Nghiên cứu phương pháp tạo hạt nano chitosan định hướng ứng dụng bảo quản thực phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN THỊ KIM THOA NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP TẠO HẠT NANO CHITOSAN ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG BẢO QUẢN THỰC PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Mã số: 60 54 01 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 06 năm 2016 CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM Cán hƣớng dẫn khoa học: TS.Trần Bích Lam Cán chấm nhận xét 1:TS Hoàng Kim Anh Cán chấm nhận xét 2: TS Phan Ngọc Hòa Luận văn thạc sĩ đƣợc bảo vệ Trƣờng Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 11 tháng 07 năm 2016 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: GS.TS Lê Văn Việt Mẫn TS Hồng Kim Anh TS Phan Ngọc Hịa TS Lê Trung Thiên TS Tôn Nữ Minh Nguyệt Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trƣởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn đƣợc sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƢỞNG KHOA GS.TS Lê Văn Việt Mẫn GS.TS Phan Thanh Sơn Nam ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập – Tự – Hạnh phúc - NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Nguyễn Thị Kim Thoa MSHV: 13111030 Ngày sinh: 18/09/1985 Nơi sinh: Đồng Nai Chuyên ngành: CN Thực Phẩm Mã số: 60 54 01 01 I Tên đề tài NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP TẠO HẠT NANO CHITOSAN ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG BẢO QUẢN THỤC PHẨM II Nhiệm vụ nội dung Nhiệm vụ  Khảo sát phƣơng pháp tạo hạt nano chitosan phƣơng pháp tạo gel ion với STPP, dƣới hỗ trợ sóng siêu âm kết hợp với đồng hóa Nội dung  Khảo sát điều kiện tạo hạt nano chitosan phƣơng pháp tạo gel với STPP dƣới hỗ trợ sóng siêu âm, sóng siêu âm kết hợp đồng hóa  Xác định điều kiện tạo hạt nano chitosan thích hợp nhằm thu đƣợc kích thƣớc hạt nhỏ theo phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm  Đánh giá ảnh hƣởng nguyên liệu đến khả tạo hạt nano chitosan  Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm dung dịch nano chitosan điều kiện in vitro III Ngày giao nhiệm vụ 11/01/2016 IV Ngày hoàn thành nhiệm vụ 17/06/2016 V Cán hƣớng dẫn TS Trần Bích Lam Tp Hồ Chí Minh, ngày 28 tháng 06 năm 2016 Cán hƣớng dẫn TS Trần Bích Lam Chủ nhiệm môn GS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trƣởng khoa Kỹ Thuật Hóa Học GS.TS Phan Thanh Sơn Nam LỜI CẢM ƠN Ngày đƣợc tin đậu cao học BK ngày vui, mở đầu cho chặng đƣờng với nhiều hy vọng tƣơng lai tốt đẹp hơn, nhƣng để đến đƣợc hội trƣờng A5, thật đƣờng chơng gai Đã có lúc mệt mỏi cực độ với báo cáo, kỳ thi, có lúc tơi muốn bỏ thí nghiệm làm hồi mà kết mong muốn chƣa thấy đâu Những lúc nhƣ vậy, gia đình, bạn bè, thầy đặc biệt Cơ hƣớng dẫn tơi TS Trần Bích Lam bên tơi động viên, khuyến khích tơi tìm giải pháp để vƣợt qua khó khăn, truyền cho tơi đam mê nghiên cứu Và tơi có ngƣời bạn tốt, cảm nhận đƣợc lịng Thầy Cơ giành cho học trị mình, điều thật đáng trân trọng quý giá Qua lời cảm ơn này, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Cơ TS.Trần Bích Lam, ngƣời tận tình hƣớng dẫn tơi suốt q trình thực luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn tập thể quý Thầy, Cô thuộc môn công nghệ thực phẩm, Đại học Bách Khoa Tp.HCM, ngƣời nhiệt tình hỗ trợ để tơi tiến hành tốt nhiệm vụ nghiên cứu luận văn Sau cùng, xin cảm ơn anh, chị bạn học phịng thí nghiệm công nghệ thực phẩm, ngƣời bạn đồng hành thời gian thực luận văn cao học trƣờng Đại học Bách Khoa Tp.HCM Tp Hồ Chí Minh, ngày 11 tháng 07 năm 2016 Sinh viên thực NGUYỄN THỊ KIM THOA HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa Luận văn thạc sĩ iii ABSTRACT In this thesis, the research work mainly forcused on the preparation of nano-scale chitosan, and its application in food preservation Chitosan