TĂNG BIỂU HIỆN GENE ALKB1, ALKB2 MÃ HÓA ENZYME N- ALKANE MONOOXYGENASE Ở Rhodococcus opacus B4 docx

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************ NGUYỄN TRẦN MINH ANH TĂNG BIỂU HIỆN GENE ALKB1, ALKB2 MÃ HÓA ENZYME N- ALKANE MONOOXYGENASE Ở Rhodococcus opacus B4 LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************ TĂNG BIỂU HIỆN GENE ALKB1, ALKB2 MÃ HÓA ENZYME N- ALKANE MONOOXYGENASE Ở Rhodococcus opacus B4 LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: GS TS HISAO OHTAKE NGUYỄN TRẦN MINH ANH TS LÊ ĐÌNH ĐƠN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  OVEREXPRESS GENE ALKB1/B2 ENCODING FOR N-ALKANE MONOOXYGENASE IN Rhodococcus opacus B4 GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Pro.Dr HISAO OHTAKE Dr LE DINH DON Student NGUYEN TRAN MINH ANH TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trƣờng Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập trƣờng Các Thầy Cô Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học thầy cô khác trƣờng ln tận tình hƣớng dẫn, giảng dạy giúp đỡ tơi TS Lê Đình Đơn GS TS Hisao Ohtake, TS Honda, TS Sameshima, TS Yamashita trực tiếp hƣớng dẫn giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài tốt nghiệp Tập thể phịng thí nghiệm sinh hóa, khoa cơng nghê ̣ sinh ho ̣c, đa ̣i ho ̣c Osaka đã tạo điều kiện giúp em hoàn thành đề tài Trƣờng Đại Học Osaka, Nhật Bản giúp đỡ thời gian vừa qua Tập thể bạn sinh viên lớp CNSH 28 hỗ trợ, giúp đỡ động viên suốt thời gian làm đề tài Con thành kính ghi ơn cha mẹ tất ngƣời thân gia đình ln nguồn động viên khích lệ to lớn cho suốt thời gian học tập trƣờng Tháng 06 năm 2006 Nguyễn Trần Minh Anh iii TÓM TẮT KHÓA LUẬN NGUYỄN TRẦN MINH ANH, Đại học Nông Lâm TP.HCM Tháng 9/2006 “CHUYỂN PLASMID CHỨA GENE ALKB1, ALKB2 VÀO Rhodococcus opacus B4 ĐỂ TĂNG NĂNG SUẤT TẠO ENZYME N- ALKANE MONOOXYGENASE PHÂN GIẢI N- ALKANE TẠO N-ALCOHOL” Giáo viên hƣớng dẫn: GS TS HISAO OHTAKE TS LÊ ĐÌNH ĐƠN Khóa luận nhằm tạo chủng Rhodococcus opacus B4 có biểu enzyme n- alkane monooxygenase tăng so với dòng chƣa biến nạp, cách tạo plasmid chứa gene alkB1/alkB2 chuyển plasmid vào R opacus B4 Một số kết đạt đƣợc: - Tạo đƣợc plasmid có promoter mạnh có chứa gene alkB1/ alkB2 - Tạo đƣợc dòng R opacus B4 có biểu gene alkB1/ alkB2 tăng so với dòng tự nhiên - Đề xuất: kiểu bể phản ứng dành cho R opacus iv MỤC LỤC TRANG Trang tựa Lời cảm ơn iii Tóm tắt khóa luận iv Mục lục v Danh sách hình vii Danh sách sơ đồ bảng viii MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tầm quan trọng sản xuất hóa chất sinh vật 2.2 Giới thiệu chung loài vi khuẩn Rhodococcus 2.3 Giới thiệu Rhodococcus opacus B4 2.4 N- alkane monooxygenase VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 3.1 Thời gian địa điểm 11 3.2 Vật liệu 11 3.2.1 Chủng vi khuẩn phƣơng pháp nuôi cấy 11 3.2.2 Plasmid 11 3.2.3 PCR primers 11 3.2.4 Môi trƣờng 