung 1% hay 2% nano tinh dầu thịt heo Như vậy, bổ sung nano tinh dầu tiêu đen trực tiếp vào thịt heo – thịt gà hàm lượng khảo sát có hiệu ức chế phát triển vi sinh vật hiếu khí so với mẫu đối chứng suốt ngày bảo quản lạnh Khi so sánh mức độ nhiễm vi sinh vật hiếu khí với tiêu chuẩn thịt tươi thịt bảo quản mát (TCVN 70462009; TCVN 1212429-1:2018; TCVN 12429-3:2021) sau ngày bảo quản, thịt heo gà thí nghiệm có chứa nano tinh dầu tiêu đen có mật độ đạt yêu cầu (< 105 CFU/g) 3.6.4 Thí nghiệm 19: Ảnh hưởng hàm lượng nano tinh dầu tiêu đến sản phẩm thịt bị xay Trong thí nghiệm này, gia tăng hàm lượng nano tinh dầu bổ sung không làm giảm mật độ vi sinh vật hiếu khí mà cịn ổn định pH thịt so với mẫu đối chứng Sự khác biệt nghiệm thức thể thời điểm đánh giá với giá trị P < 0,05 Mật độ vi sinh vật hiếu khí mẫu đối chứng tăng nhanh từ 6,22 lên 9,33 LogCFU/g từ ngày đến ngày thời gian bảo quản Với nồng độ nano nhũ tương bổ sung 2% 5%, mật độ vi sinh vật ức chế tốt hơn, ngày tăng đến 7,3 6,2 LogCFU/g Ngồi ra, kiểm sốt vi sinh vật nên biến đổi thành phần hoá học mẫu giảm thiểu số pH mẫu thịt trì mức 5,3 5,4 không giảm thấp xuống đến 4,9 mẫu đối chứng Ngoài ra, so sánh với TCVN 7046-2009 cho thịt tươi xay, mẫu thịt đạt chất lượng mật độ vi sinh vật hiếu khí bé Log CFU/g khơng thấp pH 5,5 điều kiện bảo quản thí nghiệm, nghiệm thức chứa 2% 21 nano tinh dầu bảo quản thịt ngày nghiệm thức 5% nano tinh dầu bảo quản thịt đạt chất lượng vòng ngày CHƯƠNG 4.1 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ Kết luận Nghiên cứu xác định phương pháp điểm đảo pha (EPI) phương pháp phù hợp cho trình tạo hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen Đây phương pháp lượng thấp, giúp tiết kiệm lượng trình tạo thành đồng thời đảm bảo ổn định hệ nhũ tương nano thành phần hoạt chất tinh dầu suốt thời gian lưu mẫu tháng Các thông số hàm lượng thành phần phù hợp hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen bao gồm: 10% tinh dầu tiêu đen, 20% chất nhũ hoá Tween 80 70% pha nước Các thơng số khác q trình giúp đảm bảo hiệu tạo nhũ tương nano lưu lượng nước bổ sung vào pha phân tán thích hợp mL/phút kết hợp tốc độ khuấy 800 vịng/ phút Ngồi ra, q trình lạnh đơng mẫu nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen -15oC 24 sau rã đơng nhiệt độ phịng cho thấy có hiệu làm tăng độ ổn định hoá lý mẫu thể qua việc làm giảm kích thước giọt nhũ xuống bé 20 nm giảm số đa phân tán xuống thấp 0,1 Mặt khác, nghiên cứu cho thấy phương pháp điểm đảo pha (EPI) cho hiệu tạo nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen tốt phương pháp nhiệt độ đảo pha (PIT) tiêu chí ổn định tính chất hố lý, đảm bảo hình thái dạng cầu đồng giọt phân tán bảo tồn tốt tinh dầu tiêu đen hợp chất dễ bay tinh dầu tiêu đen Với tính chất hố lý ổn định, hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen mở tiềm ứng dụng công nghiệp thực phẩm Hoạt tính kháng khuẩn 22 hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen kiểm chứng nghiên cứu Kết cho thấy, hệ có khả ức chế tốt hai loại vi khuẩn gây ngộ độc thịt Escherichia coli Salmonella enterica mơi trường tổng hợp thí nghiệm pha lỗng nồng độ xác định MIC MBC môi trường thịt heo với thí nghiệm gây nhiễm vi khuẩn xác định khả ức chế mẫu nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen Sau đó, hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen sử dụng chất bảo quản bổ sung vào thịt tươi (heo, gà, bò xay) kết thể khả quan Cụ thể tất mẫu thịt có bổ sung nano tinh dầu tiêu đen sau từ đến ngày bảo quản lạnh có tiêu vi sinh vật hiếu khí thấp so với mẫu đối chứng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn cho sản phẩm thịt theo TCVN 7046:2009 (cho thịt tươi) TCVN 12429-1:2018 (cho thịt heo mát) TCVN 12429-3:2021 (cho thịt gia cầm mát) Hơn nữa, hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen thể khả chống oxy hoá với giá trị IC50 18,99 mg/mL xác định phương pháp ức chế gốc tự DPPH Như vậy, hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen tạo thành vừa có ổn định cao, vừa có khả thể tốt hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu tiêu đen sản phẩm thực phẩm Từ tạo tiềm lực phát triển ứng dụng thực tiễn nâng cao giá trị sử dụng cho tinh dầu từ nguồn nông sản tiêu đen Việt Nam 4.2 Kiến nghị Để tiếp tục hoàn thiện mở rộng nghiên cứu, khảo sát thêm số nội dung sau: - Nghiên cứu khả ứng dụng hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen nhóm sản phẩm rau củ sốt Nghiên cứu tính kháng nấm loại vi khuẩn 23 hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen thực phẩm khác để có minh chứng rõ hoạt tính sinh học mở rộng ứng dụng nhiều dạng thực phẩm khác - Nghiên cứu thêm khả sử dụng phối hợp loại chất nhũ hóa polymer chất hoạt động bề mặt có tính chất khác (HLB, thông số hoạt động bề mặt, ) để tạo thành hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen - Đánh giá thêm đặc tính hệ khả bao phủ tinh dầu lớp chất nhũ hóa, điện tích bề mặt giọt, chế q trình chín Oswald, khả phân tán tinh dầu từ hệ vào thực phẩm, để hồn thiện tính chất hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen 24 ... DẦU TIÊU ĐEN VÀ ỨNG DỤNG BẢO QUẢN THỰC PHẨM” Trong nghiên cứu này, tinh dầu tiêu đen sử dụng làm hoạt chất hệ nhũ tương nano với kích thước hạt mong muốn bé 100 nm Chế phẩm nano nhũ tương từ tinh. .. thực phẩm - Ứng dụng nano tinh dầu tiêu đen trình bảo quản sản phẩm thịt Ý nghĩa khoa học thực tiễn - Ý nghĩa thực tiễn: xác định khả tạo thành nhũ tương nano tinh dầu từ nguồn tinh dầu hạt tiêu. .. dựng quy trình tạo thành hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen có nguồn gốc từ Việt Nam để đa dạng hoá sản phẩm nano tinh dầu sản phẩm từ tinh dầu tiêu đen nhằm áp dụng thiết thực việc đảm bảo chất