Luận văn: BƯỚC ĐẦU THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TRÊN CHÓ pdf

Trên thế giới đã có rất nhiều thành tựu thụ tinh trong ống nghiệm trên nhiều loài động vật heo, bò, thỏ, dê, cừu, chó…, nhưng trong đó chó là loài động vật có đặc điểm sinh lý rất khác b

  

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

BƯỚC ĐẦU THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TRÊN CHÓ

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 - 2007

Sinh viên thực hiện: TRƯƠNG THỊ HOÀNG DIỆU

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007

  

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

BƯỚC ĐẦU THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TRÊN CHÓ

PGS.TS TRẦN THỊ DÂN TRƯƠNG THỊ HOÀNG DIỆU

KỸ SƯ NGUYỄN VĂN ÚT

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007

iii

LỜI CẢM ƠN

Qua 4 năm học tập tại trường Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh, em đã được tiếp thêm nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu, mà nó sẽ là nền tảng vững chắc cho em trong cuộc sống sau này Để có được những thành công bước đầu như ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:

Ba má là những người đã có công sinh thành, dưỡng dục và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong cuộc sống, đặc biệt trong bốn năm đại học

Cô Trần Thị Dân là một nhà giáo ưu tú, rất tận tụy trong công tác, là người

đã vạch ra hướng nghiên cứu và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt

đề tài, đồng thời trong quá trình nghiên cứu và tìm hiểu em cũng được tiếp thu thêm nhiều kiến thức chuyên ngành mới về lĩnh vực công nghệ sinh học trong sinh sản

Thầy Nguyễn Văn Út là người rất năng nổ và nhiệt tình, thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Cô Quách Tuyết Anh đã cung cấp những tài liệu chuyên ngành rất bổ ích cho

em làm cơ sở áp dụng trong đề tài

Cô Hồ Thị Nga đã giúp đỡ em thêm một số trang thiết bị trong quá trình thực hiện đề tài

Hai anh Khưu Tú Phát và Nguyễn Bảo Khánh, Huỳnh Ngọc Thịnh và Võ Khánh Hưng là những người bạn chung nhóm đề tài với em, đã trực tiếp giúp đỡ, cùng trao đổi, chia sẻ những kinh nghiệm với em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Đồng thời em cũng xin gửi lời cảm ơn tới tất cả bạn bè, những người đã giúp

đỡ, chia sẻ với em rất nhiều trong học tập và cuộc sống

Sinh viên

Trương Thị Hoàng Diệu

Địa điểm: phòng Nuôi cấy tế bào và phòng thí nghiệm Sinh Lý Sinh Hóa, Khoa Chăn nuôi Thú y, trường Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh

Thụ tinh trong ống nghiệm là một thành công nổi bậc của ngành công nghệ sinh học sinh sản Phôi là nguồn nguyên liệu rất quan trọng trong công nghệ tế bào gốc, chuyển gen, tạo dòng, hay trong bảo tồn nguồn động vật quý hiếm…và chó cũng là một loài đáng được lưu tâm

Trong đề tài có 3 thí nghiệm được tiến hành:

Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ β-mercaptoethanol sử dụng để nuôi chín trứng Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình nhuộm trứng Thí nghiệm 3: So sánh hiệu quả thụ tinh trong môi trường Fert- TALP và TYH Kết quả:

Tỷ lệ trứng chín khi bổ sung β-mercaptoethanol với 50 µM là 4,88%, 100 µM

Prof: TRAN THI DAN

Engineer: NGUYEN VAN UT

Name of thesis: “Preliminary results of in vitro fertilization in dog”

Period: from the 1st Match, 2007 to the 15th August, 2007

Place: Cell culture lab, physiological and biochemical lab of Faculty of Animal Science and Veterinary Medicine, Nong Lam University

In vitro fertilization technology is an important achievement in reproductive

biotechnology Embryos are used for stem cell technology, animal breeding, conservation of valuable mammalian species,… including dog

