Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Số 36A, 2018 BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG DUNG MÔI KOH CHIẾT RONG BIỂN VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA DUNG MÔI NÀY ĐẾN HÀM LƯỢNG PROTEIN TRONG DỊCH CHIẾT ĐÀO QUỐC HƯNG, NGUYỄN LÊ ANH THƯƠNG, TRẦN MINH HẢI Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh hungdao1610@gmail.com Tóm tắt: Rong biển thường sử dụng làm thức ăn, làm thành phần thực phẩm chức năng, mỹ phẩm làm phân bón Dịch chiết từ rong biển sử dụng làm phân bón qua cho loại trồng Rong mứt (Porphyra vietnamensis) tươi chế biến sơ gồm rửa cát, rác, phơi khô nghiền nhỏ trước chiết Trộn rong biển qua xử lý với dung môi theo tỷ lệ 0,5 g : 25 ml Các loại dung môi sử dụng HCl, H2SO4, NaOH KOH; thời gian chiết từ – 11 giờ, nhiệt độ chiết 28, 55 95oC Kết nghiên cứu cho thấy hàm lượng protein dịch chiết sử dụng dung môi NaOH hay KOH cao – lần so với chiết dung môi HCl, H2SO4 Tăng nhiệt độ hay tăng thời gian chiết làm tăng hàm lượng protein dịch chiết Khi sử dụng dung mơi KOH 5% chiết nhiệt độ 95oC có hàm lượng protein dịch chiết cao gấp 2,3 – 3,6 lần so với chiết nhiệt độ 28 hay 55oC Đối với chiết KOH thời gian chiết thích hợp khoảng nhiệt độ khoảng 100oC Thêm vào đó, chiết rong biển KOH cho hàm lượng N tổng số K2O tổng số cao chiết H2SO4 Việc lựa chọn nồng độ KOH thích hợp cần dựa vào nhu cầu loại trồng thời kỳ sinh trưởng phát triển chúng Kali hiđroxit dung môi tiềm việc chiết rong biển làm phân bón vừa cung cấp dinh dưỡng đa lượng Kali vừa làm tăng chất lượng dịch chiết Từ khóa: Dịch chiết, hàm lượng protein, kali hiđroxit, nitơ tổng số, rong biển, INITIAL STUDY ON KOH SOLVENT FOR SEAWEED EXTRACTION AND ITS EFFECT ON PROTEIN IN THE EXTRACT Abstract: Seaweed is usually used as foods, main gradients in fuctional food, cosmetics, and for producing fertilizers Extract from sea weed is able to be used as folar fertilizers for various types of crops Fresh Porphyra vietnamensis was primarily processed, including washing sands and wastes, and sun-drying before extraction The processed seaweed and solvent was mixed with weight to volume ratio 0.5 g to 25 ml Four types of solvents HCl, H2SO4, NaOH and KOH, extraction time from to 11 hours, extraction temperature 28, 55 and 95oC were the factors studied for seaweed extraction The results showed protein content in extract using NaOH or KOH was – time as many as that in extract using HCl or H2SO4 The higher extraction temperature or time, the higher protein content in the extracts was With solvent KOH 5%, the protein content in extract obtained at 95oC was 2.3 – 3.6 times as many as that at 28 or 55oC What extracted using KOH solvent for hours and at about 100oC was the most apperoriate, the highest protein content compared to the other experiment conditions studied In addition, the extract using KOH solvent had higher total N and total K2O than that using H2SO4 Choosing appropriate KOH concentration for seaweed extraction is nessessarily based on types of crops and their growth and development stages Potassium hydroxide is a potential solvent for extracting seaweed for foliar fertilizers because it provides macroelement Potassium and