is a natural polysaccharide prepared by the N-deacetylation of chitin It has been widely used in food and bioengineering industries, including the encapsulation of active food ingredients, in enzyme immobilization, and as a carrier for controlled drug delivery, due to its significant biological and chemical properties such as biodegradability, biocompatibility, bioactivity, and polycationicity The method to prepare nano chitosan by ionic gelation using sodium tripolyphotphate as cross-linking agent with assistance of ultrasound and high pressure with Mw: 57.7kDa and DDA: 94.3% Studied the influence of a number of factors such as: pH, ratios of components, sonication power and time, molecular weight and degree acetylation of material to optimum nanosacle According to the results of experimental planning with pH:4, CS/STPP; 4:1, sonication time: 288s, power: 5.85W/g, will have nanosize optimum is 165.5nm Another material with Mw: 48kDa, DDA: 54.6%, in optimize condition the nanozise is 228.4nm In the in vitro experiment, nanoparticles chitosan 165.5nm showed the best inhibitory effect growth of C acutatum fungus HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa Luận văn thạc sĩ iv TÓM TẮT LUẬN VĂN Chitosan nguyên liệu phổ biến tự nhiên, nano chitosan với kích thƣớc nano, có ƣu điểm vƣợt trội đƣợc ứng dụng nhiều lĩnh vực Trong lĩnh vực bảo quản thực phẩm, nhờ tính an tồn với ngƣời sử dụng thân thiện với môi trƣờng, nano chitosan đƣợc quan tâm Nghiên cứu đề cập tới trình tạo hạt nano chitosan phƣơng pháp gel ion với natri tripolyphotphat (STPP) dƣới hỗ trợ sóng siêu âm đồng hóa Các yếu tố ảnh hƣởng nhƣ pH, tỷ lệ chitosan/STPP, thời gian công suất siêu âm, nhƣ khối lƣợng phân tử độ deacetyl hóa chitosan đƣợc khảo sát nhằm tạo hạt nano chitosan có kích thƣớc nhỏ Theo kết quy hoạch thực nghiệm, với pH:4, tỷ lệ chitosan/STPP: 4:1, thời gian siêu âm: 288s, cơng suất siêu âm: 5.85W/g, kích thƣớc trung bình hạt nano chitosan tạo ra: 165.5nm, với độ bền theo thời gian: 3ngày Khối lƣợng phân tử độ deacetyl hóa có ảnh hƣởng tới kích thƣớc hạt nano chitosan, nguyên liệu khối lƣợng phân tử 48kDa, độ deacetyl hóa 54.6% tạo kích thƣớc hạt nano chitosan 228.4nm, nguyên liệu khối lƣợng phân tử 57,7kDa độ deacetyl hóa 94.3% tạo kích thƣớc hạt nano chitosan 165.5nm Nano chitosan165.5nm có khả ức chế mạnh mẽ phát triển nấm mốc C Acutatum điều kiện in vitro HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa Luận văn thạc sĩ v LỜI CAM ĐOAN Tác giả xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân tác giả Các kết nghiên cứu kết luận luận án trung thực, không chép từ nguồn dƣới hình thức Việc tham khảo nguồn tài liệu đƣợc thực trích dẫn ghi nguồn tài liệu tham khảo theo yêu cầu Tác giả luận án Nguyễn Thị Kim Thoa HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa Luận văn thạc sĩ vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i ABSTRACT iii TÓM TẮT LUẬN VĂN iv LỜI CAM ĐOAN v Chƣơng GIỚI THIỆU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1.Ứng dụng nano chitosan 2.2.Tổng quan chitosan 2.2.1 Cấu trúc chitosan 2.2.2 Tính chất chitosan 2.3 Tổng quan nanochitosan 2.3.1 Lịch sử phát triển 10 2.3.2 Nguyên lý chung chế tạo nano 11 2.3.3 Các phƣơng pháp tạo nanochitosan 12 2.4.Tác dụng cắt mạch chitosan sóng siêu âm 19 Chƣơng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Nguyên liệu, hóa chất dụng cụ tiến hành 21 3.1.1 Nguyên liệu chitosan 21 3.1.2 Chủng nấm Colletotrichum acutatum gây bệnh thán thƣ cà chua 21 3.1.3 Hóa chất 21 3.1.4 Thiết bị tạo hạt nano chitosan 22 3.2 Nội dung nghiên cứu 22 HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa Luận văn thạc sĩ vii 3.2.1 Khảo sát nguyên liệu chitosan 23 3.2.2 Các phƣơng pháp tạo hạt nano chitosan 23 3.