Tổng hợp nano bạc bằng dịch nội bào saccharomyces cerevisiae

UỶ BAN NHÂN DÂN TP HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO NGHIỆM THU TỔNG HỢP NANO BẠC BẰNG DỊCH NỘI BÀO SACCHAROMYCES CEREVISIAE CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG ThS Trần Đăng Khoa PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CƠ QUAN QUẢN LÝ (Ký tên/đóng dầu xác nhận) CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dầu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 05/2016 Mục lục MỤC LỤC TĨM TẮT i SUMMARISE ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC HÌNH iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ vi PHẦN MỞ ĐẦU vii Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Định nghĩa, phân loại 1.2 Đặc điểm, tính chất hạt nano kim loại 1.3 Nano bạc 1.4 Phương pháp tổng hợp 1.4.1 Phương pháp vật lý 1.4.2 Phương pháp hóa học 1.4.3 Phương pháp sinh học 1.4.4 Một số nghiên cứu làm sở lý thuyết tổng hợp nano bạc phương pháp sinh học 1.4.4.1 Sự tham gia enzyme oxi hóa-khử 1.4.4.2 Sự tham gia acid amin có tính khử protein 11 1.4.4.3 Các chất có tính khử có mặt tế bào 11 1.5 Nghiên cứu giới Việt Nam 12 1.5.1 Trên giới 12 1.5.2 Ở Việt Nam 15 Mục lục 1.6 Ứng dụng nano bạc 16 1.7 Nấm men Saccharomyces cerevisiae 17 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 18 2.1 Vật liệu 19 2.2 Phương pháp 19 2.2.1 Môi trường nuôi cấy 19 2.2.2 Thu nhận sinh khối Saccharomyces cerevisiae 21 2.2.2.1 Phương pháp xác định đường cong tăng trưởng 21 2.2.2.2 Thu sinh khối 22 2.2.3 Thu nhận đánh giá dịch nội bào Saccharomyces cerevisiae 22 2.2.3.1 Phương pháp xác định lực khử theo Chen Yen (1995) 23 2.2.3.2 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp bradford 24 2.2.3.3 Xác định hàm lượng tyrosine 26 2.2.4 Khảo sát điều kiện cho trình tổng hợp dịch keo nano bạc từ dịch nội bào Saccharomyces cerevisiae 28 2.2.4.1 Tỉ lệ dịch nội bào: dung dịch bạc nitrate 28 2.2.4.2 Khảo sát pH phản ứng 28 2.2.4.3 Khảo sát nhiệt độ phản ứng 28 2.2.4.4 Khảo sát thời gian phản ứng 28 2.2.5 Phân tích số đặc điểm dịch keo nano bạc tổng hợp 28 2.2.5.1 Quang phổ UV-visible spectroscopy (UV-Vis) 28 2.2.5.2 Phân tích hình dạng kích thước hạt nano bạc 29 2.2.6 Khảo sát độ ổn định dịch keo nano bạc 29 2.2.7 Khảo sát khả kháng khuẩn dịch keo nano bạc tổng hợp 30 2.2.7.1 Định tính khả kháng khuẩn vòng kháng khuẩn 30 Mục lục 2.2.7.2 Định lượng khả kháng khuẩn phương pháp MBC - Minimum Bactericidal Concentration (nồng độ diệt khuẩn tối thiểu) 30 2.3 Sơ đồ thí nghiệm 31 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 32 3.1 Điều kiện thu nhận sinh khối dịch nội bào nấm men Saccharomyces cerevisiae 33 3.1.1 Nấm men S cerevisiae tăng trưởng môi trường Hansen 33 3.1.2 Nấm men S cerevisiae tăng trưởng môi trường rỉ đường 34 3.1.3 Khảo sát thời gian phá tế bào nấm men S cerevisiae 36 3.2 Kết khảo sát điều kiện cho trình tổng hợp dịch keo nano bạc dịch nội bào S cerevisiae 38 3.2.1 Khảo sát tỉ lệ dịch nội bào dung dịch AgNO3 1mM 38 3.2.2 Khảo sát giá trị pH dịch nội bào 39 3.2.3 Khảo sát nhiệt độ phản ứng 40 3.2.4 Khảo sát thời gian phản ứng 41 3.3 Khảo sát đặc điểm dịch keo nano bạc sau tổng hợp 41 3.4 Kết khảo sát khả kháng khuẩn dịch keo nano bạc 44 Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 4.1 Kết luận 47 