Thử nghiệm tạo tinh thể ngọc trai bằng nuôi cấy sơ cấp tế bào biểu mô vỏ của trai nước ngọt trong ống nghiệm (sinanodonta fourdyi)

TĨM TẮT ĐỀ TÀI Nền tảng hình thành ngọc trai tích tụ tinh thể calcium carbonate dạng tinh thể aragonite, tiết tế bào biểu mô màng áo; gọi xà cừ Nghiên cứu nuôi cấy tế bào biểu mô vỏ trai in vitro có ý nghĩa quan trọng việc thiết lập phương pháp đánh giá chất lượng trai, sàng lọc giống trai Hơn thế, kết nghiên cứu tiền đề quan trọng cho việc nghiên cứu tạo ngọc trai ống nghiệm Trong nghiên cứu này, tế bào từ trai nước nuôi cấy chọn lọc nhiều môi trường (DMEM/F12, L15-M199, IMDM, TCM) điều kiện nhiệt độ khác (4 0C, 240C nhiệt độ phịng) để chọn điều kiện thích hợp Các tế bào sau nuôi điều kiện thích hợp nghiên cứu cảm ứng tiết xà cừ Các yếu tố chọn để khảo sát bao gồm: Ca2+, EGF bFGF Sau đó, phủ xà cừ lên bề mặt hạt nhân đánh giá thông qua việc đặt hạt nhân môi trường nuôi cấy Kết cho thấy tế bào trai nước nuôi thành công điều kiện in vitro nhiệt độ 240C, mơi trường ni cấy L15-M199; có khả tiết xà cừ sau 30 ngày nuôi Số lượng tinh thể xà cừ tiết tăng dần theo thời gian nuôi không phụ thuộc vào yếu tố cảm ứng nghiên cứu khảo sát (Ca2+, EGF FGF) Các tinh thể xà cừ có xuất mơi trường nuôi; nhiên phủ lớp tinh thể lên bề mặt hạt nhân chưa quan sát nghiên cứu Từ khóa : Trai nước ngọt, tế bào biểu mô, tiết xà cừ, xà cừ I SUMMARY The foundation of natural pearl formation by mussels is heed position of calcium carbonate in the form of aragonite crystals, secreted essentially by the epithelial cells of mantle tissue as nacre The in vitro explant culture of nacresecreting pallial mantle explants of fresh water pearl mussel was vital steps to approach the establishment quality of pearl mussel species, screening pearl mussel species that make pearl with high efficiency Morever the results of this researh give the hope for the in vitro pearl production with various colors The aims of this research were culture of mantle epithelial cells and investigating the capacity of their nacre-secretion when they were induced by specific factors In this research, mantle epithelial cells were cultured in different kinds of medium and temperature to select the suitable environment for pearl messel epithelial cell culture After that, old medium was changed by fresh medium supplemented with inducers (Ca2+, FGF, EGF) Nacre secretion of these cells was evaluated via the nacre formation in culture medium Nacre covering on nuclear beads was investigated by putting nuclear beads inside the medium culturing mantle cells The results showed that the mantle epithelial cells can culture in vitro at 240C in L15-M199 medium and secrete nacre when in vitro cultured after 30 days but the efficiency of secretion was independent with different inducers investigated Nacre coverage on nuclear beads was not recognized in this research Keywords: Freshwater mussel, mantle epithelial cells, nacre secretion, nacre II Mục lục Trang Tóm tắt đề tài I Mục lục III Danh sách chữ viết tắt III Danh sách bảng IV Danh sách hình V Bảng toán VI PHẦN MỞ ĐẦU VII Tên đề tài/dự án: Thử nghiệm tạo “tinh thể” ngọc trai nuôi cấy sơ cấp tế bào biểu mô vỏ trai nước ống nghiệm Chủ nhiệm đề tài/dự án: Phạm Văn Phúc Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ Thời gian thực hiện: 18 tháng (5/2008 – 12/2009) Kinh phí duyệt: 80.000.000 VNĐ Kinh phí cấp:72.000.000 VNĐ theo TB số: TB-SKHCN ngày / Mục tiêu Nội dung Sản phẩm đề tài/dự án CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát loài trai 1.2 Sự hình thành ngọc trai tự nhiên 1.3 Cơ chế hình thành ngọc trai quan điểm tế bào học 1.4 Cấu tạo ngọc trai 1.5 Những khó khăn việc ni tế bào nhuyễn thể 1.6 Tình hình nghiên cứu liên quan đề tài nước 10 CHƯƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung 1: XÂY DỰNG QUY TRÌNH NI CẤY SƠ CẤP 15 III 2.1.1 Thí nghiệm 1: So sánh hiệu khử nhiễm hai phương pháp khác 15 2.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát điều kiện nuôi cấy nhiệt độ 17 2.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát điều kiện ni cấy môi trường nuôi 18 2.2 Nội dung 2: XÂY DỰNG QUY TRÌNH CẢM ỨNG TIẾT TINH THỂ NGỌC TRAI 20 Thí nghiệm 4: Khảo sát tạo tinh thể ngọc trai 2.3 Nội dung 3: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG BAO PHỦ CỦA XÀ CỪ LÊN HẠT NHÂN 23 Thí ngiệm 5: Khảo sát bao phủ lớp xà cừ vào hạt nhân cấy vào môi trường nuôi CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH NI CẤY SƠ CẤP 27 3.1.1 Phương pháp B cho hiệu khử nhiễm tốt phương pháp A 27 3.1.2 Môi trường DMEM/F12 cho hiệu nuôi tế bào tốt môi trường khảo sát 28 3.1.3 Nhiệt độ 240C thích hợp nhiệt độ khảo sát 33 3.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT SỰ TIẾT XÀ CỪ TRONG MÔI TRƯỜNG CẢM ỨNG 36 3.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT SỰ BÁM CỦA XÀ CỪ LÊN HẠT NHÂN 39 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN 42 4.2 KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC IV DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIẾT DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium, môi trường Eagle biến đổi Dulbecco HBSS Hank’s Buffered Salt Solution, dung dịch muối sinh lý theo Hank L15 L-15 Leibovitz Medium L15-M199 Môi trường phối trộn L15 M199 theo tỉ lệ 1:1 TCM Tisse culture medium – Môi trường nuôi mô Phase S Pha tế bào tổng hợp Phase M Pha tế bào phân chia Phase G0/G1 Pha tế bào trạng thái nghỉ Phase G2 Pha tế bào chuẩn bị phân chia V DANH SÁCH BẢNG SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG Bảng 1.1 Thành phần acid amin tạo nên conchiolin Bảng 1.2 Tổng kết số môi trường nuôi tế bào trai Bảng 3.1 Số lượng vi khuẩn trung bình đếm mơi trường Bảng 3.2 Tỷ lệ phần trăm số mảnh mơ có tế bào mọc lan nuôi 25 môi trường khác 27 Bảng 3.3 Sự tăng số lượng tế bào theo thời gian môi trường 28 Bảng 3.4 Kết phân tích chu kỳ tế bào 31 Bảng 3.5 Tỷ lệ phần trăm mảnh mô nuôi tế bào có tế bào mọc lan nhiệt độ khác Bảng 3.6 32 Số lượng tế bào xuất sau mốc thời gian khác nhiệt độ nuôi cấy khác 32 Bảng 3.7 34 Thời điểm xuất tinh thể VI DANH SÁCH HÌNH SỐ TÊN HÌNH ẢNH TRANG Hình thái cấu tạo thân mềm thuộc lớp Bivalvia Cấu tạo viên ngọc trai Ngọc trai đen Biểu đồ cấu trúc hiển vi xà cừ, cách xếp miếng aragonite nhỏ với lớp protein Tế bào thu sau ngày nuôi cấy Nghiên cứu Ningping Gong, 2008 12 12 Tinh thể Aragonite xuất mơi trường ni cấy ngày thứ 40 13 Hình 2.1 Bố trí thí nghiệm 15 Hình 2.2 Hình 2.3 Hình 2.4 Hình 2.5 Hình 2.6 Quy trình khử nhiễm Gong cộng Quy trình khử nhiễm Edward Frank Bố trí thí nghiệm Bố trí thí nghiệm Bố trí thí nghiệm 16 16 17 19 21 Hình 3.1 Hình 3.2 Biểu đồ thể tăng số lượng vi khuẩn theo thời gian Biểu đồ thể số lượng tế bào môi trường khác sau 120 nuôi cấy Biểu đồ thể tỉ lệ phần trăm tế bào tăng theo thời gian nuôi so với lúc 12 nuôi Biểu đồ thể thay đổi số tế bào/mảnh mơ trung bình theo thời gian ni nhiệt độ khác Biểu đồ thể tỉ lệ phần trăm tăng số lượng tế bào nhiệt đồ khác Các tinh thể xà cừ xuất môi trường nuôi cấy Số lượng tinh thể xà cừ xuất mẻ sau ngày khảo sát 25 Hình 1.1 Hình 1.2 Hình 1.3 Hình 1.4 Hình 1.5 Hình 1.6 Hình 1.7 Hình 3.3 Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7 VII 29 30 33 34 35 37 THÔNG TIN CHUNG Tên đề tài: Thử nghiệm tạo “tinh thể” ngọc trai nuôi cấy sơ cấp tế bào biểu mô vỏ trai nước ống nghiệm (Sinanodonta jourdyi) Chủ nhiệm đề tài: Phạm Văn Phúc Cơ quan chủ trì: Trung tâm phát triển khoa học cơng nghệ trẻ Thời gian thực đề tài: 18 tháng (5/2008-12/2009) Kinh phí duyệt: 80.000.000 VNĐ Kinh phí cấp: 72.000.000 VNĐ theo TB số : TB-SKHCN ngày… /… /… MỤC TIÊU + Thiết lập quy trình ni cấy tế bào lớp biểu mô tạo xà cừ điều kiện in vitro + Xây dựng quy trình cảm ứng, kích thích tiết xà cừ ni cấy NỘI DUNG