- 19 -
2.1 Vật liệu
Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae từ phịng thí nghiệm Bộ mơn
Sinh hóa, Khoa Sinh học – Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐH QG Tp.HCM.
Các chủng vi khuẩn gây bệnh: Bacillus cereus, Salmonella typhi, Shigella
sp., Staphylococcus aureus từ phịng thí nghiệm Bộ mơn Sinh hóa, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐH QG Tp.HCM.
Enzyme alcalase mua tại cơng ty Brenntag Việt Nam (202 Hồng Văn Thụ phường 9 – Quận Phú Nhuận) với các thông số: hoạt tính 85960 UI/ml, hoạt động tốt ở nhiệt độ 60 0
C, pH: 7 – 8, thời gian 30 – 60 phút.
2.2 Phƣơng pháp
2.2.1 Môi trƣờng nuôi cấy
Môi trường Hansen (1000 ml): glucose 50 g, pepton 10 g, KH2PO4 3 g, MgSO4.7H2O 2g.
Môi trường rỉ đường (1000 ml): lượng đường tổng trong rỉ 25 g, CO(NH2)2 0,5 g, MgSO4.7H2O 3 g.
Xử lý rỉ đƣờng trƣớc khi pha môi trƣờng theo Inamdar S.(1994) [26]:
Nguyên tắc
Rỉ đường trước khi sử dụng cần được xử lý để loại bỏ bớt chất keo, chất lơ lửng, và một số chất có hại cho sự tăng trưởng của nấm men. Hệ keo trong rỉ đường được hình thành từ protein và pectin. Hệ keo này thường tạo ra độ nhớt cao và làm cản trở quá trình trao đổi chất của nấm men. Nếu hệ keo này không bị phá hủy sẽ gây ra hiện tượng thối hóa, tế bào phát triển và sinh sản kém. Hiệu suất sinh khối thu được cũng thấp. Bên cạnh đó nếu hệ keo này khơng được loại bỏ thì sản phẩm sinh khối sau khi thu được sẽ bám đầy dịch keo làm cho sản phẩm có màu vàng đậm của rỉ.
- 20 -
Hóa chất
Dung dịch: H2SO4 0,5 N, NaOH 1 N
Thực hiện
Pha loãng rỉ với nước cất tỷ lệ 1:2 (v:v), acid hóa dung dịch rỉ đường sau pha lỗng bằng H2SO4 0,5 N, thêm acid vào khuấy đều. Đun hỗn hợp ở nhiệt độ 70 0C trong 30 phút, trong thời gian gia nhiệt khuấy thường xuyên. Sau đó ly tâm 5000 vòng/ phút trong 10 phút, ở 20 0
C thu dịch bỏ tủa. Chỉnh dung dịch sau xử lý về pH = 5,5 - 6 với NaOH 1 N.
Xác định hàm lƣợng đƣờng tổng theo phƣơng pháp phenol [2]
Nguyên tắc
Sự định phân này căn bản dựa trên phản ứng màu đặc trưng của đường và phenol với sự có mặt của H2SO4 đậm đặc.
Hóa chất
Dung dịch: saccharose chuẩn 1 mg/ml; phenol 5 %, H2SO4 đậm đặc.
Thực hiện
Dựng đường chuẩn: lấy 5 bình định mức100 ml, cho vào đó theo thứ tự: 2, 4, 6, 8 và 10 ml dung dịch saccharose 1 mg/ml; cho nước cất tới vạch mức. Từ mỗi bình hút ra 1 ml, cho thêm 1 ml dung dịch phenol 5 %. Cẩn thận cho thêm 5 ml H2SO4 đậm đặc. Để 10 phút rồi lắc đều, giữ tiếp 10-15 phút ở nhiệt độ phòng để xuất hiện màu. Trong mỗi ống nghiệm sẽ có lượng tương ứng 20, 40, 60, 80 và 100 μg saccharose. Làm tương tự ống đối chứng không chứa saccharose. Đem đo mật độ quang ở bước sóng 490 nm, vẽ đồ thị chuẩn.
