Hoạt động một số Enzym chống Ôxy hóa hồng cầu ở thỏ nhiễm độc Acephat docx

Hoạt động một số enzym chống ôxy hoá hồng cầu ở thỏ nhiễm độc Acephat Hoàng Thị Bích Ngọc 1 , Nguyễn Mai Huê 2 , Hoàng Hạnh Phúc 3 Trờng Đại Học Y Hà Nội 1 , Bệnh viện Việt Tiệp, Hải Phòng 2 , Viện Nhi Trung ơng 3 . ảnh hởng của acephate, một hóa chất trừ sâu phospho hữu cơ, trên một số enzym chống oxy hoá trong hồng cầu đã đợc nghiên cứu. Thỏ đợc uống acephate liều 20mg và 40mg/kg thân trọng/ngày, trong 30 ngày liên tục. Hoạt độ của enzym superoxid dismutease (SOD), glutathion peroxidase (GPx), glutathion reductase (GR) trong hồng cầu, cholinesterase (ChE) và tình trạng oxy hoá toàn phần (TAS) trong huyết tơng đợc xác định trớc và sau khi gây độc. Kết quả cho thấy: - Hoạt độ enzym SOD, GR giảm ở ngày thứ 15 và 31, trở về bình thờng ở ngày thứ 45. - Hoạt độ enzym SOD, GR giảm ở ngày thứ 15 và 31, trong khi hoạt độ GPx lại tăng. - Tình trạng chống oxy hoá toàn phần không thay đổi. I. Đặt vấn đề Trong những năm gần đây, hoá chất trừ sâu (HCTS) sử dụng tăng lên đáng kể cả về số lợng lẫn chủng loại [6]. Acephate (AC), một loại phospho hữu cơ hiện đang đợc dùng khá phổ biến, cũng đợc biết là chất có tác dụng ức chế cholinesterase (ChE). Sự biến đổi của hệ thống enzym chống oxy hoá do tác động của HCTS đã đợc một số tác giả công bố. Panemangalore M và cộng sự [10] nghiên cứu ảnh hởng của hỗn hợp AC, methamidophos và nicotine lên hệ thống enzym chống oxy hoá của chuột thực nghiệm. Năm 2001, Nguyễn Thị Hoa cũng cho thấy ảnh hởng của hỗn hợp padan và AC trên hệ thống enzym chống oxy hoá của thỏ [1]. Tác động riêng rẽ của AC với liều nhỏ kéo dài lên hệ thống enzym chống oxy hoá của thỏ sẽ nh thế nào, đó là mục tiêu của nghiên cứu này. Đề tài có nhiệm vụ: Gây ô nhiễm độc liều nhỏ kéo dài của AC trên thỏ theo đờng uống. 1. Xác định hoạt độ enzym ChE huyết tơng ở các giai đoạn trớc, sau nhiễm độc và giai đoạn phục hồi. 2. Xác định hoạt độ của các enzym SOD, GPx, GR và TAS ở các giai đoạn trớc, sau nhiễm độc và giai đoạn phục hồi. II. đối tợng và phơng pháp nghiên cứu - Đối tợng: Thỏ khoẻ mạnh có trọng lợng 2kg 0,2kg. - Phơng pháp nghiên cứu: Thỏ đợc chia thành 3 nhóm: + Nhóm thử 1: uống AC liều 20mg/kg/ngày x 30 ngày: 6 con + Nhóm thử 2: uống AC liều 40mg/kg/ngày x 30 ngày: 6 con + Nhóm chứng: uống nớc cất với thể tích tơng đơng: 6 con. Xác định hoạt độ enzym ChE, và TAS huyết tơng, hoạt độ SOD, GPx, GR hồng cầu ở các thời điểm: Ngày 0 (trớc nhiễm độc), ngày thứ 15, ngày thứ 31 và ngày thứ 45. - Các kỹ thuật đợc sử dụng + Xác định hoạt độ ChE huyết tơng bằng kỹ thuật quang phổ, dùng cơ chất butyryl thiocholin trên máy Express - Plus. + Xác định hoạt độ SOD hồng cầu theo nguyên tắc sử dụng xanthine oxidase xúc tác chuyển xanthin thành acid uric và tạo gốc superoxid, gốc superoxid phản ứng