4.2 Đề nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Tóm tắt TĨM TẮT Nano ngành khoa học kết nối nghiên cứu thuộc lĩnh vực khoa học vật lý, hóa học, sinh học khoa học vật liệu Nano kim loại vàng, bạc dùng làm chất kháng khuẩn, xúc tác, cảm biến sinh học, y học đồ gia dụng Hạt nano thường có kích thước nhỏ 100 nm tổng hợp theo nguyên tắc từ xuống lên gồm tổng hợp vật lý, hóa học sinh học Tổng hợp sinh học sử dụng hệ thống sống vi sinh vật, dịch chiết sinh khối thực vật, … Trong nghiên cứu này, sử dụng dịch nội bào nấm men Saccharomyces cerevisiae làm tác nhân khử bạc nitrate tạo bạc nano Tế bào S cerevisiae thu nhận sau 24 nuôi môi trường rỉ đường Dịch nội bào thu nhận cách sử dụng sóng siêu âm để phá vỡ tế bào Dịch keo nano bạc tổng hợp điều kiện: tỉ lệ dịch nội bào/dung dịch AgNO3 1/19 (v/v), pH dịch nội bào 11, nhiệt độ phản ứng 100 0C Hình ảnh TEM cho thấy hạt nano bạc tổng hợp có hình cầu, phân bố đều, có kích thước - nm Dịch keo nano bạc ổn định tốt 60 ngày bảo quản nhiệt độ phòng protein cịn diện dịch Ngồi ra, kết dịch keo nano bạc cịn có khả kháng chủng vi khuẩn khảo sát: Bacillus cereus, Salmonella typhi, Shigella sp and Staphylococcus aureus Từ kết nhận cho thấy ưu điểm tổng hợp nano bạc cách sử dụng dịch nội bào Saccharomyces cerevisiae: thân thiện với mơi trường, tiết kiệm lượng, chi phí rẻ, đơn giản, có sẵn chất tạo ổn định, áp dụng cho nhiều loại vi sinh vật - i- Summarise SUMMARISE Nano is an area of research which interlaces various disciplines of science such as physics, chemistry, biology and material science Mineral nanoparticles silver, gold are applied such as antibacterial agent, catalyst, biosensor, medicine and household goods, etc Nanoparticles are usually less than or equal to 100 nm and are commonly synthesized using top-down and bottom-up strategies including physical, chemical and biological methods Biosynthesis of silver nanoparticles using living organisms: microorganism, plant extract or biomass, etc In this study, Saccharomyces cerevisiae intracellular solution was used for reducing silver nitrate S cerevisiae was harvested after 24 hour culture in molasses medium; cell was disrupted by sonication during hour to collect intracellular solution Silver nanoparticle colloid was synthesized by mixing intracellular solution with silver nitrate solution (1 mM) and incubated; the rate of intracellular/AgNO3 solution (1/19 - v/v); pH of intracellular solution 11, and temperature reaction at 100 oC for hours TEM image showed silver nanoparticles had spherical shapes, uniform distribution, size – nm The colloid was not aggregated after 60 days kept at room temperature and protein still appeared Moreover, their anti bacteria activity was showed: against Bacillus cereus, Salmonella typhi, Shigella sp and Staphylococcus aureus Overall, using intracellular solution from S cerevisiae plays as reducing agent in the synthesis of silver nanopartilce that is the new method which owns many significant features such as easy acquisition, independence of microorganisms with Ag+, eco-friendly, energy-saving and low expenditure - ii - Danh mục chữ viết tắt DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Abs: Absorbance ddH2O: Double disstilled water MBC: Minimum bactericidal concentration rpm: Revolutions per minute tb: Tế bào TEM: Transmission electron microscope UV-Vis: Utraviolet – Visible - iii - Danh mục hình DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Một số hình dạng hạt nano Hình 1.2: Hình dạng hạt nano ảnh hưởng đến màu sắc quang phổ dịch keo nano bạc Hình 1.3: Kích thước hạt màu dịch keo nano vàng Hình 1.4: Kích thước hạt tỉ lệ thuận với bước sóng hấp thu cực đại Hình 1.5: Phổ hấp thu bề mặt plasmon dịch keo nano dạng hình cầu bạc, vàng đồng với giá bước sóng hấp thu cực đại tương ứng khoảng 400, 520 600 nm Hình 1.6: Mơ hình kỹ thuật từ xuống từ lên Hình 1.7: Cơ chế tạo bạc nguyên tử tế bào B licheniformis 10 Hình 1.8: Phản ứng tyrosine khử Ag+ thành Ag 11 Hình 1.9: Ảnh TEM cho thấy tác động nano bạc đến tế bào vi khuẩn - a, d: trước tiếp xúc với nano bạc; b, c, e, f: sau tiếp xúc với nano bạc 13 Hình 3.1: Ảnh TEM dịch keo nano bạc 42 Hình 3.2: Kết định tính ion Ag+ (A– HCl với dịch keo nano bạc; B – HCl AgNO3) 43 Hình 3.3: Kết điện di SDS-PAGE dịch keo nano bạc (1- đối chứng, 2- mẫu dịch keo nano bạc) 43 Hình 3.4: Khả kháng khuẩn 1-AgNO3; 2-dịch nội bào S cerevisiae; 3-nước cất; 4-dịch keo nano bạc chủng khảo sát 45 Hình 3.5: Khả kháng chủng Shigella sp dịch keo nano bạc tổng hợp từ dịch nội bào S cerevisiae nồng đồng độ khác 45 - iv - Danh mục bảng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Hàm lượng protein, tyrosine tổng lực khử có dịch nội bào S cerevisiae nuôi môi trường Hansen thời gian khác 34 Bảng 3.2: Hàm lượng protein, tyrosine tổng lực khử có dịch nội bào S cerevisiae nuôi môi trường rỉ đường 35 Bảng 3.3: So sánh hàm lượng protein, tyrosine tổng lực khử có dịch nội bào S cerevisiae thu nhận thời gian phá tế bào 37 Bảng 3.4: So sánh hàm lượng protein, tyrosine tổng lực khử có dịch nội bào S cerevisiae thu nhận từ phương pháp: sóng siêu âm nghiền học 38 Bảng3.5: Định tính khả kháng khuẩn chất thử nghiệm 44 - v- Danh mục biểu đồ đồ thị DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1: Đường cong tăng trưởng S.cereviase môi trường Hansen 33 Đồ thị 3.2: Đường cong tăng trưởng S.cereviase môi trường rỉ đường 35 Đồ thị 3.3: Quang phổ hấp thu dịch sau phản ứng tỉ lệ khác 39 Đồ thị 3.4: Quang phổ hấp thu dịch sau phản ứng pH dịch nội bào khác 39 Đồ thị 3.5: Quang phổ hấp thu dịch sau phản ứng nhiệt độ khác 40 Đồ thị 3.6: Quang phổ hấp thu dịch sau phản ứng thời gian khác 41 Đồ thị 3.7: Quang phổ hấp thu dịch nội bào (A) dịch keo nano bạc tổng hợp (B) 42 Đồ thị 3.8: Sự thay đổi quang phổ hấp thu theo thời gian dịch keo nano bạc tổng hợp theo (A) phương pháp hóa học; (B) (C) từ dịch nội bào S cerevisiae 43 BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Hàm lượng protein, tyrosine tổng lực khử có dịch nội bào S cerevisiae nuôi môi trường Hansen thời gian khác 34 Biểu đồ 3.2: Hàm lượng protein, tyrosine tổng lực khử có dịch nội bào S cerevisiae ni môi trường rỉ đường thời gian khác 36 Biểu đồ 3.3: Hàm lượng protein, tyrosine tổng lực khử có dịch nội bào S cerevisiae thu nhận thời gian phá tế bào 37 - vi - Tài liệu tham khảo TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1] Võ Nguyễn Nhã An (2008), Nghiên cứu số phương pháp phá vỡ tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae xác định thành phần sinh hóa học dịch trích nấm men phương pháp, Luận