12 3.3 Chiến lƣợc thí nghiệm tổng quát 14 3.4 Phƣơng pháp 15 3.4.1 Kỹ thuật 15 3.4.1.1 PCR 15 3.4.1.2 Thiết kế mồi 15 v 3.4.1.3 Sắc ký khí 16 3.4.2 Phƣơng pháp 18 3.4.2.1 Phân lập Rhodococcus opacus B4 18 3.4.2.2 Phƣơng pháp khuếch đại đoạn gene PCR 18 3.4.2.3 Phƣơng pháp tách plasmid từ vi khuẩn 18 3.4.2.4 Ligation vào T- vector 19 3.4.2.5 Kỹ thuật blunt-end 19 3.4.2.6 Chuyển nạp phƣơng pháp shock nhiệt 19 3.4.2.7 Điện chuyển 20 3.4.2.8 Xác định hoạt tính enzyme 20 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 Kết 22 4.2 Thảo luận 24 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 27 5.1 Kết luận 27 5.2 Đề nghị 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO 28 vi DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Cơng nghiệp sản xuất hóa chất Hình 2.2: Vi khuẩn Rhodococcus opacus B4 Hình 2.3: Mơ hinh AlkB – alkane hydroxylase ̀ Hình 4.1: Kết điện di sau xử lý enzyme cắt 22 Hình 4.2: Kết điện di sau xử lý enzyme giới hạn EcoRI 22 Hình 4.3: Nồng độ mảnh DNA sau tách từ gel band 23 Hình 4.4: Điện di kết PCR khuẩn lạc 23 Hình 4.5: Kết điện di khẳng định plasmid tạo 24 vii DANH SÁCH SƠ ĐỒ VÀ BẢNG Sơ đồ 2.1: Quy trình sản xuất phenol từ benzen Sơ đồ 2.2: Con đƣờng chuyể n hóa của n-octane Sơ đồ 2.3: Cơ chế oxy hóa nhóm methyl cuối n- alkane 10 Sơ đồ 3.1: Quy trình thí nghiệm tổng qt 14 Bảng 2.1: Đặc tính sinh lý sinh hóa Rhodococcus viii PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay, công nghệ sản xuất hóa chất có giá trị thƣơng mại từ chất không tan nƣớc nhƣ hydrocarbon từ nguồn dầu mỏ xúc tác sinh học đƣợc quan tâm Các tế bào thƣờng đƣợc sử dụng làm xúc tác sinh học có sẵn cofactor (NADH,…) có khả tái tạo cofactor Khả tái tạo cofactor tế bào cần thiết cho phản ứng oxy hóa khử Trong ngành cơng nghệ hóa chất, ngun liệu để tổng hợp hóa chất thƣờng khơng phân cực nhƣ hydrocarbon dầu mỏ dẫn xuất chúng Các nguyên liệu sản phẩm tạo thành có độc tính cao xúc tác sinh học làm giới hạn việc ứng dụng xúc tác sinh học ngành cơng nghiệp hóa chất Giải pháp cho vấn đề phải sử dụng vi sinh vật chủ (host strain) có khả chịu đƣợc dung môi hữu làm xúc tác sinh học Rhodococcus opacus B4 thâ ̣m chí có t hể số ng, sinh trƣởng tố t và có thể xúc tác nhiều phản ứng sinh tổng hợp môi trƣờng thâ ̣m chí chỉ có dung môi hƣ̃u nên đối tƣơ ̣ng rấ t đƣơ ̣c quan tâm Và phản ứng mà xúc tác , phản ứng chuyể n đổ i n- alkane đóng mô ̣t phầ n quan tro ̣ng 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích Tạo chủng R opacus có biểu gene alkB cao chủng bình thƣờng, nhằm phục vụ cho sản xuất hóa chất xúc tác sinh học sau 1.2.2 Yêu cầu Tạo chủng R opacus có suất chuyển hóa n- alkane cao chủng bình thƣờng Quá trình ion hóa ngắ n hay dài là tùy thuô ̣c bản chấ t của hơ ̣p chấ t (cấ u trúc phân tƣ̉ )18 nhiệt độ lửa (phụ thuộc tỉ lệ H2 / khơng khí / khí mang) FID có thể phát hiê ̣n cho tới – 10% thành phần có l mẫu vâ ̣n tớ c k hí lƣu thơng thƣờng Ở nồng độ cao hơn, lửa bị tải, kế t quả sẽ không chinh xác ́  Tổ ng hơ ̣p: chƣơng trình máy tính , xƣ̉ lý dƣ̃ liê ̣u sau mỡ i phép đo đa ̣c , có chƣ́c năng: Phân biê ̣t các peak và đƣờng bi ̣nhiễu Xác định điể m đầ u và điể m cuố i của các peak Đo diê ̣n tich các peak ́ Đo thời gian lƣu các peak Điề u chỉnh la ̣i đô ̣ lê ̣ch đƣờng nề n Điề u chỉnh la ̣i để đƣơ ̣c các peak đố i xƣ́ng Thiế t bi ̣sắ c ký khí đƣơ ̣c dùng ở có pha chuyể n đô ̣ng là khí N2, ̣t mao dẫn (0,25 mm x 30 m), FID  GC (Shimadzu GC-14B) Mẫu C6 (999 l hexane + l hexanol) C61 (Alk B1) C62 (Alk B2) C6 control (wild type) C7 C71 C72 C7 control C8 10 C81 11 C82 12 C8 control Khí mang: N2 Thể tích mẫu: l Nhiê ̣t đô ̣ lò : 80oC/ phút, sau đó tăng nhiê ̣t đô ̣ lên đế n 250oC với vâ ̣n tố c gia 19 nhiê ̣t: 5oC/ phút Nhiê ̣t đô ̣ ở cổ ng lấ y mẫu : 210oC Nhiê ̣t đô ̣ cô ̣t: 90 oC Nhiệt độ phát hiện: 250 oC 3.4.2 Phƣơng pháp 3.4.2.1 Phân lập Rhodococcus opacus B4 (5) Mẫu đất đƣợc lấy từ nhà máy hóa chất ven đƣờng Hiroshima, Japan Ủ g đất với ống nghiệm nhỏ chứa benzene bình 50 ml có nắp đậy vịng tuần 28oC Sau đó, hịa tan g đất với ml nƣớc vơ trùng để yên 30 phút Cho ml dịch đất vào ml môi trƣờng MSB, thêm 0,5 ml benzene bình có nắp đậy có ống nghiệm nhỏ chứa 0,5 ml benzene Ủ, lắc (120 rpm) bình ngày 28oC Tiếp đó, ml dịch cấy đƣợc ủ tiếp với ml mơi trƣờng MSB ngày Cứ pha lỗng nhƣ cấy môi trƣờng thạch MSB ủ tủ làm khô với cốc becher chứa benzene lỏng Đem khuẩn lạc thu đƣợc cấy trở lại vào môi trƣờng lỏng để khẳng định khả chuyển hóa benzene Giữ chủng vi khuẩn thu đƣợc dĩa thạch TSB Chủng B4 đƣợc quan tâm nhiều có tốc độ sinh trƣởng nhanh so với chủng R opacus khác 3.4.2.2 Phƣơng pháp khuếch đại đoạn gene PCR Khuế ch đa ̣i đ oạn DNA mang cu ̣m gene mã hóa cho n- alkane monooxygenase alkB1, alkB2 tƣ̀ DNA nhiễm sắ c thể của l oài R opacus B4 bằ ng PCR với că ̣p primer đă ̣c hiê ̣u lầ n lƣơ ̣t mang site cắ t EcoRI và BamHI Sau đó các đoạn khuế ch đa ̣i với kích thƣớc khoảng 1,2 kb đƣơ ̣c lo ̣c tƣ̀ gel sau điê ̣n di và ligate vào pGEM – Teasy để tăng hiê ̣u suấ t xƣ̉ lý với enzyme giới ̣n (EcoRI và BamHI) 3.4.2.3 Phƣơng pháp tách plasmid từ vi khuẩn (theo protocol của Miniprep) Nuôi cấ y vi khuẩ n ml môi trƣờng LB , với l kháng sinh thí ch hơ ̣p (Ampicillin hay Chloramphenicol) qua đêm Ly tâm dich nuôi cấ y vi khuẩ n 8000 rpm/1 phút/ 4oC Hòa tan hoàn toàn tủa tế ̣ bào 250 l cell resuspension solution Thêm vào 250 l cell lysis solution, đảo lầ n để trô ̣n đề u , thêm vào 10 l alkaline protease solution, đảo lầ n để trô ̣n đề u , ủ nhiê ̣t đô ̣ phòng phút Thêm vào 350 l dung dịch trung hòa (Neutralization20 solution), đảo lầ n để trô ̣n đề u Ly tâm với tố c đô ̣ cƣ̣c đa ̣i 10 phút Chuyể n dich t rong vào column , đă ̣t collection tube, ly tâm phút ̣ Bỏ dịch thu đƣợc Thêm vào 750 l dung dịch rửa cột (đã hòa EtOH nhƣ hƣớng dẫn ) Ly tâm với tố c đô ̣ cƣ̣c đa ̣i 1phút Lă ̣p la ̣i bƣớc rƣ̉a plasmid với 250 l dung dịch rửa cột Ly tâm với tố c đô ̣ cƣ̣c đa ̣i phút Chuyể n column vào eppendor f 1,5 ml Thêm vào column 100 l Nuclease free water, ly tâm phút 3.4.2.4 Ligation vào T- vector DNA l T – easy vector 0,5 l T4 DNA ligase l 2X ligation buffer 2,5 l  ủ 16oC từ 30 phút cho đế n bắ t đầ u bƣớc chuyển nạp 3.4.2.5 Kỹ thuật blunt-end DNA l Buffer l l  ủ 70oC phút  thêm vào l T4 DNA polymerase  ủ 37oC phút  thêm nƣớc khƣ̉ ion vào cho đủ 400 l 40 l sodium acetate Phenol chloroform tủa ethanol 3.4.2.6 Chuyển nạp phƣơng pháp shock nhiệt Chuẩ n bi E coli JM109 (competent cell) ̣ Cấy chủng JM109 môi trƣờng LB (1 đĩa ống nghiệm), ủ qua đêm 37oC Lấy 50 l dịch ni cấy chuyển vào mơi trƣờng SOC lỏng Ủ khoảng – 37oC đạt độ OD bƣớc sóng 660 nm khoảng 0,4 – 0,6 Giữ dịch nuôi cấy đá lạnh khoảng 10 phút Ly tâm với vận tốc 3000 vòng 4oC 15 phút, sau hịa tủa tế bào thu đƣợc 3,4 ml TB buffer Để đá lạnh 10 phút đem ly tâm với vận tốc 3000 vòng oC 10 phút Hòa tủa tế bào thu đƣợc với 800 l TB buffer 7% (tƣơng đƣơng khoảng 56 l) dung dịch DMSO Để trên21 đá lạnh 10 phút, phân phối 200 l hay 400 l vào eppendorf Đem trữ lạnh -80 o C dùng Ligation and chuyển nạp bằ ng phƣơng pháp shock nhiêṭ l insert DNA l vector DNA ủ 16oC 1giờ l 2X ligation mixture Competent cell JM 109 để tan tƣ̀ tƣ̀ đá 10 phút Thêm vào plasmid , hòa , để đá 30 phút, ủ 42oC vòng 30 giây Để đá phút Sau đó thêm môi trƣờng LB vào cho tổ ng thể tich là ́ ml Đem ủ ở 37oC 30 phút Ly tâm 5000 rpm /4oC/1 phút, bỏ 900 l dich nổ i Nuôi cấ y 100 l ̣ dịch tế bào cịn lại mơi trƣờng LB thạch với 20 l Chloramphenicol Ủ qua đêm 37oC Chuyể n các khuẩ n la ̣c thu đƣơ ̣c qua dia tha ̣ch LB mới có chƣ́a Chlora mphenicol, ̃ ủ qua đêm đem PCR khuẩn lạc để xác định khuẩn lạc có pRO – B1/B2 3.4.2.7 Điên chuyể n (Electroporation) ̣ Nuôi cấy chủng B4 ố ng môi trƣờng TSB 24 giờ Lấ y ml dich nuôi ̣ cấ y này cho vào binh tam giác thể tích 100 ml có chƣ́a ml TSB (0.5% (w/v) glycine) ̀ Lắ c, ủ 28oC 24 Ly tâm với vận tốc 8000 g phút 4oC và rƣ̉a tủa tế bào lầ n bằ ng buffer HS đã để la ̣nh Hòa tủa tế bào 1ml HS buffer (1/10 V) Lấ y 400 l dich ̣ trộn với l DNA (để nồ ng đô ̣ cuố i cùng khoảng 0,1 – g/ml) Ủ 40oC 10 phút, chuyể n tấ t cả vào mm gap cuvette , đem áp du ̣ng dòng điê ̣n với điề u kiê ̣n 6,5 kV/cm, 725 Ω, 50 F Ngay sau đó chuyể n vào ml môi trƣờng TSB ố ng nghiê ̣m, đem ủ ở 28OC 24 Sau đó đem nuôi cấ y môi trƣờng tha ̣ch TSB với 20 l Chloramphenicol 3.4.2.8 Xác đinh hoạt tính enzyme ̣ Ni cấy tƣ̀ng l oại vi khuẩ n riêng biê ̣t (R opacus B4 bình thƣờng, R opacus B4 chuyển nạp AlkB1, R.opacus chuyển nạp AlkB2) môi trƣờng TSB lỏng qua đêm Lấ y 100 l vi khuẩ n , ủ chung với 900 l tƣ̀ng lo ̣ai n- alkane (1- hexane, 1-22 heptane, 1- octane) riêng biê ̣t Sau 48 giờ, trải dĩa TSB có Chloramphenicol , ủ qua đêm ở 28oC, sau đó đế m số khuẩ n la ̣c và so sánh 