Xác định đường trong mẫu: Hút 1ml dịch chiết vỏ quả thanh long, tiến hành tương tự như bước xây dựng đường chuẩn saccharose, pha lỗng khi giá trị OD nằm ngồi đường chuẩn.
Tính tốn
Dựa vào đường chuẩn saccharose suy ra hàm lượng đường tổng chứa trong dịch rỉ đường.
- 21 -
2.2.2 Thu nhận sinh khối Saccharomyces cerevisiae
Chủng nấm men S. cerevisiae được nuôi trong môi trường Hansen và rỉ đường, xác định đường cong tăng. Trong mỗi pha tăng trưởng, đặc tính của tế bào gần như nhau, vì vậy chúng tơi chọn thời điểm thu nhận sinh khối ở giao hai pha và giữa mỗi pha (không khảo sát đầu pha tăng trưởng và cuối pha suy tàn).
2.2.2.1 Phƣơng pháp xác định đƣờng cong tăng trƣởng [10]
Nguyên tắc
Sự tăng trưởng của vi sinh vật là sự gia tăng số lượng tế bào vi sinh vật trong quần thể và tốc độ tăng trưởng là sự tăng trưởng của vi sinh vật trong một đơn vị thời gian. Khoảng thời gian để hình thành hai tế bào từ một tế bào được gọi là thời gian thế hệ hay thời gian tăng đôi. Động thái tăng trưởng của quần thể vi sinh vật bắt đầu từ pha tiềm tàng (lag phase). Sau đó, sự tăng trưởng bắt đầu (log phase) đi vào ổn định (exponential phase). Nếu tiếp tục được nuôi cấy, các tế bào chết dần và đi vào pha suy tàn (death phase). Các thông số này là nét đặc trưng riêng và thay đổi cho từng chủng loại vi sinh vật.
Xây dựng đƣờng tƣơng quan giữa mật độ tế bào và OD610
Đếm số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu, số lượng tế bào được tính theo cơng thức sau:
10 10 10 400 3 x b a n
với n: số tế bào trong 1ml (tb/ml) a: số tế bào đếm trong 5 ô lớn b: số ô nhỏ (80)
x: độ pha loãng
Thực hiện pha loãng dịch tăng sinh tế bào nấm men sao cho thu được các huyền phù có OD610 là 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. Sau đó pha lỗng bậc 10 và tiến hành đếm số lượng tế bào. Xây dựng đường tương quan giữa mật độ tế bào (log (tb/ml)) và OD610
- 22 -
Theo dõi sự tăng trƣởng theo thời gian
Nuối lắc nấm men trong bình chứa 100 ml mơi trường ở 37oC, lượng giống 10 % (v/v). Sự tăng trưởng của nấm men được theo dõi sau mỗi giờ bằng cách thu mẫu bằng ống hút vô trùng, đo mật độ quang OD610. Pha loãng mẫu nếu giá trị OD610 vượt khoảng 0,1 – 0,5.
Sử dụng đường tương quan tuyến tính giữa OD610 và mật đố tế bào nấm men (log (tb/ml)) để suy ra mật độ tế bào ở mỗi thời điểm khảo sát. Vẽ đường cong tăng trưởng của giống bằng đồ thị biểu diễn hàm số log (tb/ml) theo thời gian. Xác định thời gian của các pha.
2.2.2.2 Thu sinh khối
Tại thời điểm thu nhận sinh khối, canh trường nấm men được ly tâm với tốc độ 15000 vòng/phút trong vòng 15 phút ở 10 0C, loại bỏ dịch nổi, thu sinh khối và rửa lại với nước cất hai lần. Sinh khối được bảo quản ở 4 0C.
2.2.3 Thu nhận và đánh giá dịch nội bào Saccharomyces cerevisiae
Sinh khối nấm men được huyền phù với được cất 2 lần, nồng độ 10 % (w/v), tiến hành phá tế bào bằng sóng siêu âm (Sonicator S-4000, Misonix), cường độ 80 kHz, một chu kỳ phá là 30 giây, nghỉ 30 giây, tổng thời gian phá tế bào được khảo sát từ 15 phút cho đến 75 phút (mỗi nghiệm thức cách nhau 15 phút), sau đó ly tâm 15000 vịng/phút phút trong 15 phút, 10 0C, để thu nhận dịch nội bào, bảo quản ở 4
0C. So sánh với phương pháp nghiền cơ học bổ sung vụn thủy tinh.