văn Thạc sĩ chuyên ngành Hóa sinh năm 2008, Trường ĐH KHTN – ĐH QG Tp.HCM [2] Lâm Thị Kim Châu, Văn Đức Chín, Ngơ Đại Nghiệp (2004), Thực tập lớn Sinh Hóa, NXB Đại học Quốc Gia Tp.HCM [3] Nguyễn Hồng Hải (2007), Các hạt nano kim loại, Vật lý Việt Nam, 1(1), 7-10 [4] Nguyễn Thị Mỹ Lan, Huỳnh Thị Phương Linh, Lê Thị Mỹ Phước, Nguyễn Quốc Hiến (2009), Bước đầu nghiên cứu hiệu ứng làm vết thương hỗn hợp chitosan tan nước – bacterial cellulose – nano bạc, Tạp chí phát triển KH&CN, 12(9), 61-67 [5] Nguyễn Thành Lợi, Tổng hợp xanh nano bạc vi tảo Pseudokirchneriella, Khóa luận Thạc sĩ chun ngành Cơng nghệ Hóa học năm 2014, Trường ĐH BK – ĐH QG Tp.HCM [6] Lê Thị Hồng Nhan, Vương Ngọc Chính, Âu Dương Ái Nhạn, Phan Thanh Sơn Nam (2012), Nghiên cứu điều kiện chế tạo nano bạc sử dụng dịch chiết hoa hồng Đà Lạt theo hướng hóa học xanh, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 50(3D), 764-770 [7] Lương Đức Phẩm (2006), Nấm men công nghiệp, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội [8] Phan Huê Phương (2010), Nghiên cứu sinh tổng hợp nano bạc sinh khối vi khuẩn B.subtilis B.licheniformis, Luận văn Thạc sĩ chuyên ngành Vi sinh, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên – ĐHQG Tp.HCM, Tp Hồ Chí Minh [9] Nguyễn Hoàng Ngọc Phương (2010), Nghiên cứu xây dựng quy trình tạo bạc nano theo phương pháp sinh học Fusarium oxysporum, Đề tài nghiên cứu thuộc quỹ Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ [10] Trần Linh Thước, Lê Thị Thúy Ái, Nguyễn Mỹ Phi Long (2009), Thực tập Vi sinh năm IV (lưu hành nội Trường ĐH KHTN Tp.HCM) TIẾNG ANH [11] Ahamed M., AlSalhi M.S., Siddiqui M.K.J (2010), Silver nanoparticle applications and human health, Clinica Chimica Acta, 411, 1841-1848 Tài liệu tham khảo [12] Al-Ghamdi H.S and Mahmoud W.E (2013), One pot synthesis of multi-plasmonic shapes of silver nanoparticles, Materials Letters, 105, 62-64 [13] Amendola V (2008), Sythesis of gold and silver nanoparticles for photonic applications, Ph.D thesis, University of Padova, Italya [14] Behera S., Debata A., Nayak P.L (2011), Biomedical Applications Of Silver Nanoparticles, Journal of Asian Scientific Research, 1(1), 27-56 [15] Costa C., Conte A., Bounocore G.G, Del Nobile M.A (2011), Antimicrobial silvermontmorillonite nanoparticles to prolong the shelf life of fresh fruit salad, International Journal of Food Microbiology, 148, 164-167 [16] Edison T.J.I and Sethuraman M.G (2012), Instant green synthesis of silver nanoparticles using Terminalia chebula fruit extract and evaluation of their catalytic activity on reduction of methylene blue, Process Biochemistry 47, 1351-1357 [17] Elbeshehy E K F., Elazzazy A M., Aggelis G (2015), Silver nanoparticles synthesis mediated by new isolates of Bacillus spp., nanoparticle characterization and their activity against Bean Yellow Mosaic Virus and humanpathogens, Frontier in Microbiology, 6:453, 1-13 [18] Elechiguerra J.L., Burt J.L., Morones J.R., Camacho-Bragodo A., Gao X., Lara H.H., Yacaman M.J (2005), Interaction of silver nanoparticles with HIV-1, Journal of Nanobiotechnology, 3(6) [19] Faramarzi M.A and Forootanfar H (2011), Biosynthesis and characterization of gold nanoparticles produced by laccase from Paraconiothyrium varibale, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 