Cơng việc dự kiến Tiến độ Thí nghiệm 1: Khảo sát điều kiện nuôi cấy nhiệt độ Đã hồn thành Thí nghiệm 2: Khảo sát mơi trường ni cấy Đã hồn thành Thí nghiệm 3: Khảo sát tạo tinh thể ngọc trai Đã hồn thành Thí nghiệm 4: Khảo sát bao phủ lớp xà cừ vào hạt nhân cấy Đã hồn thành vào mơi trường ni Hồn thiện sản phẩm nghiệm thu đề tài Đã hoàn thành SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI  Quy trình thu nhận, ni cấy tế bào biểu mơ trai nước in vitro  Quy trình cảm ứng biểu xà cừ nuôi cấy  Bài báo: 01 báo cáo hội nghị Công nghệ Sinh học tồn quốc phía Nam (2009) 01 báo đăng tạp chí Cơng nghệ Sinh học (2010)  Đào tạo: cử nhân (Cử nhân Nguyễn Minh Hoàng, tốt nghiệp tháng 9/2009) VII 1.1 KHÁI QUÁT VỀ CÁC LỒI TRAI Từ ngàn xưa, người tìm cách để khám phá bí mật việc tạo ngọc trai thiên nhiên Cách 27 kỷ, người dân Babilon cổ đại khai thác ngọc trai vịnh Ba Tư Người Trung Quốc biết khai thác ngọc trai từ lâu Có nhiều lồi nhuyễn thể có khả cho ngọc Người ta phát khả tạo ngọc ban đầu trai nước mặn, sau trai nước Trai nước hay trai sông tên thường dùng để gọi nhóm nhuyến thể “hai mảnh” (bivalves) sinh sống hồ, ao, sơng, suối Trai nước thuộc nhiều họ sinh vật khác họ lớn họ Unionidae Trai nước không liên hệ mật thiết với trai biển hay vẹm Cho đến nay, việc phân loại trai nước chưa hoàn chỉnh, trai chia thành nhiều họ phụ khác nhau, nhiều dựa vào chi tiết đơn giản Trai nước có đặc tính chung thân có hai mảnh vỏ dính với lề Hình dạng, khối lượng, độ dầy màu sắc vỏ thay đổi tùy lồi Vỏ ngồi từ màu vàng, xanh lục thay đổi đến nâu hay đen, mặt vỏ có vạch, nốt u mép vỏ có gờ; mặt vỏ có lớp xà cừ màu sắc thay đổi từ toàn trắng đến có ánh hồng, đỏ, xám tím Phái tính số lồi phân biệt độ lớn-nhỏ vỏ Đời sống trai nước gồm giai đoạn bản: Ấu trùng, Thiếu thời Trưởng thành Sinh sản: Khi nhiệt độ môi trường nước yếu tố môi sinh khác đạt đến mức thích hợp, trai đực phóng thích tinh trùng vào môi trường nước, trai hút tinh trùng vào bên vỏ qua hệ thống lọc nơi mang Sau trứng thụ tinh, trai nuôi trứng đến giai đoạn ấu trùng mang Ấu trùng (glochidia) lớn phóng thích khỏi mang năm hay giữ lại nơi mang mùa Đông đợi đến mùa Xuân năm sau thả Các lồi phóng thích ấu trùng năm gọi “short-term brooder” (ấp trứng ngắn hạn), loài giữ ấu trùng lại “long-term brooder” (ấp trứng dài hạn) Sau phóng thích, ấu trùng (glochidia) cần phải bám vào mang hay vi loài cá ký chủ thích hợp để trải qua tiến trình biến thái hầu chuyển sang giai đoạn “thiếu thời” Với nhiều lồi trai, ký chủ thích hợp bị giới hạn lồi cá sinh tồn trai tùy thuộc vào diện loài cá Chỉ tỷ lệ nhỏ số từ 75 ngàn đến triệu ấu trùng trai mẹ phóng thích ra, sống qua giai đoạn thiếu thời Nhiều lồi trai có phương thức đặc biệt để tiếp cận với cá ký chủ Glochidia (tùy loài) thường sống bám vào cá ký chủ thời gian từ tuần đến tháng Sự di động cá giúp ấu trùng di chuyển nhiều xa khỏi vùng nước chúng sinh Trong tiến trình biến thái, trai “thiếu thời” rời khỏi cá để bắt đầu đời sống cá nhân Trai trưởng thành khơng có khả di động nhiều, chúng có “chân”, thị khỏi vỏ để bám vào giá thể, sau rụt chân để di chuyển, thường theo chiều dọc Theo ước lượng triệu ấu trùng phát triển thành trai “thiếu thời” Giai đoạn thiếu thời, hay chưa phát triển tính dục kéo dài từ 2-12 năm tùy thuộc vào loài Trai trưởng thành sống lâu hàng chục năm có lồi đến kỷ Hình 1.1 Hình thái cấu tạo Thân mềm thuộc lớp Bivalvia Theo Aarus University, 1999 The Invertebrates, An Illustrated Glossary International M.Sc Programme in Marine Science Bảng 3.2 Tỉ lệ phần trăm số mảnh mơ có tế bào mọc lan ni cấy môi trường khác Sau 12 nuôi cấy Sau 24 nuôi cấy Sau 120 nuôi cấy Số mảnh Tỉ lệ % Số mảnh Tỉ lệ % Số mảnh Tỉ lệ % DMEM 29 97,66 % 29 97,66 % 30 100% L15-M199 30 100% 30 100% 30 100% IMDM 29 97,66 % 29 97,66 % 30 100% TCM 30 100% 30 100% 30 100% Đến thời điểm 120 giờ, số lượng tế bào tăng 147,85% so