với 2-[4- iodopheny1] - 3 [4-nitrophenol]-5 phenyltetrazolium chlorid (I. N. T) để tạo thành nhóm formazan. Hoạt độ SOD đợc đo bởi phần trăm ức chế sự tạo thành chất màu formazan. + Xác định hoạt độ GPx hồng cầu theo phơng pháp của Paglia và Valentin (1967). GPx xúc tác phản ứng oxy hoá glutathion 57 dạng khử (GSH) bởi cumene hydroperoxy tạo thành glutathion reductase và NADPH. Hoạt độ GPx đợc đo bằng sự giảm độ hấp thụ của NADPH ở bớc sóng 340nm. + Xác định hoạt độ GR hồng cầu theo phản ứng khử GSSG thành GSH với sự có mặt của NADPH. Hoạt độ GR đợc đo bằng sự giảm hoạt độ hấp thụ của NADPH ở bớc sóng 340nm. + Định lợng TAS toàn phần huyết tơng dựa trên nguyên tắc: ABTS R [2,2' azino - bis (3- ethybenzathiazoline sunphonate), đợc ủ với H 2 O 2 và Metmyoglobin (HX - Fe III ) để tạo ra gốc Cation ABTS R+ có màu xanh da trời đợc đo ở bớc sóng 600nm. Các chất chống oxy hoá trong huyết tơng ức chế sản phẩm này, độ ức chế tỷ lệ thuận với hợp chất màu đợc tạo ra. Các số liệu đợc xử lý theo chơng trình Epi - Info 6. 0, Statistica 5. 0 và Excel 5. 0. III. Kết quả Biểu đồ 1: Sự thay đổi hoạt độ enzym ChE ở thỏ nhiễm độc acephate (tính theo % so với ngày trớc khi gây độc) Biểu đồ 2: Sự thay đổi hoạt độ enzym SOD ở thỏ nhiễm độc acephate (tính theo % so với ngày trớc khi gây độc) 58 BiÓu ®å 3: Sù thay ®æi ho¹t ®é enzym GPx ë thá nhiÔm ®éc acephate (tÝnh theo % so víi ngµy tr−íc khi g©y ®éc) BiÓu ®å 4: Sù thay ®æi ho¹t ®é enzym GP ë thá nhiÔm ®éc acephate (tÝnh theo % so víi ngµy tr−íc khi g©y ®éc) 59 Biểu đồ 5: Sự thay đổi tình trạng chống oxy hoá toàn phần (tính theo % so với ngày trớc khi gây độc) IV. bàn luận Các enzym chống oxy hoá hồng cầu ngời đợc xem nh dấu ấn sinh học của sự phơi nhiễm và đánh giá nguy cơ HCTS ảnh hởng tới sức khoẻ của con ngời [6]. Acephate đợc biết là một chất ức chế trực tiếp AChE [3,9]. Các phospho hữu cơ (PPHC) ức chế enzym ChE ban đầu bởi liên kết ion, sau đó enzym bị phosphoryl hoá bởi liên kết cộng hoá trị. Hoạt độ enzym ChE đợc sử dụng nh một dấu ấn sinh học của sự phơi nhiễm với HCTS PPHC, nhng nó không đợc coi nh một chất chỉ định độc của PPHC [7]. Kết quả ở liều 40mg/kg/ ngày, hoạt độ ChE giai đoạn trớc gây độc qui về 100%, thì ngày thứ 15 hoạt độ ChE giảm 15% (p<0,01), ngày thứ 31 giảm 27,%, giai đoạn hồi phục ngày thứ 45 hoạt độ ChE trở lại bình thờng ở liều 22,3% p<0,05. Kết quả này tơng tự nh kết quả của các tác giả trong và ngoài nớc khác [1,2,6,8]. Trên thỏ nhiễm độc acephate hoạt độ SOD giảm. ở liều 20mg/kg/ngày, ngày thứ 15 giảm 14% (p<0,05), trở về bình thờng ở ngày thứ 31 và 45 Với liều 40mg/kg/ ngày: ngày thứ 15 hoạt độ SOD giảm 20,% (p<0,05), ngày thứ 31 giảm 10%, ngày thứ 45 trở về gần nh bình thờng. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Đỗ Thị Hơng Lan (2002) cũng thấy sự giảm hoạt độ của enzym SOD ở thỏ nhiễm độc mãn padan [2]. Cũng năm 2002, tác giả Nguyễn Thị Hoa nhận thấy tăng hoạt độ SOD ở thỏ nhiễm độc hỗn hợp padan và acephate [1]. Theo Kono N. và Fridovich F. (1982) và Gultekin F. (2000) Thì CE là loại PPHC ức chế gián tiếp hoạt độ enzym SOD thông qua sự tăng nồng độ H 2 O 2 do catalase bị ức chế. Phải chăng thí nghiệm của chúng tôi sự giảm hoạt độ enzym SOD cũng là ảnh hởng gián tiếp của acephate ức chế catalese gây tăng nồng độ H 2 O 2 . Datta C. và cộng sự (1991) nghiên cứu trên in vitro thấy phosphomidon (phospho hữu cơ) có khả năng gây tăng hoạt độ 60 enzym GPx hồng cầu và giảm hoạt độ enzym GPx huyết thanh [6]. Ahmed S. R. và cộng sự (1999) gây độc trên chuột bằng malathion (một phospho hữu cơ) trong 4 tuần thấy có sự tăng hoạt độ enzym GPx [4]. Prakasam M, và cộng sự (2001) nhận thấy hoạt độ GPx tăng ở 41 công nhân làm nghề phun hoá chất trừ sâu ở ấn Độ [8]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi ở cả hai liều hoạt độ GPx tăng cao nhất là ở ngày thứ 15 (liều 20mg/kg/ ngày tăng 31%, liều 40mg/kg/ngày tăng 29%), có ý nghĩa thống kê với p<0,001 và đều trở về gần nh bình thờng vào ngày thứ 45. Datta C. và cộng sự (1991) trên in vitro thấy phosphomidon (phospho hữu cơ) có khả năng gây giảm hoạt độ GR hồng cầu và hoạt độ GR huyết tơng [6]. Kết quả của chúng tôi cho thấy hoạt độ GR giảm đặc biệt ở ngày thứ 15, liều 20mg/kg/ngày, giảm 14%, liều 40mg/kg/ngày giảm 20% với p<0,05. ở ngày thứ 31, với liều 40mg/kg/ngày hoạt độ enzym GR vẫn giảm 10%, ngày thứ 45 hoạt độ enzym GR trở về gần nh bình thờng. Liều 20mg/kg/ngày: hoạt độ enzym GR trở về bình thờng ở ngày thứ 31 và 45. Prakasam A. (2001) [10], nhận thấy ở những nông dân làm nghề phun hoá chất trừ sâu có sự tăng của SOD, GPx, catalase, acid ascorbic Và sự giảm của glutathion, -tocopherol. Kết quả của chúng tôi, ở hai nhóm thỏ sự thay đổi về TAS không có ý nghĩa thống kê. Đỗ Thị Hơng Lan (2001), Nguyễn Thị Hoa (2001) cũng nhận thấy không có sự thay đổi đáng kể TAS ở thỏ nhiễm độc padan và hỗn hợp padan acephate liều nhỏ dài ngày [1],[2]. Almeida M. G. (1997) cho thấy sự tăng gốc superoxid, tăng quá trình peroxid hoá lipid ở gan gây ra bởi hexachlorobenzene [5]. V. Kết luận Từ các kết quả nghiên cứu có thể rút ra những kết luận sau: Gây độc thực nghiệm acephate dài ngày trên thỏ liều 40mg/kg/ngày và 20mg/kg/ngày cho thấy: 1. Hoạt độ enzym ChE huyết thanh giảm 15% ở ngày thứ 15, giảm 27% ở ngày thứ 31, trở lại bình thờng ở ngày thứ 45. Mức độ ức chế của ChE ở liều 20mg/kg/ngày giảm ít hơn so với liều 40mg/kg/ngày. 2. Hoạt độ enzym SOD và GR hồng cầu đều giảm 20% ở ngày thứ 15, đều giảm 10% ở ngày thứ 31, với liều 20mg/kg/ngày mức độ giảm thấp hơn. Hoạt độ GPx tăng 31% ở ngày thứ 15, tăng 7% ở ngày thứ 31. Tình trạng chống oxy hoá toàn phần TAS huyết tơng biến đổi không đáng