higher quality of the extract as well Key words: Extract, protein content, potassium hydroxide, total nitrogen, seaweed GIỚI THIỆU Rong biển thường sử dụng làm thức ăn, làm thành phần thực phẩm chức mỹ phẩm làm phân bón Dịch chiết từ rong biển sử dụng làm phân bón qua cho loại © 2018 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh 34 BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG DUNG MÔI KOH CHIẾT RONG BIỂN VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA DUNG MÔI NÀY ĐẾN HÀM LƯỢNG PROTEIN TRONG DỊCH CHIẾT trồng rau, ngũ cốc, hoa Các hợp chất dịch chiết từ rong biển quan trọng sinh trưởng trồng gibberellins (nấm giberela), xitokinin, auxin, axit abscisic, vitamin, axit amin chất dinh dưỡng [6] Mặc dù dịch chiết từ rong biển có tiềm ứng dụng lớn hàm lượng thành phần chất dịch chiết khác nguồn nguyên liệu rong biển thất thường (mùa vụ, vị trí địa lý) kỹ thuật chiết khác [1] Do đó, việc lựa chọn phương pháp chiết phù hợp yếu tố làm tăng chất lượng dịch chiết Các phương pháp chiết rong biển thường chia làm ba nhóm, gồm: phương pháp sinh học (phân hủy nhờ enzym), phương pháp thủy phân hóa học (sử dụng dung môi vô hữu cơ) phương pháp vật lý (sử dụng áp suất cao điều kiện lạnh) [5] Phương pháp dùng axit mạnh hay kiềm mạnh để phân phủy thịnh hành phương pháp sử dụng enzym hay phương pháp vật lý Do phương pháp hóa học có thời gian chiết nhanh nhiều so với phương pháp sinh học Hơn nữa, sử dụng enzym, enzym nhập để chiết suất rong biển làm phân bón giá thành sản xuất tăng lên cao, dẫn đến giảm sức cạnh tranh thị trường sản phẩm [9] Còn phương pháp vật lý đắt đỏ (điện sử dụng), yêu cầu có thiết bị đại (máy hút chân không làm đông đá) nghiền mẫu (thiết bị nghiền chun dụng) Có loại dung mơi hóa học kiềm axit sử dụng để chiết rong biển Thủy phân rong biển axit sunfuric – 25% nhiệt độ cao (100 – 120oC) [4] Sử dụng dung mơi kiềm để chiết rong biển dịch chiết thường giàu auxin [3] Các dung môi axit kiềm thường sử dụng để chiết rong biển gồm HCl, H2SO4, NaOH, nhiên chưa có cơng bố chi tiết việc sử dụng KOH để chiết rong biển làm phân bón qua Các axit mạnh sử dụng làm dung môi dễ gây tượng protein hóa axit amin (sản phẩm thủy phân), gây ảnh hưởng không tốt đến chất lượng dịch chiết rong biển làm phân bón qua lá; đó, axit amin dạng hấp thu trồng [8] Vì vậy, việc sử dụng KOH làm dung môi chiết rong biển làm phân bón qua có lợi ích vừa cung cấp ngun tố dinh dưỡng đa lượng K+ vừa hạn chế nhược điểm axit mạnh làm dung môi, nhờ làm tăng chất lượng dịch chiết PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Xử lý nguyên liệu Rong mứt (Porphyra vietnamensis) tươi rửa sơ để loại bỏ cát loại rác; sau ngâm rửa lần, lần giờ; ngâm qua đêm rửa nước ngâm có màu sáng, (Ảnh 1a, 1b) Tiếp theo, rong mứt ngâm rửa phơi nắng khoảng tiếng đo độ ẩm máy đo độ ẩm MA150 (Sartorius, Đức), độ ẩm đạt – 10% đem nghiền máy xay sinh tố HR 2215 – 600w (Hãng Philips, Indonesia) trước chiết Rong nghiền bảo quản bình nhựa có nắp đậy kín sử dụng dần cho thí nghiệm 1a 1b Ảnh Màu sắc nước ngâm rong mứt lần đầu (1a): nâu đỏ, nhiều cát, đục; lần cuối trước phơi (1b): màu sáng, © 2018 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG DUNG MÔI KOH CHIẾT RONG BIỂN VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA DUNG MÔI NÀY ĐẾN HÀM LƯỢNG PROTEIN TRONG DỊCH CHIẾT 35 2.2 Quy trình chiết rong biển Trộn rong biển xử lý sơ (dạng bột khô) với loại dung môi theo tỷ lệ 0,5 g : 25 ml (cho vào ống thủy tinh đường kính 22 mm), bịt ống nilon Sau thời gian chiết định, dịch chiết thu đem đo hàm lương protein máy Nanodrop (BioPhotometer Plus, Hãng Eppendorf, Đức) bước sóng 280 nm Quy trình áp dụng cho tất thí nghiệm chiết rong biển Đối với thí nghiệm cần điều tiết nhiệt độ chiết sử dụng bể ổn nhiệt Waterbaths & Oilbaths (Hãng Memmert, Đức) (Ảnh 2) Ảnh Bể ổn nhiệt Waterbaths & Oilbaths (Hãng Memmert, Đức) sử dụng điều chỉnh nhiệt độ chiết Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng loại dung mơi hóa học, nhiệt độ thời gian chiết đến hàm lượng dịch chiết Các loại dung mơi hóa học sử dụng gồm HCl 5%, H2SO4 5%, NaOH 5% KOH 5% Các mức nhiệt độ 28oC (nhiệt độ phòng), 55oC 95oC Các mốc thời gian chiết 1, 3, 5, Kết hợp yếu tố cho thí nghiệm gồm 60 nghiệm thức (Bảng 1) Mỗi nghiệm thức lặp lại lần Bảng Các nghiệm thức nghiên cứu ảnh hưởng loại dung môi, nhiệt độ thời gian đến hàm lượng protein dịch chiết Thời gian chiết (giờ) + HCl 5% H2SO4 5% NaOH 5% KOH 5% 28oC 55oC 95oC 28oC 55oC 95oC 28oC 55oC 95oC 28oC 55oC 95oC 3+ 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 số lần lặp lại nghiệm thức © 2018 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh 36 BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG DUNG MÔI KOH CHIẾT RONG BIỂN VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA DUNG MÔI NÀY ĐẾN HÀM LƯỢNG PROTEIN TRONG DỊCH CHIẾT Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ KOH % (m/v) mức 1%, 3%, 5%, 7%, 9%, 11% nhiệt độ 95oC (sử dụng bể ổn nhiệt) với thời gian chiết 3, 6, 9, 12 Chỉ tiêu theo dõi hàm lượng protein (µg/ml) Mỗi ống nghiệm lặp lần 2.3 Xác định hàm lượng N, P2O5, K2O dịch chiết Các mẫu dịch chiết gửi đến Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng (Quatest 3®) để phân tích xác định nguyên tố dinh dưỡng đa lượng trồng gồm: N , P2O5 K2O tổng số Phương pháp pháp phân tích N tổng số dựa theo TCVN 5815 : 2001; P2O5 tổng số dựa theo TCVN 8563 : 2010 (UV-VIS) K2O tổng số dựa theo TCVN 8562 : 2010 (FES) 2.4 Phân tích số liệu: Số liệu thí nghiệm nhập vào phần mềm Microsoft Excel 2010 So sánh khác biệt giá trị trung bình nghiệm thức thơng qua phân tích phương sai (ANOVA), phương pháp xác định khác biệt dựa vào giá trị LSD (Least Significant Difference) Việc phân tích sử dụng phần mềm STATGRAPHIC CENTURION KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng loại dung môi hóa học, nhiệt độ thời gian chiết đến hàm lượng protein dịch chiết Kết nghiên cứu cho thấy loại dung môi, thời gian chiết nhiệt độ ảnh hưởng đến hàm lượng protein dịch chiết (Bảng 2a, 2b, 2c) Hàm lượng protein đo dịch chiết sử dụng dung môi kiềm (NaOH, KOH) cao nhiều, gấp 2,3 – 5,5 lần so với sử dụng dung mơi axít (HCl, H2SO4), kết tương tự nghiệm thức có thời gian chiết nhiệt độ chiết khác Nếu chiết giờ, hàm lượng protein chiết dung môi H2SO4 5% 1300,0, 1733,3 2058,3 µg/ml nhiệt độ chiết tương ứng 28, 55 95oC; chiết KOH 5% hàm lượng tương ứng 3008,3, 4608,3 10750,0 µg/ml Điều lý