The thesis consists of three experiments:

To evaluate the effect of different concentrations of β-mercaptoethanol on mature oocyte rate

To examine the effect of different concentrations of orcein on staining oocyte result

To compare the effect of TYH medium and Fert-TALP medium on in vitro

vi

MỤC LỤC

Lời cảm ơn iii

Tóm tắt iv

Mục lục vi

Danh mục các chữ viết tắt x

Danh mục các hình và biểu đồ xi

Danh mục các bảng xii

Chương 1 : MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 2

1.3 Yêu cầu 2

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Buồng trứng 3

2.1.1 Vị trí, hình thái 3

2.1.2 Cấu tạo 3

2.1.3 Chức năng 3

2.2 Nang noãn 4

2.2.1 Đặc điểm hình thái 4

2.2.2 Sự phát triển của nang noãn 4

2.2.3 Nội tiết nang tăng trưởng 6

2.2.4 Sự trưởng thành của nang noãn 7

2.2.4.1 Trưởng thành nhân 7

2.2.4.2 Trưởng thành tế bào chất 8

2.2.5 Sự rụng trứng 9

2.3 Nuôi chín trứng trong ống nghiệm (In vitro maturation - IVM) 9

2.3.1 Lịch sử IVM 9

2.3.2 Môi trường IVM 10

vii

2.3.2.1 Các loại môi trường IVM 10

2.3.2.2 Thành phần trong môi trường IVM 10

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả IVM 12

2.3.3.1 Thời gian 12

2.3.3.2 Chất lượng noãn và kích thước nang noãn 13

2.3.3.3 Tuổi và tình trạng sinh dục chó cái 13

2.3.3.4 Thời gian và nhiệt độ bảo quản mẫu buồng trứng 13

2.4 Phó tinh hoàn 13

2.5 Tinh trùng 15

2.5.1 Nguồn gốc và hình dạng 15

2.5.2 Quá trình sinh tinh 16

2.5.3 Cấu tạo 16

2.5.4 Thành phần 17

2.5.5 Đặc tính sinh lý 17

2.5.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của tinh trùng 18

2.6 Thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro fertilization-IVF) 19

2.6.1 Lịch sử IVF 19

2.6.2 Cơ chế của sự thụ tinh 20

2.6.3 Các giai đoạn phát triển của phôi 21

2.6.4 Vật liệu cho IVF 22

2.6.4.1 Giao tử 22

2.6.4.2 Môi trường IVF 22

2.6.5 Các hệ thống thụ tinh in vitro 23

2.6.6 Đánh giá kết quả thụ tinh 24

2.6.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến IVF 25

Chương 3: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 26

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành 26

3.2 Nội dung nghiên cứu 26

3.3 Vật liệu 26

viii

3.3.1 Nguồn mẫu 26

3.3.2 Hóa chất 27

3.3.2.1 Hóa chất dùng cho trứng 27

3.3.2.2 Hóa chất dùng cho tinh trùng 29

3.3.2.3 Hóa chất dùng cho thụ tinh 30

3.3.3 Dụng cụ - thiết bị 31

3.3.3.1 Dụng cụ 31

3.3.3.2 Thiết bị 31

3.4 Bố trí thí nghiệm 32

3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ β-mercaptoethanol sử dụng để nuôi chín trứng 32