với thời điểm 12 nuôi cấy Kết tăng sinh chứng tỏ tế bào ổn định bắt đầu tăng sinh Điều cho thấy sau thời gian xử lý khử nhiễm, vi khuẩn bị loại bỏ gần hết khỏi môi trường nuôi cấy, với số lượng vi khuẩn nên kháng sinh mơi trường đủ để kìm hãm tăng sinh vi khuẩn; mặt khác, tế bào bắt đầu thích nghi với môi trường Kết tương tự kết nghiên cứu hai tác giả Dharmaraj Suja (Dharmaraj and Suja, 2003) Trong mơi trường ni có hai quần thể chiếm ưu R2 R3 (như Phụ lục 2) R2 tế bào giống tế bào hemocyte (tế bào có kích thước lớn, độ hạt tế bào chất thấp), R3 quần thể tế bào biểu mơ (tế bào có kích thước nhỏ độ hạt tế bào chất cao) Như vậy, nuôi cấy mảnh mô môi trường DMEM/F12, tỉ lệ tế bào biểu mô chiếm ưu (42,18%) so với tế bào hemocyte (20,23%) quần thể tế bào thu Tổng cộng loại tế bào không đạt 100% ngồi quần thể tế bào chiếm ưu thế, mơi trường cịn có nhiều loại tế bào khác Những tế bào vùng R2, R3 tế bào có kích thước độ hạt trung gian hai quần thể đặc trưng Thật vậy, hai quần thể R2 R3 phát phân biệt quan sát kính hiển vi: loại tế bào không nhân, không bám loại tế bào có nhân bám Dựa biểu đồ (Phụ lục 2), quần thể R2 có kích thước khơng tế bào chất không đậm đặc, tế bào hemocyte Quần thể R3 có kích thước tế bào chất đậm đặc, tế bào biểu mô Kết tương tự nghiên cứu giới ghi nhận xuất hai loại tế bào nuôi cấy mảnh mô từ nhuyễn thể với tỉ lệ cao (Suzuki and Mori, 1991; Awaji and Suzuki, 1998; Dharmaraj and Suja, 2001; Shi, 27 2002; Barik et al., 2004; Li et al., 2005; Sugishita et al., 2005) Bảng 3.3 Số lượng tế bào tăng sinh xuất xung quanh mảnh mơ trung bình theo mốc thời gian Thời gian DMEM F12 L15-M199 IMDM TCM 12 1985,13 1667,83 1564,73 1924,67 24 2089,17 1383,03 2466,47 2352,60 120 4920,06 2839,37 7685,30 5115,00 Trong đó, mơi trường L15-M199, sau 12 ni, tất mảnh mô xuất tế bào mọc lan So với nghiên cứu nuôi cấy tế bào màng áo Ningping Gong cộng năm 2008, tế bào giống tế bào hemocyte xuất sau ngày nuôi cấy (96 giờ) Trong môi trường có hai quần thể tế bào tương tự môi trường DMEM/F12 tỉ lệ loại tế bào khác nhau: tỉ lệ phần trăm quần thể tế bào biểu mô hemocyte 23,72% 58,14% Tương tự môi trường IMDM, sau 12 xuất mọc lan tế bào từ mảnh mô với tỉ lệ 97,66% số mảnh mô Trong giai đoạn đầu (12-24 giờ), số tế bào tăng chậm, khoảng 4,41% Trong giai đoạn tiếp theo, tế bào thích nghi tăng sinh mạnh Tương tự hai mơi trường trên, mơi trường IMDM có hai quần thể tế bào chiếm ưu thế: tế bào giống tế bào hemocyte (42,12%) tế bào biểu mô (25,40%) Trong môi trường này, giai đoạn từ 0-12 nuôi cấy, tế bào xuất quanh mảnh mô Trong giai đoạn từ 12-24 giờ, mơi trường TCM có tỉ lệ tế bào tăng sinh nhanh loại mơi trường Có hai quần thể ưu tế bào giống tế bào hemocyte tế bào biểu mô Tỉ lệ tế bào biểu mô thấp (20,28%), tỉ lệ tế bào giống tế bào hemocyte cao (43,73%) 28 Hình 3.2 Biểu đồ biểu thị số lượng tế bào môi trường sau 12giờ đến 120 nuôi cấy Tại thời điểm khảo sát (12 giờ), mọc lan loại môi trường xuất Số lượng mảnh mơ có tế bào mọc lan khác khác biệt không đáng kể Với kết khảo sát trên, kết luận mơi trường tối ưu Chúng tơi nhận xét tế bào tạo ngọc trai nước loại tế bào tăng sinh mạnh, thích nghi với nhiều loại mơi trường Có thể bốn loại mơi trường thích hợp cho ni cấy tế bào tạo ngọc trai nước Khi tính tốn số lượng trung bình cho thấy tế bào ni mơi trường IMDM có tốc độ tăng sinh nhanh Nhưng khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê bốn môi trường độ tin cậy 95% 29 Hình 3.3 Biểu đồ biểu thị tỉ lệ phần trăm tế bào tăng theo thời gian nuôi so với thời điểm 12 Khi so sánh dựa vào tỉ lệ phần trăm số tế bào tăng theo thời gian, kết cho thấy giai đoạn từ 12-24 ni cấy, mơi trường TCM có tỉ lệ phần trăm tế bào tăng sinh cao Trong giai đoạn tiếp theo, môi trường IMDM cho hiệu tăng sinh cao Kết phân tích chu kì tế bào phù hợp với kết đếm số lượng Tỉ lệ phần trăm tế bào phân chia (phase M) môi trường 