Trên cơ sở các yếu tố tham gia vào quá trình tổng hợp nano đã nêu trên và kết quả nghiên cứu của Hosseini-Abari A. và cộng sự (2014) [25], cho thấy các enzyme oxy hóa-khử khi hoạt động thường cần có cofactor, địi hỏi điều kiện đảm bảo hoạt tính nghiêm ngặt (dung dịch đệm, nhiệt độ,...); một số enzyme cần được cảm ứng, trong điều kiện ni cấy bình thường khơng được tổng hợp hoặc chỉ đặc trưng cho từng chủng vi sinh vật. Do đó, hoạt tính enzyme oxi hóa-khử khơng khảo sát mà dùng giá trị năng lực khử để đánh giá khả năng khử của tất cả các chất có trong dịch nội bào. Hàm lượng protein và tyrosine cũng được xác định với mục tiêu khẳng định có sự tham gia của chúng trong quá trình khử tạo bạc nano và ổn định
- 23 -
dịch keo. Từ các giá trị năng lực khử, hàm lượng protein và tyrosine sẽ chọn thời điểm thu nhận tế bào cũng như thu nhận dịch nội bào.
2.2.3.1 Phƣơng pháp xác định năng lực khử theo Chen và Yen (1995) [58]
Nguyên tắc:
Năng lực khử của một chất là khả năng chất đó cho điện tử khi tham gia vào phản ứng oxy hóa khử. Trong phương pháp của Yen và Chen (1995), chất khử sẽ khử potassium ferricyanide (K3[Fe(CN)6]) thành potassium ferrocyanide (K4[Fe(CN)6]) nói cách khác ion Fe3+ trong phân tử potassium ferricyanide sẽ bị khử thành Fe2+
trong phân tử potassium ferrocyanide [58]. Phương trình phản ứng như sau:
Sau đó, bổ sung Fe3+
tạo thành 1 phức hợp ferric ferrocyanide màu xanh có cơng thức là Fe4[Fe(CN)6]3 cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng ion ferrocyanide, tức là tỉ lệ với khả năng khử của hợp chất thử nghiệm.
Hóa chất:
Dung dịch potassium ferricyanide K3[Fe(CN)6] 1 % Dung dịch TCA 10 %
Dung dịch FeCl3 1 %
Dung dịch đệm sodium phosphate 0,2 M pH = 6,6
Pha dung dịch Na2HPO4 0,2 M: cân 14,3256 g Na2HPO4.12H2O, thêm nước cất định mức cho đủ 200 ml.Pha dung dịch NaH2PO4 0,2 M: cân 6,2404 g NaH2PO4.12H2O, thêm nước cất định mức cho đủ 200 ml.Pha hổn hợp 2 dung dịch Na2HPO4 0,2 M và NaH2PO4 0,2 M, chỉnh về pH 6,6.
Chất khử X
K3[Fe(CN)6] K4[Fe(CN)6]
- 24 -
Tiến hành thực hiện:
Ống nghiệm (lặp lại 3 lần) Đối chứng Mẫu
Dịch phá tế bào (ml) 0 1
Thể tích nước (ml) 1 0
Dung dịch đệm sodium phosphate 0,2 M pH 6 (ml) 0,5 0,5 Dung dịch K3[Fe(CN)6] 1 % (ml) 0,5 0,5
Lắc đều, ổn nhiệt 50 0C trong thời gian 20 phút
Dung dịch TCA 10 % (ml) 0,5 0,5
Lọc loại bỏ kết tủa
Dịch lọc (ml) 1 1
Nước cất (ml) 2,5 2,5
Dung dịch FeCl3 1 % (ml) 0,5 0,5
Lắc đều đo ở bước sóng 700 nm
Tính tốn kết quả:
Hiệu số của OD ống mẫu trừ cho OD ống đối chứng là giá trị năng lực khử. Hiệu số càng cao, năng lực khử càng mạnh.