3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình nhuộm trứng 32

3.4.3 Thí nghiệm 3: So sánh hiệu quả thụ tinh trong môi trường Fert-TALP và TYH 32

3.5 Phương pháp tiến hành 33

3.5.1 Thu nhận buồng trứng tại lò mổ 33

3.5.2 Xử lý buồng trứng 35

3.5.3 Tìm và rửa trứng 35

3.5.4 Phân loại trứng trước khi nuôi 35

3.5.5 Nuôi trứng 36

3.5.6 Thu nhận và đánh giá trứng sau khi nuôi 36

3.5.6.1 Thu nhận trứng sau khi nuôi 36

3.5.6.2 Đánh giá trứng sau khi nuôi 37

3.5.7 Nhuộm trứng 38

3.5.8 Thu nhận tinh hoàn tại lò mổ 39

3.5.9 Thu tinh trùng và hoạt hóa tinh trùng 39

3.5.9.1 Quy trình thu nhận và hoạt hóa tinh trùng 39

3.5.9.2 Các chỉ tiêu đánh giá tinh trùng trong thụ tinh in vitro: 39

ix

3.5.10 Phương pháp thụ tinh 40

3.5.10.1 Thụ tinh bằng môi trường Fert-TALP 41

3.5.10.2 Thụ tinh bằng môi trường TYH 42

3.6 Xử lý số liệu 42

Chương 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 43

4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát hiệu quả nuôi trứng khi bổ sung các nồng độ β-mercaptoethanol 43

4.2 Thí nghiệm 2 : Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình nhuộm trứng 44

4.3 Thí nghiệm 3 : So sánh hiệu quả thụ tinh trong môi trường TYH và Fert - TALP 47

4.4 Một số kinh nghiệm trong IVF 48

4.4.1 Lấy mẫu 48

4.4.2 Thao tác trong phòng thí nghiệm 49

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50

5.1 Kết luận 50

5.2 Đề nghị 50

FSH Follicle stimulating hormone Hormone kích thích nang noãn

GVBD Germinal vesicle break down Phá vỡ túi mầm

In vitro Trong ống nghiệm

In vivo Trong cơ thể sống

IVC In vitro culture Nuôi cấy trong ống nghiệm IVF In vitro fertilization Thụ tinh trong ống nghiệm IVM In vitro maturation Trưởng thành trong ống nghiệm

LH Luteinizing hormone Hormone kích thích thể vàng

NCSU North Carolina State University

xi

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 2.1 Các giai đoạn phát triển của nang noãn trong buồng trứng 6

Hình 2.2 Các giai đoạn phát triển của nhân 8

Hình 2.3 Nang noãn trưởng thành 9

Hình 2.4 Các giai đoạn xâm nhập của tinh trùng vào trứng 20

Hình 2.5 Các giai đoạn phát triển của phôi 21

Hình 3.1 Buồng trứng 26

Hình 3.2 Tinh hoàn 27

Hình 3.3 Phó tinh hoàn 27

Hình 3.4 Thao tác mổ lấy buồng trứng 35

Hình 3.5 Phân loại trứng trước khi nuôi 36

Hình 3.6 Phân loại trứng sau khi nuôi 37

Hình 3.7 Sự giãn nở của tế bào cumulus 38

Hình 4.1 Các giai đoạn phát triển của trứng nhuộm bằng orcein 46

Hình 4.2 Trứng nhuộm orcein không nhìn thấy rõ giai đoạn 46

Hình 4.3 Tiền nhân sau 24 giờ 47

Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ trứng chín với các nồng độ β-mercaptoethanol 43

Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ trứng được nhìn rõ các giai đoạn theo nồng độ orcein 45

xii

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ

BẢNG TRANG

Bảng 2.1 Lƣợng tinh trùng dự trữ trong các phần của phó tinh hoàn 15

Bảng 3.1 Thời gian mọc răng của chó 34

Bảng 4.1 Tỷ lệ trứng chín với các nồng độ β-mercaptoethanol 43

Bảng 4.2 Tỷ lệ trứng đƣợc nhìn rõ các giai đoạn theo nồng độ orcein 45

Bảng 4.3 Tỷ lệ hình thành tiền nhân trong TYH và Fert-TALP 47

Sơ đồ 3.1 Quy trình nhuộm trứng 38

Sơ đồ 3.2 Quy trình thụ tinh 41

tạo phôi trong ống nghiệm (in vitro culture - IVC), mục tiêu là cải tiến, hoàn thiện quy trình tái sinh sản động vật trong điều kiện in vitro gần giống như điều kiện in