23 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết Thu vector plasmid pRO tƣ̀ Ecoli JM109, thu insert plasmid T-AlkB1/ AlkB2 tƣ̀ Ecoli JM109 Cắ t pRO bằ ng enzyme cắ t PstI Cắ t T-AlkB1/B2 bằ ng enzyme cắ t BamHI Hình 4.1: Kết điện di sau xử lý enzyme cắt PstI pRO, BamHI T-AlkB1/AlkB2 Lane 1: thang chuẩn 1kb Ở kết điện di Hình 4.1, sau cắ t plasmid chƣ́a g ene mã hóa cho alkB bằ ng BamHI, thu đƣơ c mảnh DNA riêng biệt Điề u này có th ể tạp nhiễm ̣ đoạn DNA có kích thƣớc khoảng kb Sau xử lý blunt-end đọan DNA trên, cắt chúng enzyme giới hạn EcoRI Hình 4.2: Kết điện di sau xử lý enzyme giới hạn EcoRI 24 25 Tách mảnh DNA tƣơng ứng 1,2 kb đố i với alkB1 /alkB2 mảnh DNA tƣơng ứng khoảng kb đố i với pRO tƣ̀ gel band, kiể m tra la ̣i nồ ng đô ̣ DNA Hình 4.3: Nồng độ mảnh DNA sau tách từ gel band Tiế n hành ligate để ta ̣o pRO -B1 pRO-B2, sau đó chuyể n plasmid mới tổ ng hơ ̣p vào JM 109, ủ qua đêm 37oC Chỉ chọn khuẩn lạc sống sót nuôi cấy với Chloramphenicol và có màu trắ ng Tiế n hành PCR các khuẩ n la ̣c đã cho ̣n để xác đinh khuẩ n la ̣c nào có chƣ́a plasmid mới tổ ng hơ ̣p (pRO-B1/B2) ̣ Hình 4.4: Điện di kết PCR khuẩn lạc Lane 1: thang chuẩn 2- log Lane 2: đối chứng dƣơng Lane 3-7: khuẩn lạc nghi ngờ có chứa AlkB1 Lane 9-12: khuẩn lạc nghi ngờ có chứa AlkB2 26 Tách plasmid pRO-B1/B2 tƣ̀ khuẩ n la ̣c E.coli JM109 cho kế t quả giố ng đố i chƣ́ng dƣơng và chuyể n vào R.opacus B4 bằ ng phƣơng pháp điê ̣n chuyể n (electroporation) Hình 4.5: Kết điện di khẳng định plasmid tạo Lane 1: pRO- B1 Lane 2: pRO- B2 Lane 3: thang chuẩn kb Kế t quả xác đinh hoạt tính enzyme: ̣ Sau 24 giờ, đem cấ y đia và ủ qua đêm , đố i với n - hexane, quan sát thấ y mâ ̣t ̃ đô ̣ số khuẩ n la ̣c m ang plasmid chƣ́a gene mã hóa alkB nhiề u hẳ n số khuẩ n lạc alkB wild -type Điề u này chƣ́ng tỏ chủng overexpress AlkB tăng khả chuyể n hóa n- hexane và AlkB2 không ảnh hƣởng đế n quá trinh chuyể n hóa n - hexane ̀ Đối với n- heptane và n - octane, chủng đột biến làm tăng khả chuyển hóa hai lọai alkane so với chủng wild-type Sau 48 giờ, đem cấ y đia và ủ qua đêm , quan sát thấ y chỉ còn lại khuẩn ̃ lạc lồi wild-type Sớ lƣơ ̣ng k h̉ n la ̣c của chủng đô ̣t biế n n - octane nhiề u n- heptane và nhiề u n- hexane 4.2 Thảo luận Kỹ thuật blunt-end đƣơ ̣c áp du ̣ng vì khoảng cách tƣ̀ tac promoter đế n codon đầ u tiên của gene cloned rấ t quan tro ̣ng đố i với biể u hiê ̣n của gene Tạo thành công R opacus có suất enzyme n - alkane monooxygenase AlkB1, AlkB2 tăng Nhƣng qua kiể m tra khả ta ̣o n -alcohol tƣ̀ n - alkane (n- hexane, n- heptane, n- octane) bằ ng sắ c ký khí thì thấ y lƣơ ̣n g alcohol phát hiê ̣n 27 đƣơ ̣c không nhiề u h ơn đáng kể so với chủng tự nhiên Mô ̣t nhƣ̃ng lý là enzyme đó oxy hóa tiếp alcohol tạo thành aldehyde acid béo cuối CO2 Muố n dƣ̀ng quá trinh oxy hóa ở n - alcohol sản xuất, phải tạo giống vi khuẩn ̀ loại bỏ gene mã hóa cho alkanol