2,11%, 1,82%, 1,13% 1,02% tương ứng môi trường IMDM, TCM, DMEM/F12 L15M199 Về thành phần tế bào, loại mơi trường có xuất loại tế bào (biểu mô hemocyte) chiếm ưu quần thể tế bào sau ni, trong mẻ nuôi cấy với môi trường IMDM TCM, số lượng tế bào hemocyte chiếm ưu thế; trong mẻ nuôi cấy với môi trường L15-M199 DMEM/F12, số lượng tế bào biểu mô chiếm ưu Thật vậy, mơi trường DMEM/F12, thành phần tế bào kiểu hình biểu mô cao nên tỉ lệ tăng sinh kết đếm thấp tế bào biểu mơ tăng sinh chậm tế bào heamocyte Kết phân tích chu kì tế bào cho thấy phần trăm tế bào phase M môi trường DMEM/F12 thấp; song tỉ lệ phần trăm tế bào phase S cao môi trường khảo sát Điều cho thấy, tế bào môi trường 30 DMEM/F12 có khả phân chia mạnh thời gian phân chia cho chu kì tế bào dài Bảng 3.4 Kết phân tích chu kì tế bào Phase/Mơi DMEM/F12 IMDM TCM L15-M199 G1/G0 (%) 91,43 92,57 92,12 94,73 S (%) 7,48 5,32 6,06 4,21 G2/M (%) 1,13 2,11 1,82 1,02 trường Kết khảo sát cho thấy môi trường cho tốc độ tăng sinh cao môi trường IMDM, môi trường cho tỉ lệ tế bào biểu mô cao môi trường DMEM/F12 (42,18%) Với mục đích thu nhận quần thể tế bào biểu mô, chọn môi trường DMEM/F12 cho nghiên cứu 3.1.3 Nhiệt độ 24oC thích hợp nhiệt độ khảo sát Ở 40C, xuất tế bào mọc lan khơng có khác biệt so với nhiệt độ lại Trong 24 đầu, số lượng tế bào có tăng tương đối chậm Sau 24-96 nuôi cấy, tế bào giảm số lượng Điều (1) nhiệt độ khơng thuận lợi, q trình trao đổi chất tế bào chậm lại nhiệt độ giảm theo quy luật “nhiệt độ giảm xuống 100C, tốc độ phản ứng sinh hóa giảm nửa” Hơn nữa, 40C nhiều enzyme bị thụ động hoạt tính Mặc dù vậy, tế bào không ngừng hẳn phản ứng trao đổi chất, số tế bào tự thích nghi với nhiệt độ thấp, khác khơng thích nghi chết, làm giảm số lượng tế bào; (2) Thao tác thay mơi trường nhiều lần làm thất tế bào dạng huyền phù môi trường Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu khác cho thấy ni cấy thành công tế bào màng áo từ điệp Patinopecten yessoensis (Mayumi Endoh Yasushi Hasegawa, 2006); loài động vật hai mảnh Calyptogena soyoae (Koyama Masuo Aizawa, 2000) 40C 31 Bảng 3.5 Tỉ lệ phần trăm mảnh mơ ni cấy có tế bào mọc lan nhiệt độ khác Sau 12 nuôi cấy Sau 24 nuôi cấy Sau 120 nuôi cấy Số mảnh Tỉ lệ % mơ có mọc mảnh mơ mọc lan lan Số mảnh Tỉ lệ % mơ có mọc mảnh mô lan mọc lan Số mảnh Tỉ lệ % mơ có mọc mảnh mơ mọc lan lan độ C 30 100% 30 100% 29 99,7 % 24 độ C 30 100% 30 100% 30 100% Nhiệt độ phòng 29 99,7 % 30 100% 30 100% Ở nhiệt độ phịng (thay đổi tùy thuộc vào nhiệt độ mơi trường), thời gian xuất tế bào mọc lan 0-12 ni cấy Xét mặt này, khơng có khác biệt so với nhiệt độ khác Ở nhiệt độ phịng, nhiệt độ ln ln dao động từ 20-280C Do vậy, khoảng thời gian có nhiệt độ thích hợp, tế bào tăng sinh tốt, ngược lại, tế bào bị ức chế, giảm số lượng Trong giai đoạn đầu, tế bào phát triển tương đối tốt; sau đó, tế bào tăng sinh chậm có số mảnh mơ bị chết Điều nhiệt độ khơng ổn định, q trình sinh hố tế bào bị ảnh hưởng Trong ni 240C, tế bào tăng sinh ổn định Bảng 3.6 Số lượng tế bào xuất sau mốc thời gian khác nhiệt độ nuôi cấy khác 12 24 120 độ C 1549,50 1723,93 1333,70 24 độ C 891,97 1383,70 1660,87 1206,63 1452,97 1513,97 Nhiệt độ phịng 32 Hình 3.4 Biểu đồ thể thay đổi số tế bào/mảnh mô trung bình theo thời gian ni nhiệt độ ni khác Dựa đồ thị hình 3.4, tế bào 240C có mức tăng sinh trội hai phương pháp lại Khi xử lý số liệu đếm mảnh mô phần mềm StatGraphics cho giá trị P-value > 0,05 ba thời điểm nuôi cấy Như vậy, kết thu khơng có khác biệt mặt ý nghĩa thống kê Ngun nhân kích thước mảnh mơ không đồng nhất, thay môi trường nhiều lần làm cho số lượng tế bào thất khơng Những nguyên nhân làm cho phép đếm có sai số Để khắc phục sai số lớn phép đếm tế bào trung bình mảnh mơ, chúng tơi đánh giá tăng sinh dựa vào tỉ lệ phần trăm tế bào tăng thời điểm so với số tế bào thời điểm 12 nuôi cấy Với cách này, hiệu đánh giá dựa tỉ lệ phần trăm số tế bào tăng lên so với số tế bào thời điểm 12 nuôi cấy Kết cho thấy có khác biệt có ý nghĩa thống kê tốc độ tăng sinh tế bào nhiệt độ khác Trong đó, nhiệt độ 240C tối ưu cho nuôi cấy tế bào biểu mơ trai nước (Hình 3.4) 33 Hình 3.5 Biểu đồ so sánh tỉ lệ phần trăm tế bào tăng sinh theo thời gian nuôi cấy so với thời điểm 12 nuôi cấy 3.