vivo để từ đó đi sâu vào nghiên cứu các yếu tố sinh lý và sinh hóa làm cơ sở cho các

nghiên cứu khoa học và y học phục vụ cuộc sống

Thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro fertilization - IVF) là một giai đoạn quan

trọng trong toàn bộ quy trình tạo phôi Phôi là nguồn vật liệu quan trọng trong chuyển cấy phôi tạo nguồn động vật đồng loạt, phục vụ cho các thử nghiệm trong y học, hoặc nhằm mục đích nâng cao năng suất vật nuôi trong chăn nuôi hay một ý nghĩa quan trọng là bảo tồn những loài động vật quý hiếm Phôi còn là nguồn nguyên liệu khai thác tế bào mầm rất hiệu quả phục vụ cho con nguời trong việc cấy ghép nội tạng giảm nguy cơ đào thải của cơ thể

Trên thế giới đã có rất nhiều thành tựu thụ tinh trong ống nghiệm trên nhiều loài động vật (heo, bò, thỏ, dê, cừu, chó…), nhưng trong đó chó là loài động vật có đặc điểm sinh lý rất khác biệt, do đó tỷ lệ trứng chín và tỷ lệ hình thành phôi trong ống nghiệm còn rất thấp, đây là vấn đề còn rất được quan tâm và nghiên cứu Ở Việt Nam, công nghệ sinh học sinh sản cũng mới được quan tâm trong thời gian gần đây, viện Khoa học và Công nghệ, trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên đã nghiên cứu thành công trên chuột, heo, bò, nhưng vẫn chưa thực hiện trên chó

Vì những lý do trên mà đề tài “Bước đầu thụ tinh trong ống nghiệm trên chó” được tiến hành

1.2 Mục tiêu

Bước đầu tìm quy trình thụ tinh trong ống nghiệm phù hợp trên chó

1.3 Yêu cầu

- Nuôi chín trứng chó trong ống nghiệm

- Hoạt hóa tinh trùng

- Thụ tinh trứng chó trong ống nghiệm

2.1.2 Cấu tạo

Buồng trứng có cấu tạo gồm 2 lớp: Bên ngoài là lớp màng liên kết sợi chắc chắn như màng bao tinh hoàn Bên trong được cấu tạo bằng lớp mô liên kết sợi xốp, gồm 2 miền: miền vỏ nằm ngoài sát bề mặt buồng trứng, là nơi sinh ra các loại nang noãn và thể vàng ở các giai đoạn khác nhau (nang noãn, thể vàng, thể trắng - thể vàng thoái biến), xảy ra sự chín và rụng trứng; miền tủy chứa nhiều mạch máu vào nuôi dưỡng nang noãn, mạch bạch huyết, thần kinh, mô liên kết cũng dày hơn gồm sợi xốp và sợi cơ trơn (Nguyễn Đình Nhung và ctv, 2005)

2.1.3 Chức năng

Buồng trứng là một trong những bộ phận quan trọng của hệ thống sinh dục thú cái, buồng trứng thực hiện hai chức năng quan trọng là ngoại tiết và nội tiết

- Ngoại tiết: sinh ra noãn chín và rụng vào vòi Fallop chuẩn bị cho sự thụ tinh

- Nội tiết: progesterone từ thể vàng và estrogen từ nang noãn là hai hormon gây nên những đặc tính sinh dục thứ cấp ở con cái, ngoài ra buồng trứng còn tiết các kích thích tố như oxytocin, relaxin, inhibin, activin (Trần Thị Dân và Dương Nguyên Khang, 2006) Tế bào hạt trong biểu mô của nang noãn thành thục tiết nhiều estrogen

2.2 Nang noãn

2.2.1 Đặc điểm hình thái (Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997)