dehydrogenase Khi tiế p xúc với n - alkane, rhodococci ta ̣o các phân tƣ̉ ho ̣at tính bề mă ̣t , chủ yế u là glycolipid làm tăng khả sƣ̉ du ̣ng n - alkane cũng nhƣ hợp chất không tan khác để tăng trƣởng Rhodococci hầ u nhƣ bám chă ̣t lấ y alkane và cầ n có môi trƣờng nƣớc để tăng trƣởng và chuyể n hóa Họ vi khuẩn chỉ tăng trƣởng phầ n tiế p xúc giƣ̃a môi trƣờng nƣớc phần hydrocarbon hydrocarbon oxygenase khơng tách khỏi tế bào mà bám lấ y màng tế bào Rhodococcus opacus có khuynh hƣớng kế t dinh với bề mặt tiế p giáp giƣ̃a dầ u và nƣớc ́ Do tính chấ t có thể ta ̣o chấ t h oạt tính bề mă ̣t, họ rhodococci đƣợc đem ứng dụng ngành công nghiê ̣p dầ u , chủ yếu lĩnh vƣ̣c tăng cƣờng khai thác dầ u làm dầu , ứng dụng y khoa mỹ phẩm Hơn nƣ̃a , alkB còn đƣơ ̣c đ em ứng dụng để làm mơi trƣờng, sản xuất hóa chất hay y khoa dùng để khử methyl hóa DNA Chiề u dài chuỗi C của n - alkane càng thấ p thì đô ̣c tính với tế bào càng tăn g Thƣờng thì n- alkane tƣ̀ C 10 đến C18 dễ chuyể n hóa nhấ t , các alkane có chuỗi C càng dài thì càng it tan hơn, làm giảm tốc độ oxy hóa ́ Giá trị n - alkanol vẫn chƣa đƣơ ̣c xác đinh rõ ̣ Nhƣng cho đế n giờ , n- octanol, tiêu biể u cho n - alkanol đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng mô ̣t phầ n nào đó để sản xuất chất tẩ y rƣ̉a, nƣớc hoa, thuố c diê ̣t côn trùng, cũng nhƣ loại ester Giá sản phẩm thay đổ i tƣ̀ 4,5 USD.kg-1 (98% nguyên chấ t ) nế u sản xuấ t với số lƣơ ̣ng lớn , đến 23 USD.Kg-1 đố i với 99,5% nguyên chấ t 1- octanol, giá c ả nguyên liệu thay đổ i tƣ̀ 0,45 USD.kg-1 (94% nguyên chấ t ) đến 50,4 USD.kg-1 (99% nguyên chấ t ) n- octane Hiê ̣u quả kinh tế đƣơ ̣c quyế t đinh bởi hiê ̣u quả của enzyme hay quá trinh tinh ̣ ̀ chế sản phẩ m tƣ̀ bể lên men Vì vậy, ḿ n đƣa vào sản xuấ t , ta phải tìm điề u kiê ̣n nuôi cấ y, chuyể n hóa cho thich hơ ̣p nhấ t Ví dụ nhƣ bể phản ứng có cánh khuấy để giảm ́ kích thƣớc hạt thể sữa , làm tăng diện tích tiếp xúc v trao đổ i giƣ̃a tế bào chấ t Các yếu tố khác cũng không kém phần quan trọng N- alkane có ma ̣ch C dài thƣờng không tan nên rấ t khó để vi khuẩ n chuyể n hóa Trong trƣờng hơ ̣p này , ta có thể 28 sƣ̉ du ̣ng oleyl alcohol làm dung môi hƣ̃u để hòa tan các n - alkane da ̣ng rắ n Oleyl alcohol đƣơ ̣c cho ̣n sƣ̉ du ̣ng vì có bản chấ t trơ , không đô ̣c đố i với các tế bào , bay chấ t và sản phẩ m nên ta ̣o thuâ ̣n lơ ̣i quá trinh tinh chế sản phẩ m sau này ̀ Tính đặc hiệu chất AlkB đa dạng , oxy hó a nhiề u phân tƣ̉ khác n- alkane Ngoài chƣ́c hydroxy hóa nhóm methyl cuố i cùng phân tƣ̉ alkane, alkB còn có thể phóng thich epoxide tƣ̀ alkene và các hóa chấ t khác có nố i đôi ́ cuối phân tử , oxy hóa alcohol thành aldehyde và xúc tác các phản ƣ́ng khƣ̉ methyl hay sulfoxide hóa (19,20) Các epoxide có tính chất quang học nên sử dụng để sản xuất hóa chất hữu dụng để từ đó điề u chế nhiề u sản phẩ m có giá tri ̣hơn (17) 29 