87, 23-27 [20] Fayaz M., Tiwary C.S., Kalaichelvan P.T., Venkatesan (2010), Blue orange light emission from biogenic synthesized silver nanopartilces using Trichoderma viride, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 75, 175-178 [21] Gopinath V and Velusamy P (2013), Extracellular biosynthesis of silver nanoparticles using Bacillus sp GP-23 and evaluation of their antifungal activity towards Fusarium oxysporum, Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 106, 170-174 [22] Gurunathan S., Kalishwaralal K., Vaidyanathan R., Deepak V., Pandian S.R.K., Muniyandi J., Hariharan N., Eom S.H (2009), Biosynthesis, purification and characterization of silver naoparticles using Escherichia coli, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 74, 328-335 Tài liệu tham khảo [23] Hassan K., Soudabeh M., Rasoul M J., Meraj P., Siavash I (2014), Biosynthesis of siver nanoparticles using Saccharomyces cerevisiae, Artificial Cells Nanomedicine and Biotechnology, Early Online: -5 [24] Hoang L., Vuong N.C., Phan T.S.N (2012), Synthesis of silver nanoparticles using Hibiscus esculentus L Seed extract as a green reducing agent, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 50(3A), 96-101 [25] Hosseini-Abari A., Emtiazi G., Lee S.H., Kim B.G., Kim J.H (2014), Biosynthesis of silver nanoparticles by Bacillus stratosphericus spores and the role of dipicolinic acid in this process, Applied Biochemistry and Biotechnology, 174(1), 270-282 [26] Inamdar S (1994), Effect of pretreatment of molasses and posttreatment of fermented broth in industrial production of ethanol, Applied Biochemistry and Biotechnology, 45, 181-187 [27] Jain J., Arora S., Rajwade J.M., Omray P., Khandelwal S., Paknikar K.M (2009), Silver nanoparticles in Therapeutics: Development of an Antimicrobial Gel Formulation for Topical Use, Molecular Pharmaceutics, 6(5), 1388-1401 [28] Jayaseelan C., Rahuman A.A., Rajakumar G., Kirthi A.V., Santhoshkumar T., Marimuthu S., Bagavan A., Kamaraj C., Zahir A.A., Elango G (2011), Synthesis of pediculocidal and larvicidal silver nanoparticles by leaf extract from heartleaf moonseed plant, Tinospora cordifolia Miers, Parasitol Res, 109, 185-194 [29] Jha A.K., Prasad K., Prasad K (2009), A green low-cost biosynthesis of Sb2O3 nanoparticles, Biochemical Engineering Jounal, 43, 303-306 [30] Kalimuthu K., Babu R.S., Venkataraman D., Bilal M., Gurunathan S (2008), Biosynthesis of silver nanocrystals by Bacillus licheniformis, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 65, 150-153 [31] Kannan N., Mukunthan K.S., Balaji S (2011), A comparative study of morphology, reactivity and stability of synthesized silver nanoparticles using Bacillus subtilis and Catharanthus roseus (L.) G Don, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 86, 378383 [32] Kholoud M.M., Abou E., Ala‟a E., Abdulrhman A., Reda A.A.A (2010), Sythesis and Applications of Silver Nanoparticles, Arabian Journal of Chemistry, 3, 135-140 [33] Korbekandi H and Iravani S (2012), Chapter 1: Silver nanoparticles, The delivery of nanoparticles, 3-36 Tài liệu tham khảo [34] Kumar C.G and Mamidyala S.K (2011), Extracellular synthesis of silver nanoparticles using culture supernatant of Pseudomonas