Noãn (trứng) là tế bào lớn nhất cơ thể, có dạng hình cầu Thể tích noãn lớn hơn tinh trùng nhiều lần và dài gấp 2 lần tinh trùng Noãn (trứng) có cấu tạo gồm 3 phần:

Phần nguyên sinh chất gồm các thành phần chủ yếu là nước, vật chất hữu

cơ, muối khoáng và vật chất khác

Nhân gồm lưới nhiễm sắc thể và nhiều hạt

Màng bao gồm 3 lớp: lớp ngoài, lớp giữa và lớp trong

Màng ngoài gồm nhiều tế bào hình nang hay hình chóp Những tế

bào này được phân bổ khắp noãn nên còn gọi là màng phóng xạ hay màng tia Các

tế bào này được gắn với nhau bởi acid hyaluronic Khi tinh trùng gặp trứng, men hyaluronidase ở phần acrosom được tiết ra để phân giải acid hyaluronic làm màng phóng xạ tan ra và tạo điều kiện thụ tinh

Màng giữa gồm nhiều tế bào, được sinh ra từ tế bào nang, là lớp nuôi

dưỡng noãn Màng giữa gọi là màng trong suốt Màng này đảm bảo dinh dưỡng cho noãn trong buồng trứng Trong màng chứa enzym zonalizin – men đặc hiệu chủng loài có tác dụng ngăn ngừa tinh trùng khác loài đi vào nhân noãn trong quá trình thụ tinh

Màng trong là lớp màng mỏng bao quanh phần nguyên sinh chất gọi

là màng noãn hoàng hay màng nguyên sinh chất Màng này có tác dụng nuôi dưỡng noãn đã thụ tinh Giữa màng trong suốt và màng noãn hoàng có khoảng trống dày 14 – 25 µm, pH 3 – 5, chứa dịch có nồng độ ion cao

2.2.2 Sự phát triển của nang noãn

Trong suốt quá trình hình thành phôi, tế bào mầm nguyên thủy phát triển từ trung bì ở túi niệu, định vị tại buồng trứng, sau đó tăng lên về số lượng và biệt hóa thành nang noãn nguyên thủy Nang noãn nguyên thủy ngừng phát triển đến giai đoạn cơ thể thành thục về mặt sinh dục

Khi được sinh ra, buồng trứng thú cái đã có sẵn các nang noãn nguyên thủy và nang noãn bậc một cho hoạt động sinh sản suốt đời Nang noãn bậc một có thể thoái

hóa hoặc phát triển thành nang noãn bậc hai nếu trở nên nhạy cảm với hormone kích thích nang noãn (follicle stimulating hormone - FSH), nang noãn bậc hai được bao bọc bởi một lớp trong suốt tương đối dày (vùng trong suốt), nang noãn bậc hai

có hai hay nhiều lớp tế bào hạt nhưng không có xoang nang Nang noãn bậc ba là nang noãn có xoang, chứa dịch nang và có thể trở nên trội hẳn để chuẩn bị xuất noãn (nang Graaf) Nang noãn có xoang tương tự như vết phỏng trên bề mặt buồng trứng và có thể quan sát được bằng mắt thường, kích thước nang noãn có xoang biến động khoảng nhỏ hơn 1 mm đến vài cm tùy theo giai đoạn phát triển hoặc thoái biến và tùy loài, ví dụ ở bò 10-15 mm (Lussier et.al., 1987), bò 12-19 mm, heo 8-12

mm (Hafez, 1968), chó 4-6 mm (Cole và Cupps, 1959) Nang noãn có xoang cấu tạo gồm 3 lớp: lớp bao ngoài, lớp bao trong và lớp tế bào hạt Lớp bao ngoài là mô liên kết lỏng lẻo, lớp bao trong sản xuất kích thích tố adrogen dưới ảnh hưởng của kích tố thể vàng (luteinizing hormone-LH), lớp tế bào hạt tách rời lớp bao trong bởi màng đáy rộng, tế bào hạt sản xuất nhiều chất sinh học và trên bề mặt tế bào có thụ thể tiếp nhận LH, những chất quan trọng được sản xuất bởi tế bào hạt là estrogen, inhibin và dịch nang (Trần Thị Dân và Dương Nguyên Khang, 2006)