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kế t luâ ̣n Có thể thực phản ứng chuyển hóa n - alkane ở Rhodococcus opacus mơi trƣờng hầ u nhƣ chỉ có dung môi hƣ̃u Chủng B4 mới ta ̣o, với hiê ̣u suấ t ta ̣o enzyme AlkB 1/ AlkB2 tăng, tăng khả chuyể n hóa n- alkane 5.2 Đề nghị Tuy nhiên, lƣơ ̣ng n- alkanol tƣơng ƣ́ng ta ̣o thành không tăng Để ƣ́c chế chuyể n hóa tiếp sản phẩm tạo , ta có thể ta ̣o chủng ̣t biế n đã loại bỏ gene mã hóa cho alkanol dehydrogenase Để ứng dụng sản xuất công nghiệp quy mô lớn, cần phải nghiên cứu điều kiện sản xuất cho thích hợp để enzyme đạt tính ổn định có hiệu cao, quy trình tinh chế từ bể lên men cho đạt hiệu kinh tế cao nhƣ bể phản ƣ́ng có cánh khuấy, dùng oleyl alcohol để hòa tan n- alkane có mạch C dài 30 PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO 1) Differential expression of the components of the alkane hydroxylases from Pseudomonas aeruginosa 2) Chracterization of alkane hydroxylase genes from the marine hydrocarbonnoclastic bacterium Alcanivorax borkumensis 3) Isolation and phenotypic and molecular characterization of hydrocarbon-degrading bacteria isolated from Terra Nova Bay (Antarctica).Dep of Animal Biology and Genetics, Univ of Florence.Dep of Animal Biology and Marine Ecology,Univ of Messina,Italy 4) Recent Advances in Petroleum Microbiology MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS, Dec 2003, p 503–549 092- 2172/03/$08.000 DOI: 10.1128/MMBR.67.4.503–549.2003 5) Na,K.S., Nagayasu, K., Kuroda,A., Takiguchi, N., Ikeda,T., Ohtake,H., and Kato,J : Isolation and characterization of benzene-tolerant Rhodococcus opacus strains J.Biosci Bioeng., 99,378-382 (2005) 6) Na,K.S., Nagayasu, K., Kuroda,A., Takiguchi, N., Ikeda,T., Ohtake,H., and Kato,J : Development of a genetic transformation system for benzene- tolerant Rhodococcus opacus strains J.Biosci Bioeng., 99,408-414 (2005) 7) Functional analysis of alkane hydroxylases from Gram-negative and Gram-positive bacteria J.Bacteriology., v184,No6 8) Schmid, J.S.Dordick, B.Hauer, A.Kiener, M.Wubbolts, B.Witholt Industrial biocatalysis today and tomorrow Nature V409.11/Jan/2001 9) Eva J.Mckenna, Minor J.Coon Enzymatic w-oxidation IV Purification and properties of the w-hydroxylase of Pseudomonas olevorans J.Biological Chemistry,v245., No15 , 3882-3889, 1970 10) Renata G.Mathys, Oemer M.Kut, Bernard Witholt Alkanol removal from the apolar phase of a two-liquid phase bioconversion system Part I : comparison of a less volatile and a more volatile in-situ extraction solvent for the separation of 1octanol by distillation J.chem.Technol.Biotechnol.1998, 71, 315-325 11) Renata G.Mathys, Oemer M.Kut, Bernard Witholt Integrated two-liquid phase 31 bioconversion and product-recovery processes for the oxidation of alkanes : process design and economic evaluation 12) T.Kotani, T.yamamoto, H.Yurimoto, Y Sakai, N.Kato Propane monooxygenase