aeruginosa, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 84, 462-466 [35] Kumar S.A., Abyaneh M.K., Gosavi S.W., Kulkami S.K., Pasricha R., Ahmad A., Khan M.I (2007), Nitrate reductase-mediated synthesis of silver nanoparticles from AgNO3, Biotechnol Lett, 29, 439-445 [36] Li W.R., Xie X.B., Shi Q.S., Zeng H.Y., OU-Yang Y.S., Chen Y.B (2010), Antibacterial activity and mechanism of silver nanoparticles on Escherichia coli, Appl Microbiol Biotechnol, 85, 1115-1122 [37] Liu J., Ratnayake K., Joyce D.C., He S., Zhang Z (2012), Effects of three different nano-silver formulations on cut Acacia holosericea vase life, Postharvest Biology and Technology, 66, 8-15 [38] Lü P., Cao J., He S., Liu J., Li H., Cheng G., Ding Y., Joyce D.C (2010), Nanosilver pulse treatments improve water relations of cut rose cv Movie Star flowers, Postharvest Biology and Technology, 57, 196-202 [39] Mavani K and Shah M (2013), Synthesis of Silver Nanoparticles by using Sodium Borohydride as a Reducing Agent, International Journal of Engineering Research & Technology, 2(3), 1-5 [40] Maynard T and Baxter D (2007), Nanotechnology: Recent developments, ricks and opportunities, Lloyd‟s, London [41] Mirzajani F., Askari H., Hamzelou S., Farzaneh M., Ghassempour A (2013), Effect of silver nanoparticles on Oryza sativa L and its rhizosphere bacteria, Ecotoxicology and Environmental Safety, 88, 48-54 [42] Mittal A.K., Chisti Y., Banerjee U.C (2013), Synthesis of metallic nanoparticles using plant extracts, Biotechnology Advances, 31, 346-356 [43] Narayanan K.B and Sakthivel N (2011), Green synthesis of biogenic metal nanoparticles by terrestrial and aquatic phototrophic and heterotrophic eukaryotes and biocompatible agents, Advances in Colloid and Interface Science 169, 59–79 [44] Prathna T.C., Lazar M., Chandrasekaran N., Ashok M R., Amitava M (2010), Chapter 1: Biomimetic Synthesis of Nanoparticles: Science, Technology & Applicability, Biomimetics Learning from Nature, 1-20 [45] Rafi Z.N and Ramezanian A (2013), Vase life of cut rose cultivars „Avalanche‟ and „Fiesta‟ as affected by Nano-Silver and S-carvone treatments, South African Journal of Botany, 86, 68-72 Tài liệu tham khảo [46] Saifuddin N., Wong C.W., Yasumira A.A.N (2009), Rapid Biosynthesis of Silver Nanoparticles Using Culture Supernatant of Bacteria with Microwave Irradiation, EJournal of Chemistry, 6(1), 61-70 [47] Schröfel A and Kratošová G (2011), Biosynthesis of Metallic Nanoparticles and Their Applications, Fundamental Biomedical Technologies, 5, 373-409 [48] Silvestrini S., Carofiglio T., Maggini M (2013), Shape-selective growth of silver nanoparticles under continuous flow photochemical conditions, Chem Commun., 49, 84-86 [49] Singh B.R., Dwivedi S., Al-Khedhairy A.A., Musarrat J (2011), Synthesis of stable cadmium sulfide nanoparticles using surfactin produced by Bacillus amyloliquifaciens strain KSU-109, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 85, 207213 [50] Singh P and Raja R.B (2011), Biological Synthesis and Characterization of Silver Nanoparticles Using the Fungus Trichoderma harzianum, Asian J Exp Biol Sci, 2(4), 600-605 [51] Sonal S B., Swapnil C G., Aniket K., G., Mahendra K R (2010), Rapid synthesis of silver nanoparticles from Fusarium oxysporum by optimizing physicocultural