2.2.3 Nội tiết nang tăng trưởng

Sự tăng trưởng, thành thục, rụng trứng và lutein hóa của nang Graff phụ thuộc vào các yếu tố: kiểu chế tiết thích hợp, hàm lượng đủ và tỷ lệ phù hợp của FSH và

LH trong huyết thanh

FSH giữ vai trò chủ đạo cho việc khởi đầu sự hình thành xoang nang, kích thích quá trình phân bào nguyên nhiễm của tế bào hạt (có sự hỗ trợ của estradiol), quá trình hình thành dịch nang trứng FSH còn làm tăng khả năng cảm ứng của tế bào hạt đối với LH bằng cách tăng số lượng các thể tiếp nhận LH, đây là sự chuẩn

bị cho quá trình lutein hoá của các tế bào hạt trong việc đáp ứng sóng gây rụng trứng của LH Theo Davol (2000), trên chó 2 ngày trước khi rụng trứng, tuyến yên tăng tiết LH làm cho nang noãn phồng lên nhanh chóng, nang noãn tiến dần lên bề mặt buồng trứng và khi tỷ lệ LH/FSH phù hợp thì sẽ xảy ra hiện tượng xuất noãn, nếu vắng mặt LH thì không xảy ra sự xuất noãn

Hình 2.1 Các giai đoạn phát triển của nang noãn trong buồng trứng

(Nguồ n: Cummings, 2001)

Estrogen do các tế bào hạt trong nang tiết ra Estrogen cần thiết cho sự duy trì

và phát triển của buồng trứng, cấu trúc sinh sản và đặc điểm sinh dục thứ cấp ở động vật cái Có ý nghĩa quan trọng trong việc thúc đẩy trứng phát triển, chín và rụng, phát triển niêm mạc tử cung, tăng hàm lượng actin và myosin trong giai đoạn mang thai, tăng sinh mô tuyến của niêm mạc và tế bào biểu mô lông rung của ống dẫn trứng giúp trứng đã thụ tinh di chuyển dễ dàng vào tử cung

Progesteron được phân tiết chủ yếu từ hoàng thể Progesteron kích thích tăng sinh niêm mạc tử cung, giúp tử cung có khả năng bài tiết, giảm co bóp cơ tử cung tạo môi trường yên ổn sẵn sàng đón chờ trứng đã thụ tinh vào làm tổ, kích thích niêm mạc ống dẫn trứng bài tiết dịch chứa chất dinh dưỡng nuôi phôi, progesteron còn có tác dụng kích thích bài tiết prolactin làm tăng phát triển các ống sữa của tuyến vú Hàm lượng progesterone trong huyết thanh bắt đầu tăng lên ở giai đọan động dục, ở chó sau khi hàm lượng progesterone tăng đến 2 ng/ml thì sự xuất noãn

sẽ xuất hiện sau đó 2 ngày, do đó hàm lượng progesterone cũng là một chỉ tiêu hiệu quả để xác định thời điểm phối giống trong thụ tinh nhân tạo (Davol, 2000)