2.2.3.2 Xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Bradford [2]
Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie brilliant blue khi tạo phức hợp với protein trong dung dịch mang tính acid, khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng 595 nm. Độ hấp thu ở bước sóng 595 nm tỉ lệ thuận với nồng độ protein.
Hóa chất
Thuốc thử Bradfrod: Coomassie brilliant blue 0,001 % (w/v), Ethanol tuyệt đối 5 % (w/v), H3PO4 8,5 % (w/v).
- 25 -
Tiến hành
Xây dựng đường chuẩn (chú ý rửa sạch curvett bằng cồn, tráng lại bằng nước cất khi thay đổi mẫu đo).
Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5
Nồng độ albumin (µ/ml) 0 10 20 30 40 50 Dung dịch albumin 0,1 mg/ml (ml) 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
ddH2O (ml) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5
Thực hiện 2 lơ thí nghiệm, mỗi lơ 6 ống nghiệm đánh số theo thứ tự
Thí nghiệm 1 0a 1a 2a 3a 4a 5a
Thí nghiệm 2 0b 1b 2b 3b 4b 5b
Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian không phút, cho 5ml thuốc thử Bradford vào ống nghiệm 0a, lắc điều để yên. Ở thời điểm một phút cho 5ml thuốc thử vào ông nghiệm 0b, lắc điều để yên. Thực hiện bổ sung 5 ml thuốc thử lần lượt vào các ống 1a, 1b …5a, 5b ở các thời điểm cách nhau một phút. Đến thời điểm 11 phút, cho 5 ml thuốc thử vào ống 5b lắc đều để yên. Tính thời gian ống 0a được 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 595 nm. Tuần tự đo OD595 ở các ống còn lại với thời gian giãn cách 1 phút giữa các ống.
Lấy giá trị trung bình của 2 ống a và b.
Lấy OD595 của ống thử thật trừ OD595 của ống thử không được ∆OD595. Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein với ∆OD595.
Tính hàm lượng protein trong mẫu thu được. Việc đo mẫu cũng tiến hành tương tự với thời gian phản ứng là 20 phút. Mẫu được pha loãng sao cho giá trị ∆OD595 nằm trong đường chuẩn.
Tính tốn
Hàm lượng protein trong dung dịch được tính theo cơng thức: mg protein/ml = a.10-3.n
với a: nồng độ protein trong mẫu suy ra từ đường chuẩn (µg/ml) n: hệ số pha loãng
- 26 -
2.2.3.3 Xác định hàm lƣợng tyrosine
Dịch nội bào ở các thời điểm được thủy phân bằng enzyme alcalase (Brenntag, Việt Nam), sử dụng enzyme để thủy phân sẽ làm giảm sự hỏng amino acid, sản phẩm sau thủy phân được xác định hàm lượng tyrosine tổng bằng phương pháp bắt màu với thuốc thử Folin-Ciocalteu [2].
Enzyme được pha loãng từ 50 đến 400 lần (mỗi nghiệm thức cách nhau 50 đơn vị). Tiến hành thủy phân trong 30 phút, xác định lượng tyrosine để chọn nồng độ pha lỗng thích hợp.
Nguyên tắc
Ở môi trường kiềm, tyrosine bắt màu với thuốc thử Folin-Ciocalteu tạo phức màu xanh, cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ tyrosine.
Hóa chất
Tyrosin chuẩn 1 mM; HCl 0,2 N; NaOH 0,5 N; TCA 10 %; thuốc thử Folin.
Tiến hành
Xây dựng đường chuẩn tyrosine:
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5
Thể tích tyrosine 1 mM (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Dung dịch HCl 0,2 N (ml) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Dung dịch NaOH 0,5 N (ml) 2 2 2 2 2 2 Thuốc thử Folin (ml) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 Hàm lượng tyrosine (µmol) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Lắc đều và để yên 10 phút, sau đó xác định mật độ quang ở bước sóng 660 nm. Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên mật độ quang (OD) theo lượng tyrosine ở các ống.
- 27 -
Thực hiện 2 lô phản ứng như sau:
Dung dịch hóa chất Ống nghiệm
Mẫu (3 ống) Đối chứng (3 ống)
Cơ chất 2 2
TCA 10 % (ml) 0 2
Enzyme (ml) 0,2 0
Lắc đều, giữ nhiệt độ thích hợp 600C, 30 phút.