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT SỰ TIẾT XÀ CỪ TRONG MÔI TRƯỜNG CẢM ỨNG Tinh thể xà cừ xuất mẻ nuôi cấy sau 30 ngày nuôi liên tục số lượng khơng phụ thuộc vào chất cảm ứng Như kết trình bày Phụ lục TN4a, đĩa nuôi khảo sát lô lần lặp lại Bảng 3.7 Thời điểm xuất tinh thể xà cừ môi trường nuôi theo thời gian Thời điểm quan sát Lô 1 (Ngày 0) 0/9 15 (Sau 15 ngày nuôi) 0/9 30 (Sau 30 ngày nuôi) 7/9 37 (Sau 37 ngày nuôi) 9/9 45 (Sau 45 ngày nuôi) 9/9 52 (Sau 52 ngày nuôi) 9/9 60 (Sau 60 ngày nuôi) 9/9 Lô 0/9 0/9 7/9 9/9 9/9 9/9 9/9 Lô 0/9 0/9 8/9 9/9 9/9 9/9 9/9 Vào thời điểm 30 ngày đánh giá, lô xuất tinh thể xà cừ Số lượng đĩa có xuất tinh thể xà cừ gần nhau, 7/9, 7/9 8/9 lô 1, 34 Sau 37 ngày, nuôi cấy tất đĩa tất lô xuất tinh thể xà cừ Hình 3.6 Tinh thể xuất mơi trường cảm ứng độ phóng đại 200 lần Ở đĩa tinh thể xà cừ có dạng hình lập phương, hình kim tự tháp… có góc cạnh nhẵn, phản xạ ánh sáng mạnh Dưới kính hiển vi, hầu hết tinh thể có màu vàng sáng Hình 3.7 Số lượng tinh thể xà cừ xuất mẻ sau ngày khảo sát Tại thời điểm khảo sát, khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê mức tin cậy 95% lơ thí nghiệm có khơng có bổ sung chất cảm ứng Trên mẫu khảo sát thời điểm cho lơ đợt thí nghiệm lơ có dao động 35 nhẹ số lượng tinh thể trung bình đĩa Tuy trình đếm, số tinh thể có kích thước nhỏ 75 µm bị lọt khỏi màng lọc hay nhỏ mà khơng thể quan sát thấy kính hiển vi độ phóng đại 200 lần bỏ sót Cũng như, việc thay mơi trường làm thất lượng tinh thể; song, thao tác tiến hành giống lô sai số thao tác gây loại trừ Trong môi trường thời điểm: số lượng tinh thể tăng có ý nghĩa thống kê số thời điểm định Ở tất lô khảo sát, tinh thể xà cừ tăng theo thời gian khảo sát với mốc xuất xác định vào ngày 30 đến sau 30 ngày sau Tuy nhiên, quy luật chung cho lô số lượng tinh thể xà cừ tăng chậm sau ngày 45 đến ngày 60 Kết hợp quan sát hình ảnh kính hiển vi, kết cho thấy sau thời điểm 45 ngày kích thước tinh thể to dần, phản xạ ánh sáng mạnh Khi nuôi môi trường cảm ứng khác nhau, sau 30 ngày, mẫu nuôi cấy xuất tinh thể xà cừ Các tinh thể có hình hộp chữ nhật, hình lập phương với góc nhẵn phản xạ ánh sáng chiếu vào Kết tương tự kết Panha Phansuwan (Panha et al, 1996) nhóm Domart-Coulon et al (2001), Suja et al (2005) Trong nghiên cứu môi trường DMEM/F12 sử dụng cho nuôi cấy chứa dung dịch muối Calcium nên tinh thể hình thành đĩa ni cấy tinh thể aragonite Chúng kết trình khống hóa sinh học chuyển muối calcium thành tinh thể aragonite chứa CaCO thông qua tế bào biểu mô màng áo Điều cho thấy tế bào biểu mô cung cấp khung sườn cần thiết cho tinh thể xà cừ, mẫu đối chứng (chỉ chứa mơi trường) khơng có khung sườn nên không xuất tinh thể xà cừ Tuy nhiên, tinh thể hình thành ni cấy cần đánh giá phương pháp sâu hấp thu tia X, phân tích micro laser, quan sát kính hiển vi điện tử quét… để xác định đặc điểm chứng nhận tinh thể xà cừ Việc bổ sung chất cảm ứng Ca2+, FGF hay EGF gần khơng có tác động kích thích tiết xà cừ (Hình 3.7) Trong nghiệm thức nuôi tế bào điều kiện thường, tế bào tiết tinh thể xà cừ vào ngày 30 Và vào thời điểm nghiệm thức xuất tinh thể xà cừ đĩa nuôi cấy Số 36 lượng tinh thể xà cừ xuất đĩa nuôi tăng dần vào thời gian nghiệm thức ; nhiên, sau 45 ngày nuôi cấy, tăng không đáng kể Ở thời điểm số lượng tinh thể thu nhận đĩa nuôi gần tương đương Kết cho thấy Ca2+, EGF FGF khơng phải tác nhân gây tiết xà cừ Các tế bào biểu mơ ni có khả Do đó, cho tác động học suốt q trình thao tác mơ tế bào yếu tố cảm ứng tế bào tiết xà cừ Thời gian nuôi lâu, mật độ tế bào dày, tế bào lão hóa, nguyên nhân tượng tinh thể xà cừ xuất với tốc độ giảm dần theo thời gian 3.