2.2.4 Sự trưởng thành của nang noãn

Khi đạt đến kích thước cực đại, nang noãn chuyển sang giai đoạn mới, đó là giai đoạn trưởng thành Quá trình này xảy ra dưới ảnh hưởng của các cơ chế điều chỉnh, trong đó quan trọng nhất là cơ chế thần kinh-hormone trong tương tác noãn bào với các tế bào xung quanh Sự chuyển sang giai đoạn trưởng thành được thực hiện dưới ảnh hưởng của các kích thích tố của thùy trước tuyến yên Sự trưởng thành nang noãn bao gồm cả trưởng thành nhân và trưởng thành tế bào chất (Vũ Văn Vụ và ctv, 2005)

nhân và một chút tế bào chất tách khỏi màng noãn bào và nằm ngoài màng sinh chất nhưng ở trong màng noãn hoàng, đó chính là thể cực thứ nhất; tế bào thứ hai là noãn bào bậc hai, nhiễm sắc thể trong tế bào chất của tế bào này ngay lập tức bước vào metaphase II (II) và dừng lại tại đó (Vũ Văn Vụ và ctv, 2005) Thời gian noãn trưởng thành khác nhau tùy loài như ở bò là 24 giờ (Sirard et al., 1989), heo là 38 giờ, chó

48-72 giờ (Rota, 2004) Đây là cơ sở cho việc thiết lập quy trình nuôi chín trứng in

vitro trên nhiều loài

2.2.4.2 Trưởng thành tế bào chất

Đồng thời với các diễn biến của nhân, trong tế bào chất cũng diễn ra nhiều biến đổi Noãn trở nên mọng nước, các phiến noãn hoàng trong nước và dần hòa tan vào nhau, noãn trở nên trong hơn Trong noãn xảy ra sự tăng áp suất nội bào, giảm tính thấm, lớp tế bào chất ở bề mặt có khả năng co giãn và xuất hiện khả năng phân chia (Vũ Văn Vụ và ctv, 2005) Các bào quan trong tế bào chất được tổ chức lại chuẩn bị cho quá trình thụ tinh và tổng hợp protein chuẩn bị cho sự phát triển phôi

Sự trưởng thành tế bào chất là yếu tố gián tiếp quyết định khả năng phát triển của noãn để có thể xảy ra hiện tượng thụ tinh bình thường, phân chia và phát triển tới

Hình 2.2 Các giai đoạn phát triển của nhân

(Nguồn: Mario Mayes, 2002)

phôi nang (blastocyst) Nếu chỉ có sự trưởng thành về nhân mà không có sự trưởng thành về tế bào chất thì sẽ không đảm bảo cho sự phát triển phôi sau này (Sirard et al., 1989; Yang et al., 1998)

2.2.5 Sự rụng trứng

Lúc rụng trứng, thành nang vỡ ra và giải phóng trứng thứ cấp vào ống dẫn trứng, trứng vẫn được một số tế bào hạt bao quanh

Sự rụng trứng xảy ra vào cuối kỳ tăng trưởng, ở đa số các loài trứng rụng khi

đã trưởng thành đầy đủ về nhân và tế bào chất (MII), tuy nhiên ở ngựa, chó và cáo trứng rụng khi còn ở giai đoạn GV (Vũ Văn Vụ và ctv, 2005) Ở giai đoạn này, nang trứng trội có khả năng đáp ứng với sự tăng lên mạnh và đột ngột của các kích dục tố bằng sự thay đổi hoàn toàn cấu trúc của nó, dẫn đến hiện tượng rách nang và giải phóng noãn bào

2.3 Nuôi chín trứng trong ống nghiệm (In vitro maturation-IVM)

2.3.1 Lịch sử IVM

Trên thế giới, kỹ thuật IVM đã xuất hiện từ rất sớm, với mục đích nghiên cứu

ảnh hưởng của các yếu tố sinh lý, sinh hóa lên sự phát triển của trứng trong in vivo, từ

đó tái thiết lập quy trình IVM để làm cơ sở cho các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản sau này

Năm 1935, Pincus và Enzmann tách noãn thỏ chưa trưởng thành khỏi sự ức

chế của nang noãn, cho phép noãn đạt tới trưởng thành khi nuôi cấy in vitro

Hình 2.3 Nang noãn trưởng thành (Nguồn: Mario Mayes, 2002)