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng nguyên liệu chitosan 29 3.3 Các phƣơng pháp xác định kích thƣớc hạt 30 3.3.1 Phƣơng pháp đo tán xạ ánh sáng động học DLS (Dynamic Light Scattering) 30 3.3.2 Phƣơng pháp kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscopy) 32 3.3.3 Phƣơng pháp kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission electron microscopy) 32 3.3.4 Các tiêu theo dõi 32 3.3.5 Thử nghiệm tính kháng nấm nano chitosan điều kiện in vitro 32 3.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu 34 Chƣơng 4.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 4.1 Khảo sát tính chất nguyên liệu chitosan 35 4.1.1 Xác định khối lƣợng phân tử độ deacetyl hóa nguyên liệu chitosan 35 4.1.2 4.2 Xác định cấu trúc nguyên liệu chitosan 36 Khảo sát phƣơng pháp tạo nano chitosan 36 4.2.1 Phƣơng pháp gel ion có hỗ trợ sóng siêu âm 36 4.2.2 Khảo sát khả tạo hạt nano chitosan phƣơng pháp gel ion có hỗ trợ đồng hóa sóng siêu âm 39 4.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng tỷ lệ chitosan/ tripolyphotphate 45 4.2.4 Khảo sát ảnh hƣởng pH dung dịch chitosan 47 4.3 Tối ƣu hóa quy hoạch thực nghiệm xác định thông số phù hợp 50 4.4 Xác định độ bền dung dịch nano chitosan 58 4.5 Đánh giá hình thành nano chitosan qua phổ hồng ngoại 60 4.6 Khảo sát ảnh hƣởng nguyên liệu chitosan đến khả tạo hạt nano chitosan 63 HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa Luận văn thạc sĩ 81 PHỤ LỤC Phụ lục A: Xác định độ Deacetyl A.1: Xác định độ Deacetyl hóa chitosan Cần Thơ Mức độ Deacetyl hóa chitosan có ảnh hƣớng đến khả hòa tan, khả tạo hạt chitosan Do việc xác định mức độ deacetyl hóa nguyên liệu cần thiết Chúng sử dụng phƣơng pháp phổ hồng ngoại để xác định mức độ deacetyl hóa chitosan Hình A 1: Phổ FTIR chitosan nguyên liệu Độ deacetyl hóa (DD) chitosan, đƣợc tính trực tiếp giá trị cƣờng độ hấp thụ tƣơng ứng với đỉnh phổ nhƣ sau: Bảng A 1:Giá trị cường độ hấp thu tính theo phổ FTIR Chitosan HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa Luận văn thạc sĩ 82 Giá trị cƣờng độ hấp thu A3450 A2870 A1655 A1420 A1320 0.22600 0.06367 0.01709 0.02120 0.01576 Bảng A.2: Giá trị DDA Chitosan tính theo phổ FTIR Cơng thức tính DA [ ] [ ] chitosan DA chitosan 5.68610347 8.69689526 DD chitosan 94.3138965 91.3031047 Kết tính tốn cho thấy mức độ deacetyl hóa chitosan dùng nghiên cứu có độ deacetyl > 90% A.2: Xác định độ Deacetyl hóa chitosan Nha Trang HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa Luận văn thạc sĩ 83 Hình B 2: Phổ FTIR chitosan nguyên liệu Bảng B.1: Giá trị cường độ hấp thu tính theo phổ FTIR Chitosan Giá trị cƣờng độ hấp thu A3450 A1655 0.80045 0.45881 Bảng B.2: Giá trị DDA Chitosan tính theo phổ FTIR Cơng thức tính DA [ ] chitosan DA chitosan 45.3985933 DD chitosan 54.6014067 Độ deacetyl hóa chitosan nguyên liệu Nha Trang 54.6% Phụ lục B:Thống kê xử lý số liệu JMP 9.0 HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa 84 Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa 85 Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa 86 Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa 87 Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa 88 Luận văn thạc sĩ 89 Phụ lục C Chuẩn bị môi trƣờng PDA, PDB HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa Luận văn thạc sĩ 90 Khoai tây loại bỏ vỏ, rửa sach, cắt viên cho vào lít nƣớc cất đun sơi, tính từ nƣớc sơi giữ 30 phút thu lấy dịch chiết Pha them nƣớc cấtvào cho đủ lít dịch chiết khoai tây - Mơi trƣờng full PDA (1 lít) + 250 g khoai tây + 20 g glucose + 15 g agar Phụ lục D: Thống kê thí nghiệm thử tính kháng nấm điều kiện in vitro D.1 Khả kháng nano chitosan đến đường kính tản nấm C acutatum sau 48 20:15 Thursday,December10, 2015 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for HHKL NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.020494 Number of Means Critical Range 2547 Means