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT SỰ BÁM CỦA XÀ CỪ LÊN HẠT NHÂN Tinh thẻ xà cừ không bám vào bề mặt hạt nhân sau 60 ngày nuôi liên tục Hình 3.8 Hai hạt nhân có số vị trí gắn với tinh thể xà cừ Trong tổng số 27 hạt nhân cấy vào môi trường nuôi cấy, sau 60 ngày nuôi liên tục, số hạt nhân bao phủ xà cừ đạt 0% Sự khác biệt khả phản xạ ánh sáng hạt nhân lơ thí nghiệm gần tương tự Tuy vậy, 27 hạt nhân có hạt nhân có biểu số vị trí có bám xà cừ lên bề mặt (Hình 3.8) Trong nghiên cứu này, khả bao phủ xà cừ lên bề mặt hạt nhân thấp số nguyên nhân sau: (1) hạt nhân bám dính yếu với thành phần xà cừ Do số điều kiện khách quan, nhóm nghiên cứu khơng mua hạt nhân tạo từ vỏ trai nên nhóm sử dụng hạt sỏi Việc sử dụng hạt nhân có 37 nguồn gốc từ trai cho giúp xà cừ bao phủ lớn thành phần protein khống vỏ trai xà cừ liên kết với Tuy việc chọn viên sỏi “ bắt chước” mơ hình hình thành ngọc trai tự nhiên; song nghiên cứu cho thấy khả bao phủ xà cừ lên hạt nhân yếu bề mặt sỏi khơng thuận lợi cho bám dính thành phần tạo xà cừ Nhiều nghiên cứu giới rằng, việc thay đổi bề mặt hạt nhân yếu tố quan trọng cho việc tạo ngọc in vivo in vitro Vì thế, nhiều khảo sát bao phủ lên hạt nhân số chất collagen, fibronectin, poly-l-lysin, matrigel… tiến hành so sánh Song, nghiên cứu bị giới hạn nguồn kinh phí mục tiêu nên thí nghiệm kết đánh giá bước đầu (2) Nguyên nhân thứ hàm lượng chất thành phần xà cừ thấp không đủ để bao phủ Để có lớp phủ xà cừ tồn diện, dày cần lượng chất cho xà cừ, tinh thể aragonite protein conchiolin đủ để che phủ bề mặt hạt nhân Điều đòi hỏi lượng lớn tế bào chọn lọc tế bào có suất sản xuất xà cừ mạnh (3) Nguyên nhân thứ tác động mơi trường có chứa thành phần chất xà cừ lên hạt nhân không Trong nghiên cứu này, hạt nhân đặt ngẫu nhiên môi trường; không đồng thành phần chất môi trường vùng tế bào nhiều, tế bào phần gây nên bao phủ khơng đủ để thấy rõ ràng (4) Nguyên nhân cuối thời gian cho phép bao phủ cịn Nghiên cứu khảo sát 60 ngày So với điều kiện in vivo thời gian q ngắn để tạo ngọc in vivo; nhiên, thời gian tương đối dài in vitro Trong nghiên cứu, tế bào thay môi trường liên tục 60 ngày với chế độ ngày/lần khơng cung cấp thể tích cho tế bào phát triển nên dẫn đến mật độ tế bào dày ; vào sau khoảng 30 ngày nuôi, tế bào bắt đầu chết dần theo cụm bề mặt đĩa tích trống tế bào lại tiếp tục tăng sinh Việc tăng số ngày cần thiết để bao phủ thay đổi kết theo chiều hướng tốt ; thực tế nghiên cứu gặp số khó khăn khả sống tăng trưởng chậm sau 30 ngày nuôi Mật độ tế bào nuôi mật độ cao chưa khảo sát hết điều kiện cần thiết cho nuôi tế bào mật độ cao đặc biệt nuôi dạng huyền phù Kết hợp kết trình bày mục 3.2 hình thành tinh thể xà cừ q trình ni, suốt 60 ngày nuôi cấy, tinh thể xuất nhiều môi trường 38 nuôi Theo quan điểm nhóm nghiên cứu, tinh thể thấy khơng phải ngun liệu cho hình thành lớp xà cừ bao phủ hạt nhân Bởi lẽ, tinh thể có kích thước lớn, tích tụ liên kết tiểu phần nhỏ nhiều Những thành phần bám bao phủ bề mặt hạt nhân tinh thể mà thành phần cực nhỏ, chúng nguyên liệu đơn phân tinh thể mà thấy Như liên hệ tinh thể thấy bao phủ xà cừ lên hạt nhân gì? Theo quan điểm nhóm nghiên cứu, xuất tinh thể hay số lượng tinh thể có ý nghĩa quan trọng việc đánh giá khả tạo ngọc in vivo lẫn in vitro lẽ dấu hiệu để biết khả tiết thành phần cần thiết để tạo xà cừ Hay nói cách khác, số lượng tinh thể nhiều, khả sản xuất thành phần xà cừ tế bào/lồi trai mạnh Hơn nữa, quan sát đĩa nuôi, bên cạnh hạt nhân hạt tinh thể ; điều gợi lên thành phần tạo xà cừ thay bám vào hạt nhân lắng tụ thành tinh thể dạng tự lơ lửng môi trường Việc kích thích hay biến đổi bề mặt để “thu hút” thành phần bám dính lên hạt nhân thay lắng tụ tự điểm mấu chốt để tạo hạt ngọc trai in vitro