conditions, The Scientific World Journal, – 12 [52] Sridhara V., Pratima K., Krishnamurthy G., Sreekanth B (2013), Vegetable assisted synthesis of silver nanoparticles and its antibacterial activity against two human pathogens, Asian journal of pharmaceutical and clinical research, 6(2), 53-57 [53] Stamplecoskie K.G and Scaiano J.C (2010), Light Emitting Diode Irradiation Can Control the Morphology and Optical Properties of Silver Nanoparticles, J Am Chem Soc., 132(6), 1825-1827 [54] Tran H.V., Tran L.D, Ba C.T., Vu H.D., Nguyen T.N., Pham D.G., Nguyen P.X (2010), Synthesis, characterization, antibacterial and antiprofilerative activities of monodisperse chitosan-based silver nanoparticles, Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 360, 32-40 [55] Vahabi K., Mansoori G.A., Karimi S (2011), Biosynthesis of Silver Nanoparticles by Fungus Trichoderma reesei, Insciences J., 1(1), 65-79 [56] Vaidyanathan R., Gopalram S., Kalishwaralal K., Deepak V., Pandian S.R.K., Gurunathan S (2010), Enchancedsilver synthesis by optimization of reductase activity, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 75, 335-341 Tài liệu tham khảo [57] Yao-Chang L., Sin-Jia C., Cheng-Liang H (2010), Finding a facile method to synthesize decahedral silver nanoparticles through a systematic study of temperature effect on photomediated silver nanostructure growth, Journal of the Chinese Chemical Society, 57 (3A), 325 – 331 [58] Yen G.C., Chen H.Y (1995), Antioxidant activity of various tea extracts in relation to their antimutagenicity, J Agric Food Chem, 43, 27-32 [59] Zaheer Z and Rafiuddin (2012), Silver nanoparticles formation using tyrosine in presence cetyltrimethylammonium bromide, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 89, 211-215 [60] Zeng S., Yong K.T., Roy I., Dinh X.Q., Yu X., Luan F (2011), A Review on Functionalized Gold Nanoparticles for Biosensing Applications, Plasmonics, 6, 491506 [61] Zhao G and Stevens S.E (1998), Multiple parameters for the comprehensive evaluation of the susceptibility of Escherichia coli to the silver ion, BioMetals, 11, 27-32 [62] http://www.google.com/patents/CN103555769A?cl=en Phụ lục chun mơn PHỤ LỤC CHUN MƠN Phụ lục chuyên môn Phụ lục 1: Sự tƣơng quan log (tế bào/ml) OD610 Bảng 1: Mối tương quan log (tế bào/ml) OD610 môi trường Hansen OD610 0,106 0,206 0,308 0,403 0,505 Log (tế bào/ml) 6,11 6,39 6,60 6,75 6,89 y = 1.931x + 5.955 R² = 0.977 Log (tế bào/ml) 7.00 6.90 6.80 6.70 6.60 6.50 6.40 6.30 6.20 6.10 6.00 0.1 0.2 0.3 OD 0.4 0.5 0.6 Đồ thị 1: Đồ thị thể mối tương quan log (tế bào/ml) OD610 Bảng 2: Mối tương quan log (tế bào/ml) OD610 môi trường rỉ đường OD610 0,106 0,200 0,301 0,401 0,508 Log (tế bào/ml) 6,15 6,32 6,55 6,76 6,88 Đồ thị 2: Đồ thị thể mối tương quan log (tế bào/ml) OD610 Phụ lục chuyên môn Phụ lục 2: Đƣờng chuẩn saccharose theo phƣơng pháp phenol Bảng 3: Kết giá trị OD490 xây dựng đường chuẩn saccharose Nồng độ (µg/ml) 10 20 30 40 50 60 70 OD 0,280 0,364 0,437 0,518 0,613 0,672 0,747 0,183 0.7 y = 0.008x R² = 0.996 0.6 OD 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Nồng độ (g/ml) Đồ thị 3: Đường chuẩn saccharose Phụ lục 3: Đƣờng chuẩn tyrosine Bảng4: Kết giá trị OD660 xây dựng đường chuẩn tyrosine 0,2 0,4 0.6 0.8 OD 0,016 0,281 0,543 0,73 0,936 