with 2666 the same 2738 letter 2786 are 2819 not significantly different Duncan Grouping Mean N DC A 15.9133 B 12.9033 0.02 HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa Luận văn thạc sĩ 91 D C 10.8700 0.04 D 0.0000 0.08 0.32 0.0000 D 0.16 0.0000 D.2Khả kháng nano chitosan đến đường kính tản nấm C acutatum sau 96 20:15 Thursday, December10, 2015 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for HHKL NOTE: This test controls experimentwise error rate the Type I comparisonwise error rate, Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square Number of Means Critical Range 0.4242 1.159 1.213 1.246 1.267 1.282 Means with the same letter are not different Duncan Grouping Mean N DC A 33.0400 B 26.1833 0.02 C 22.9067 0.04 D 9.0467 0.08 E 0.0000 0.16 HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa not the significantly Luận văn thạc sĩ 92 E 0.0000 0.32 D.3 Khả kháng nano chitosan đến đường kính tản nấm C acutatum sau 144 20:15Thursday,December10, 2015 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for HHKL NOTE: This test controls experimentwise error rate the Type I comparisonwise error rate, Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square Number of Means Critical Range 0.63055 1.413 1.479 1.519 1.545 1.563 Means with the same letter are not different Duncan Grouping Mean N DC A 49.8667 B 36.5300 0.02 C 32.3767 0.04 D 15.5933 0.08 HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa not the significantly Luận văn thạc sĩ 93 E 0.0000 E 0.0000 0.16 0.32 D.4 Khả kháng nano chitosan đến đường kính tản nấm C acutatum sau 192 20:15hursday, December10, 2015 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for HHKL NOTE: This test controls experimentwise error rate the Type I comparisonwise error rate, Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square Number of Means Critical Range 2.490 Means 2.606 with the 12 1.958589 2.676 same letter 2.723 2.755 are not different Duncan Grouping Mean N DC A 62.973 B 48.633 0.02 C 43.443 0.04 D 20.463 0.08 E 0.000 0.16 E 0.000 0.32 HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa not the significantly Luận văn thạc sĩ 94 D.5 Khả kháng nano chitosan đến đường kính tản nấm C acutatum sau 240 20:15 Thursday, December10, 2015 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for HHKL NOTE: This test controls experimentwise error rate the Type I comparisonwise error rate, Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square Number of Means Critical Range 12 1.097967 1.864 1.951 2.004 2.039 2.063 Means with the same letter are not different Duncan Grouping Mean N DC A 74.9633 B 62.8833 0.02 C 54.8500 0.04 D 32.3167 0.08 E 0.0000 0.16 E 0.0000 0.32 HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa not the significantly Luận văn thạc sĩ 95 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên: Nguyễn Thị Kim Thoa Ngày sinh: 18/09/1985 Nơi sinh: Đồng Nai Địa thƣờng trú: 270 Thích Quảng Đức, Long Khánh, Đồng Nai Q trình đào tạo: - 2004-2008: Sinh viên trƣờng Đại học Nông Lâm HCM - 2013-2016: Học viên cao học trƣờng Đại học Bách Khoa HCM HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa ... CN Thực Phẩm Mã số: 60 54 01 01 I Tên đề tài NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP TẠO HẠT NANO CHITOSAN ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG BẢO QUẢN THỤC PHẨM II Nhiệm vụ nội dung Nhiệm vụ  Khảo sát phƣơng pháp tạo hạt nano. .. polyanion Hạt nanochitosan Hình2 11:Sơ đồ tạo hạt nanochitosan phương pháp tạo gel ionic Tóm lại, phƣơng pháp khác tạo hạt nanochitosan có kích thƣớc khác tính chất khác nhau, mà ứng dụng chúng... Hạt nanochitosan Hình2 6: Sơ đồ tạo nanochitosan phương pháp khuếch tán dung môi nhũ tương 2.3.3.5 Phƣơng pháp sấy phun Sấy phun kỹ thuật phổ biến ứng dụng dƣợc phẩm, thực phẩm để tạo bột, hạt