Dựa giải trình sáng chế tạo ngọc trai hai nhà khoa học Ấn Độ Seeni Naicker Dharmaraj Paulose Suja Cheruvathoor thuộc Harness, Dickey & Pierce P.L.C, chúng tơi thấy họ hóa giải việc kích thích bám dính cách cho tế bào màng áo bám dính lên hạt nhân Việc làm giúp họ thành công tạo hạt ngọc in vitro Ngồi họ cịn tạo nhiều màu sắc hạt ngọc ion kim loại khác Tóm lại, từ kết nghiên cứu bước đầu cho thấy điều kiện nghiên cứu nhóm nghiên cứu ni cấy, trì tế bào tiết xà cừ ; xà cừ bám dính lên bề mặt hạt nhân in vitro với hiệu thấp Song, kết thăm dò gợi mở cho khả tạo ngọc in vitro cải tiến kĩ thuật điều kiện 39 4.1 KẾT LUẬN Từ kết nghiệm thức trên, quy trình ni cấy sơ cấp tế bào biểu mô đề nghị sau : nhiệt độ nuôi cấy 24oC, môi trường ni cấy DMEM/F12 Sử dụng quy trình này: tế bào xuất sau 12 nuôi cấy, quần thể tế bào không đồng tốc độ tăng sinh Các tế bào nuôi môi trường xuất tinh thể xà cừ sau 30 ngày nuôi cấy Số lượng tinh thể xà cừ tăng dần suốt thời gian khảo sát (60 ngày) không phụ thuộc vào việc bổ sung chất EGF, FGF Ca2+ nồng độ khảo sát 4.2 ĐỀ NGHỊ Tiếp tục hồn thiện quy trình, pha chế môi trường tối ưu cho phát triển tế bào biểu mô ngọc trai Khảo sát chất khác có khả gây cảm ứng tăng cường tiết xà cừ Nghiên cứu thay đổi bề mặt hạt nhân nhằm tăng cường khả bám dính xà cừ vào bề mặt Nghiên cứu hóa, ni cấy huyền phù, tăng khả tiết xà cừ hướng đến tạo ngọc in vitro 40 Mayumi Endoh and Yasushi Hasegawa, Culture of mantle epithelial cells expressing shell matrix proteins from scallop Patinopecten yessoensis, Fisheries Science, Vol 72, Issue 6, pages 1277–1285, 2006 Shozo Tanaka, Hiroyuki Hatano and Osamu Itasaka, Biochemical Studies on Pearl IX Amino Acid Composition of Conchiolin in Pearl and Shell, Bulletin of the Chemical Society of Japan, Vol.33 , No.4 (1960) pages 543-545, 1959 Ningping Gong, Qi Li, Jing Huang, Zi Fang, Guiyou Zhang, Liping Xie and Rongqing Zhang, Culture of outer epithelial cells from mantle tissue to study shell matrix protein secretion for biomineralization, Cell And Tissue Research, Vol 333, No 3, pages 493501, 2008 Samata, T., Somiya, H., Horita, C & Akera, S (1994) SEM observation of microcrystals developed over black secretion on the cultured tissue of the pearl oyster Pinctada fucata Fish Sci.,60: 343-344 Suzuki, T., Mori, K (1991) Immunolocalization and in vitro secretion of hemolymph lectin of the pearl oyster Pinctada fucata martensii Zool Sci 8: 23 – 29 Tsukamoto, D., Sarashina, I., Endo, K, (2004) Structure and expression of an unusually acidic matrix protein of pearl oyster shells Biochem Biophys Res Commun 320: 1175 – 1180 Barik S K., Jena J K and Janaki Ram K., CaCO crystallization in primary culture of mantle epithelial cells of freshwater pearl mussel, Current Science, Vol 86, No 5, 10 March 2004 Chen H.T Xie L.P Yu Z.Y X G.R Zhang R.Q (2005) Chemical modifi cation studies on alkaline phosphatase from pearl oyster (Pinctada fucata): A substrate reaction course analysis and involvement of essential arginine and lysine residues at the active site, Int J Biochem Cell Biol 37: 1446 – 1457 Machii A and Wada K T (1989) Some marine invertebrates tissue culture In Invertebrate, Cell System Applications (ed Mitsuhashi, J.) CRC Press, Boca Raton, vol II: 225–233 ... trường TCM có tỉ lệ tế bào tăng sinh nhanh loại môi trường Có hai quần thể ưu tế bào giống tế bào hemocyte tế bào biểu mô Tỉ lệ tế bào biểu mô thấp (20,28%), tỉ lệ tế bào giống tế bào hemocyte cao... VII 29 30 33 34 35 37 THÔNG TIN CHUNG Tên đề tài: Thử nghiệm tạo ? ?tinh thể? ?? ngọc trai nuôi cấy sơ cấp tế bào biểu mô vỏ trai nước ống nghiệm (Sinanodonta jourdyi) Chủ nhiệm đề tài: Phạm Văn Phúc... cấu tạo nên ngọc trai Có nhiều nghiên cứu có mặt protein môi trường nuôi cấy tế bào tạo ngọc từ loài trai, trai nước mặn trai nước Sự hình thành biểu RNA 10 nhiều protein báo cáo nuôi cấy tế bào