TCA 10 % (ml) 2 0 Enzyme (ml) 0 0,2 Lắc đều, lọc thu dịch Dịch lọc 1 1 Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 2 2 Thuốc thử Folin (ml) 0,6 0,6
Lắc đều 10 phút đem đo mật độ quang ở bước sóng 660 nm
Tính tốn
Lấy OD mẫu trừ OD đối chứng được giá trị OD, sau đó dựa vào đường chuẩn suy ra số µmol tyrosine có trong 1ml dịch lọc.
Lượng tyrosine 181,19
v V m
x (g)
Với x: số µmol tyrosine suy ra từ đường chuẩn. m: độ pha lỗng mẫu (lần)
V: thể tích phản ứng (4,2 ml) v: thể tích dịch lọc (1 ml)
- 28 -
2.2.4 Khảo sát điều kiện cho quá trình tổng hợp dịch keo nano bạc từ dịch nội bào Saccharomyces cerevisiae bào Saccharomyces cerevisiae
2.2.4.1 Tỉ lệ dịch nội bào: dung dịch bạc nitrate
Thực hiện theo dãy tỷ lệ giữa dịch nội bào: dung dịch bạc nitrate: 0,5:19,5; 1:19; 2:18; 3:17và 4:16 (v:v) lắc ở nhiệt độ và thời gian phù hợp, sau đó phân tích phổ UV-vis để chọn tỷ tệ thích hợp cho q trình tổng hợp.
2.2.4.2 Khảo sát pH dịch nội bào
Dịch nội bào S. cerevisiae có giá trị pH khoảng 6,0; dùng dung dịch Na2CO3 1 M để đưa về các giá trị pH 7, 8, 9, 10,11 và 12; ở giá trị pH thấp hơn 6,0 bắt đầu xuất hiện hiện tượng kết tủa, đo đó chúng tơi khơng khảo sát pH acid.
Thực hiện tổng hợp dịch keo nano bạc với tỷ lệ đã khảo sát ở nhiệt độ và thời gian phù hợp, phổ UV-vis để xác định giá trị pH thích hợp.
2.2.4.3 Khảo sát nhiệt độ phản ứng
Với giá trị pH, tỷ lệ đã khảo sát, tiến hành tổng hợp dịch keo nano bạc ở các nhiệt độ 60 o
C, 70 oC, 80 oC, 90 oC và 100 oC lắc ở bếp ổn nhiệt. Sau thời gian phù hợp, đo phổ UV-vis để xác định giá trị nhiệt độ cho quá trình tổng hợp.
2.2.4.4 Khảo sát thời gian phản ứng
Chuẩn bị erlen có chứa dịch nội bào và dung dịch AgNO3 tỉ lệ và giá trị pH phù hợp. Tiến hành phản ứng ở nhiệt độ đã khảo sát ở trên, cách 30 phút mẫu được phân tích phổ UV-vis một lần. Phản ứng dừng lại khi giá trị hấp thu khơng thay đổi.
2.2.5 Phân tích một số đặc điểm của dịch keo nano bạc tổng hợp đƣợc 2.2.5.1 Quang phổ UV-Visible spectroscopy (UV-vis)
Quang phổ UV-Vis: dựa vào sự hấp thu hay phản xạ của chất hoặc hợp chất
trong dãy ánh sáng từ cực tím đến cận hồng ngoại (bước sóng nằm trong khoảng 200 – 800 nm). Đây được xem là kỹ thuật cơ bản nhất trong tổng hợp hạt nano, nhờ tính chất quang học đặc biệt của hạt nano mà quang phổ UV-Vis giúp người nghiên cứu có thể xác định được sự tạo thành hạt nano, sự ổn định của dịch keo, cũng như
- 29 -
dự đốn được kích thước hạt, độ đồng nhất, ngồi ra có thể dùng quang phổ Raman [13].
Dịch keo nano bạc sau khi tổng hợp được đo quang phổ hấp thu ở dãy bước sóng từ 200 đến 800 nm bằng máy GeneQuant 1300 của GE để xác định sự tạo