kể ở các thời điểm. Tài liệu tham khảo 1. Nguyễn Thị Hoa (2002), Nghiên cứu ảnh hởng của hỗn hợp padan và acephate trên hệ thống enzym chống oxi hoá ở thỏ thực nghiệm - Luận văn thạc sĩ Y học trờng Đại học Y Hà Nội 2. Đỗ Thị Hơng Lan (2002), ảnh hởng của Padan trên hệ thống enzym chống oxi hoá ở thỏ thực nghiệm - Luận văn thạc sĩ trờng Đại học Y Hà Nội. 3. Lê Trung, Hà Huy Kỳ, Đặng Ninh Ngọc (2001), Nghiên cứu đánh giá thực trạng nhiễm độc hoá chất bảo vệ thực vật tại các vùng sản xuất, lúa, chè, rau, nho. Các giải pháp khắc phục - Tạp san Y học lao động và vệ sinh môi trờng số 17, tr. 53 - 57. 4. Ahmed R. S, Seth V. Pasha S. T et al (2000) influence of dietaryginger (Zingiber officinales Rose) on oxidative stress induce by malathion in rat, Food chem. toxicol. 38 (5), pp 443 - 50. 5. Almeida M. G, Fanini F, Davino S. C et al (1997) Pro-and anti oxidant parameters in rat liver after exposured to 61 hexachlorobezen, Hum Exp Toxicol. 16 (5), pp 257 - 61. 6. Datta, C, Gupta J, Sarkar A, Sengupta D (1992) Effects of organophosphorus indectiside phosphomidonon antioxidantdefence components of human erythrocyte and plasma, Indian J. exp boil 30(1), pp 65 - 67. 7. Panemangalore M, Bebe F. N (2000) Dermal exposure to pestiside modifies antioxidant enzym in tissues of rats, J. Environ Sci Health B, 35 (4), pp 399 - 416. 8. Prakaram A, Sethupathy S, Lalitha S (2001) Plasma and RBCs antioxidant status in occupational male pesticide sprayers, Clin. chem. Acta, 310, pp 107 - 112 9. Poovala Vandana. S, Kani K, Vijaia et al (1998) Rol of oxidant stress and antioxidant protection in acephate induced renal tubular cytoxity, Toxico, scien, 46, pp. 403 - 409. Summary: Activity of erythrocyte antioxidant enzymes of rabbits during chronic acephate treatment The samples were obtained from the 38 peoples that can be divided in two groups: + Normal samples group: can see clearly three populations (lymphocyte, monocyte, granulocyte) on the window SSC, FSC. + Abnormal samples group: can’t difference those populations. There are two types of antibodies used for each method. + 4 colors method: CD3 (FITC)/CD8 (PE)/CD45 (PerCP)/CD4 (APC). + 3 colors method: CD4 (FITC)/CD3 (PE)/CD8 (PerCP). Obtained results: shown that the correlation coeficients of the % TCD 4 and TCD 8 between two methods were: + With normal samples: * TCD 4 : r = 0.96. * TCD 8 : r = 0.87. + And with abnormal samples: * TCD 4 : r = 0.66. * TCD 8 : r = 0.57. It means that we can use 3 colors method to quantify a accurately the % of TCD 4 and TCD 8 . 62 . đổi hoạt độ enzym ChE ở thỏ nhiễm độc acephate (tính theo % so với ngày trớc khi gây độc) Biểu đồ 2: Sự thay đổi hoạt độ enzym SOD ở thỏ nhiễm độc acephate. Hoạt động một số enzym chống ôxy hoá hồng cầu ở thỏ nhiễm độc Acephat Hoàng Thị Bích Ngọc 1 , Nguyễn Mai