1,103 OD Hàm lương tyrosine (µmol) 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 y = 1.143x R² = 0.987 0.5 Hàm lượng tyrosine (mol) Đồ thị 4: Đường chuẩn tyrosine 1.5 Phụ lục chuyên môn Phụ lục 4: Đƣờng chuẩn bradford Bảng 5: Kết giá trị OD595 xây dựng đường chuẩn bradford Nồng độ (µg/ml) 10 20 30 40 50 OD 0,073 0,107 0,141 0,167 0,208 0,232 y = 0.003x R² = 0.996 0.18 0.16 0.14 OD 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 20 40 60 Nồng độ (g/ml) Đồ thị 5: Đường chuẩn bradford Phụ lục 5: Xác định độ pha loãng enzyme Bảng 6: Hàm lượng tyrosine sinh phản ứng thủy phân khảo sát nồng độ pha loãng enzyme Độ pha loãng enzyme (lần) Hàm lượng tyrosine (g) 50 547,16  3,44 100 150 200 250 300 548,52 545,80 528,15 496,92 476,56  0,91  3,26  1,09  2,17  2,71 350 400 468,41  1,99 441,26  0,36 Phụ lục chuyên môn 600 Lượng tyrosine (g) 500 400 300 200 100 50 100 150 200 250 300 350 400 Độ pha loãng enzyme (lần) Biểu đồ 1: Tương quan hàm lượng tyrosine sinh độ pha loãng enzyme Phụ lục sản phẩm PHỤ LỤC SẢN PHẨM Phụ lục sản phẩm A QUY TRÌNH TỔNG HỢP DỊCH KEO NANO BẠC (Số lượng: lít) Bước 1: Ni cấy mấm men thu nhận sinh khối - Nấm men giữ giống ống thạch nghiêng, hoạt hóa giống mơi trường Hasen - Chuẩn bị 500 ml môi trường rỉ đường, chia vào bình ni cấy Lượng đường tổng rỉ 12,5 g, CO(NH2)2 0,25 g MgSO4.7H2O 1,5 g - Cấy giống 10 % (v/v), nuối cấy lắc 24 giờ, ly tâm thu sinh khối, sinh khối rửa với nước cất lần, bảo quản lạnh 0C Bước 2: Thu nhận dịch nội bào - Cân g sinh khối nấm men, huyền phù với cất lần, nồng độ 10 % (w/v) - Phá tế bào sóng siêu âm (Sonicator S-4000, Misonix): cường độ 80 kHz, chu kỳ phá 30 giây, nghỉ 30 giây, tổng thời gian phá 60 phút - Ly tâm 15000 vòng/phút phút 15 phút, 10 0C, để thu nhận dịch nội bào, bảo quản 0C Bước 3: Tổng hợp dịch keo nano bạc - Dịch nội bào chỉnh pH 11 Na2CO3 M - Sử dụng 50 ml dịch nội bào chỉnh pH cho vào 950 ml dung dịch AgNO3 mM (tỷ lệ 1:19) - Hỗn hợp lắc bể ổn nhiệt 100 0C - Sau kết thúc phản ứng Bước 4: Kiểm tra bảo quản dịch keo nano bạc - Quan sát: dung dịch có màu vàng nâu đặc trưng, - Dùng quang phổ UV-Vis xác định đỉnh hấp thu cực đại (400 - 450 nm) - Dùng kỹ thuật TEM xác định kích thước hạt - Lấy dung dịch keo nhỏ vào ống nghiệm chứa HCl 6N, khơng có kết tủa trắng đạt yêu cầu - Bảo quản nhiệt độ phịng Phụ lục sản phẩm  Quy trình đƣợc tóm tắt nhƣ sau: B Bài báo Trần Đăng Khoa, Đồn Thị Lành, Lại Thị Phương Chi, Ngơ Đại Nghiệp, Khảo sát điều kiện tổng hợp nano bạc dịch nội bào Saccharomyces cerevisiae, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 53 (4C), 2015, 32 – 42 C Kết đào tạo Khóa luận cử nhân sinh học Đồn Thị Lành Lại Thị Phương Chi Phụ lục quản lý PHỤ LỤC QUẢN LÝ ... kiện cho trình tổng hợp dịch keo nano bạc từ dịch nội bào Saccharomyces cerevisiae 2.2.4.1 Tỉ lệ dịch nội bào: dung dịch bạc nitrate Thực theo dãy tỷ lệ dịch nội bào: dung dịch bạc nitrate: 0,5:19,5;... tạo bạc nano Tế bào S cerevisiae thu nhận sau 24 nuôi môi trường rỉ đường Dịch nội bào thu nhận cách sử dụng sóng siêu âm để phá vỡ tế bào Dịch keo nano bạc tổng hợp điều kiện: tỉ lệ dịch nội bào/ dung... 26 2.2.4 Khảo sát điều kiện cho trình tổng hợp dịch keo nano bạc từ dịch nội bào Saccharomyces cerevisiae 28 2.2.4.1 Tỉ lệ dịch nội bào: dung dịch bạc nitrate 28 2.2.4.2 Khảo sát