giải môi trường kiềm thuận lợi việc hòa tan protein kỵ nước rong biển [2] Ảnh hưởng pH đến hàm lượng protein dịch chiết đáng kể, tăng pH từ 8,5 lên 11 làm cho hàm lượng protein dịch chiết tăng gấp đơi [7] Khơng có sai khác có ý nghĩa thống kê hàm lượng protein dịch chiết chiết dung môi HCl H2SO4 chiết dung môi NaOH KOH Dung mơi NaOH KOH kiềm mạnh có hóa trị dẫn đến pH dung môi cao tương đương Khi hai dung môi kiềm cho hàm lượng protein dịch chiết rong biển làm phân bón tương đương dung mơi KOH có ưu vượt trội so với NaOH chiết rong biển làm phân bón qua KOH cung cấp K+, ba nguyên tố dinh dưỡng đa lượng thiết yếu trồng Hàm lượng protein dịch chiết có xu hướng tăng tăng thời gian chiết Ở thời gian chiết hàm lượng protein dịch chiết đạt cao Chẳng hạn, thời gian chiết hàm lượng protein dịch chiết sử dụng KOH 5% nhiệt độ 55 95oC tương ứng 4608,3 10750,0 µg/ml, thời gian chiết từ – hàm lượng protein thấp đáng kể, từ 2400,0 – 4291,7 µg/mL nhiệt độ chiết 55oC từ 3516,7 – 10616,7 µg/ml nhiệt độ chiết 95oC (Bảng 2b 2c) Bảng 2a Hàm lượng protein dịch chiết loại dung môi thời gian chiết khác nhiệt độ 28oC Dung môi HCl 5% H2SO4 5% NaOH 5% KOH 5% LSD0,05 Protein, SE µg/ml 816,7b 33,3 b 1025,0 28,9 2175,0c 94,6 2433,3c 148,1 283,8 giờ giờ Protein, Protein, Protein, Protein, SE SE SE SE µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml 1291,7a 72,6 1366,7a 72,6 1366,7a 72,6 1300,0a 38,2 1208,3a 8,3 1300,0a 14,4 1358,3a 68,2 1300,0a 52,0 b 2391,7 138,7 2683,3b 134,1 3191,7c 33,3 2900,0b 187,6 2625,0b 80,4 2983,3b 144,6 3333,3c 190,6 3008,3b 221,9 262,3 351,9 313,5 422,5 © 2018 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG DUNG MÔI KOH CHIẾT RONG BIỂN VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA DUNG MÔI NÀY ĐẾN HÀM LƯỢNG PROTEIN TRONG DỊCH CHIẾT 37 Bảng 2b Hàm lượng protein dịch chiết loại dung môi thời gian chiết khác nhiệt độ 55oC Dung môi HCl 5% H2SO4 5% NaOH 5% KOH 5% LSD0,05 Protein, SE µg/ml 833,3a 36,3 1408,3a 172,2 2508,3b 360,9 2400,0b 464,6 914,7 giờ giờ Protein, Protein, Protein, Protein, SE SE SE SE µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml 1108,3a 150,2 1150a 62,9 1475a 137,7 991,7a 46,4 a a 1350,0 198,4 1050 209,7 1366,7a 112,1 1733,3a 88,2 3341,7b 166,0 3866,7b 786,7 4050,0b 253,7 4533,3b 425,8 2908,3b 353,7 3791,7b 480,1 4291,7b 526,8 4608,3b 401,1 657,8 1341,5 862,9 836,8 Bảng 2c Hàm lượng protein dịch chiết loại dung môi thời gian chiết khác nhiệt độ 95oC Protein, SE µg/ml Dung môi HCl 5% H2SO4 5% NaOH 5% KOH 5% LSD0,05 Protein, SE µg/ml Protein, SE µg/ml Protein, SE µg/ml Protein, SE µg/ml 933,3a 72,6 2216,7a 180,5 3000b 28,9 3083,3b 84,6 3700b 213,6 1191,7a 68,2 1633,3a 66,7 1641,6a 72,6 1725,0a 38,2 2058,3a 92,8 2983,3b 148,1 7833,3b 185,6 9033,3c 342,0 10800,0 337, 11391,7 3516,7c 182,8 7816,7b 271,7 9350,0c 66,1 362,5 645,6 582,3 c 10616,7 c 517,7 93,9 c 10750,0 c 446,4 87,8 782,4 14000 Hàm lượng protein (µg/mL) 12000 28oC 55oC 95oC 10000 8000 6000 4000 2000 HCl 5%, H2SO4 5%, NaOH 5%, KOH 5%, Loại dung mơi hóa học Biểu đồ Hàm lượng protein dịch chiết loại dung môi nhiệt độ chiết khác với thời gian chiết © 2018 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG DUNG MÔI KOH CHIẾT RONG