and NAD+- dependent secondary alcohol dehydrogenase in propane metabolism by Gordonia sp Strain TY-5 J.Bacteriology, Dec.2003, 71207128 13) Sakai, Y., J.H Maeng, S.Kubota, A Tani, Y.Tani, N.Kato 1996 A nonconventional dissimilation pathway for long chain n- alkanes inn Acinetobacter sp M-1 that start with a dioxygenase reaction J.Ferment Bioeng.81:286-291 14) Whyte, L.G.,T.H Smits, D.Labbe, B.Witholt, C.W.Greer, J.B.vanBeilen, 2002, Gene cloning and characterization of multiple alkane hydroxylase systems in Rhodococcus strain Q15 and NRRLB-16531 Appl Environ Microbiol 68:59335942 15) M.Nieboer, A Vis, B.Witholt 1996 Overproduction of a foreign membrane protein in Escherichia coli stimulates and depends on phospholipids synthesis J.Biochem 241, 691-696 16) Mycobacterium sp., Rhodococcus erythropolis, and Pseudomonas putida behavior in the presence of organic solvents 2004 Microscopic research and technique 17) Specificity at the end of the tunnel : Understanding substrate length discrimination by the alkB Alkane Hydroxylase 18) Determination of the presence of the catabolic alkane monooxygenase gene from soil microorganisms isolated from coastal sand dunes 2000 19) van Beilen,J.B., M Wubbolts, Q chen, M.Nieboer, and B.Witholt, 1996 Effects of two-liquid-phase systems and expression of alk genes on the physiology of alkane-oxidizing strains, p 35-47 In T Nakazawa, K Furukawa, D Haas, and S Silver (ed.), Molecular biology of Pseudomonas , ASM Press, Washington, D.C 20) Witholt, B., M.J de Smet, J.B Kingma, J.B van Beilen, M Kok, R.G.Lageveen, and G.Eggpink 1990 Bioconversions of aliphatic compounds by Pseudomonas oleovorans inn multiphase bioreactors: background and economic potential Trends Biotechnol 8:46-52 21) Biotransformation of D-limonene to (+)trans-carveol by toluene –grown R.opacus 32 PWD4 cells 22) Daniel J.Arp Butane metabolism by butane-grown „Pseudomonas butanovora‟ Microbio (1999), 145, 1173-1180 23) Hara, S.Baik, K Syutsubo, N.Misawa, H M Smits, Jan B van Beilen, S.Harayama Env.Microbio (2004)6(3), 191–197 Cloning and functional analysis of alkB genes in Alcanivorax borkumensis SK2 24) Surface-active lipids in rhodococci Antonie van Leeuwenhoek 74: 59-70, 1998 25) Improving enzymes by using them in organic solvents Nature V.409.11Jan, 2001 ... ************ TĂNG BIỂU HIỆN GENE ALKB1, ALKB2 MÃ HÓA ENZYME N- ALKANE MONOOXYGENASE Ở Rhodococcus opacus B4 LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: ... AlkB1, alkB2 gene có sẵn genome R opacus B4, mã hóa cho enzyme n- alkane monooxygenases (2 enzyme liên kết với màng tế bào), có tác dụng xúc tác q trình oxy hóa nhóm methyl cuối mạch carbon n-. .. MONOOXYGENASE PHÂN GIẢI N- ALKANE TẠO N-ALCOHOL” Giáo viên hƣớng dẫn: GS TS HISAO OHTAKE TS LÊ ĐÌNH ĐƠN Khóa luận nhằm tạo chủng Rhodococcus opacus B4 có biểu enzyme n- alkane monooxygenase tăng so với dòng