BIỂN VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA DUNG MÔI NÀY ĐẾN HÀM LƯỢNG PROTEIN TRONG DỊCH CHIẾT 38 Nhiệt độ chiết tăng lên làm tăng hàm lượng protein dịch chiết Trong mức nhiệt độ nghiên cứu, hàm lượng protein dịch chiết nhiệt độ chiết 95oC cao nhất, cao nhiều so với nhiệt độ chiết 28 55oC (Biểu đồ 1) Ở dung môi KOH 5% thời gian chiết giờ, hàm lượng protein nhiệt độ chiết 95oC 10750,0 µg/ml, cao gấp 2,3 lần so với chiết nhiệt độ 55oC (4608,3 µg/ml) cao gấp 3,6 lần chiết nhiệt độ 28oC (3008,3 µg/mL) 3.2 Ảnh hưởng nồng độ KOH% đến hàm lượng protein dịch chiết Hàm lượng protein dịch chiết có khác sử dụng nồng độ dung môi KOH khác (Bảng 3) Khi nồng độ dung mơi KOH tăng hàm lượng protein dịch chiết có xu hướng tăng lên Hàm lượng protein dịch chiết tăng vượt trội nồng độ dung môi KOH 11% so với nồng độ dung môi KOH 1%, 3%, 5%, 7%, 9% Với thời gian chiết giờ, hàm lượng protein chiết dung môi KOH 11% 7650,0 µg/ml, nồng độ dung môi KOH từ – 9% cho hàm lượng protein 5225,0 µg/ml Kết có quy luật tương tự thu thí nghiệm với thời gian chiết 6, 12 18000 KOH 1% 16000 KOH 3% KOH 5% Hàm lượng protein (µg/mL) 14000 KOH 7% KOH 9% 12000 KOH 11% 10000 8000 6000 4000 2000 0 10 11 12 13 Thời gian chiết (giờ) Biểu đồ Hàm lượng protein dịch chiết thu nồng độ dung môi KOH thời gian chiết khác với nhiệt độ chiết 95oC Bảng Hàm lượng protein dịch chiết nghiệm thức có nồng độ dung mơi KOH thời gian chiết khác Nghiệm thức KOH 1% KOH 3% KOH 5% KOH 7% Protein SE (µg/ml) 3633,3a 290,6 4166,7ab 587,1 3591,7a 234,7 4258,3ab 243,4 Protein SE (µg/ml) 4766,7a 186,2 b 6716,7 501,9 b 7200,0 212,6 b 7408,3 206,3 © 2018 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh Protein SE (µg/ml) 7050,0a 203,6 bc 9033,3 313,7 d 11150,0 115,5 b 8508,3 206,3 12 Protein SE (µg/ml) 7550,0a 187,6 8200,0ab 326,3 8683,3b 297,3 7425,0a 200,5 BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG DUNG MÔI KOH CHIẾT RONG BIỂN VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA DUNG MÔI NÀY ĐẾN HÀM LƯỢNG PROTEIN TRONG DỊCH CHIẾT KOH 9% KOH 11% LSD0.05 5225,0b 7650,0c 1061,9 344,9 224,1 8875,0c 11225,0d 1060,7 421,6 398,7 9666,7c 15225,0e 843,3 321,6 387,6 8766,7b 14483,3c 822,5 39 304,3 254,3 Bênh cạnh đó, yếu tố thời gian chiết có ảnh hưởng rõ đến hàm lượng protein dịch chiết (Biểu đồ 2) Khi chiết nhiệt độ 95oC, thời gian chiết tăng làm cho hàm lượng protein dung dịch chiết tăng lên, nhiên thời gian chiết cho hàm lượng protein đạt cao Sau thời gian đó, việc tăng thời gian chiết không làm tăng hàm lượng protein dịch chiết, mà chí cịn làm giảm Chẳng hạn, dung môi KOH 11% hàm lượng protein dịch chiết thu 7650,0, 11225,0, 15225,0 14483,3 µg/ml tương ứng với thời gian chiết 3, 6, 12 3.3 Ảnh hưởng loại dung môi đến hàm lượng dinh dưỡng đa lượng dịch chiết Bước đầu kiểm tra hàm lượng chất dinh dưỡng đa lượng N, P2O5, K2O tổng số dung dịch chiết cho thấy có khác loại dung môi sử dụng H2SO4 3% KOH 3% (Bảng 4) Kết phân tích nguyên tố dinh dưỡng cho thấy hàm lượng N K2O tổng số dịch chiết sử dụng dung môi KOH 3% cao dịch chiết sử dụng dung môi H2SO4 3% Hàm lượng N K2O tổng số dịch chiết sử dụng dung môi KOH 3% tương ứng 0,18% 2,28%, dịch chiết sử dụng dung mơi H2SO4 3% có 0,14%