Năm 1983, Minato và Toyoda (Nhật) và Schroeder và Eppig (Mỹ) cho rằng

noãn chuột được trưởng thành in vitro có khả năng tạo phôi nếu được thụ tinh

Năm 1983, Lenz và cộng sự cho rằng 39oC là nhiệt độ tối ưu để noãn bò

trưởng thành in vitro

Năm 1988, Lu và cộng sự cho ra đời con bê từ kỹ thuật chín noãn và thụ tinh

in vitro

Năm 1996, Eppig và O’Brien cho ra đời chuột con sau khi dùng kỹ thuật

IVM, thụ tinh in vitro và chuyển phôi vào tử cung chuột mẹ

Ngày nay kỹ thuật IVM đã được thực hiện thành công trên rất nhiều loài động vật và đặc biệt là trên người, làm cơ sở cho kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

(in vitro fertilization - IVF), chuyển cấy phôi và chuyển gen ngày nay kỹ thuật

IVM vẫn đang được rất chú trọng và phát triển

2.3.2 Môi trường IVM

2.3.2.1 Các loại môi trường IVM

Môi trường đơn giản: là hệ thống đệm bicarbonate chứa các muối như pyruvate, lactate, glucose Các môi trường thường được cung cấp huyết thanh hay albumine và một lượng thích hợp các kháng sinh (penicillin, streptomycin, gentamycin)

Môi trường phức tạp thường chứa thêm một số yếu tố như amino acid, vitamine, purine và những chất khác

2.3.2.2 Thành phần trong môi trường IVM

 Thành phần chính

- Nước

Nước là thành phần chính cho mọi loại môi trường Nước sử dụng trong IVM phải được qua hệ thống chưng cất, siêu lọc, hấp vô trùng để loại bỏ các chất khoáng, ion và nguồn gây nhiễm trong nước

- Nguồn năng lượng

Glucose, lactate, pyruvate là những nguồn năng lượng ngoại sinh quan trọng nhất cho sự phát triển của trứng và phôi Tuy nhiên tùy vào từng giai đoạn phát triển

mà nhu cầu năng lượng đối với từng cơ chất khác nhau Thêm glucose vào môi trường chứa pyruvate (tỉ lệ 5,5 mM : 1 mM) làm tăng tỉ lệ MII trên noãn chuột (Downs et.al., 2000) Pyruvate cũng có vai trò thúc đẩy giảm phân, noãn chuột đạt MII (71,9%) khi nuôi với pyruvate cao hơn đối chứng (19,6%) (Masaya Geshi et.al., 2000)

 Albumine huyết thanh

Nếu không bổ sung huyết thanh vào môi trường thì có thể thay bằng albumine Albumine huyết thanh bò (bovine serum albumine - BSA) là loại thường được sử dụng nhất, nó như là một biện pháp ngăn cản sự xâm nhập đa tinh trùng

trong thụ tinh in vitro Bổ sung BSA hoặc FCS đều làm tăng khả năng tiếp diễn

giảm phân, nhưng so sánh giữa hai kết quả này thì không có sự khác biệt nhau Noãn chó được nuôi trong môi trường North Carolina State University 37 (NCSU 37) có bổ sung 0,4% BSA và 100 ng/ml yếu tố tăng trưởng biểu mô (epidemal growth factor - EGF) sẽ cho tỷ lệ noãn tiến đến giai đoạn MII cao nhất so với đối chứng và các nồng độ khác (Kim et.al., 2006)

- Muối

Đây là thành phần rất quan trọng trong môi trường nuôi trứng và phôi nhằm đảm bảo áp suất thẩm thấu Có nhiều ion chịu trách nhiêm cho sự điều hòa này nhưng chủ yếu là Na+ và K+ Hàm lượng các ion trong môi trường dựa vào thành phần các chất khoáng trong huyết tương máu

- Hệ đệm

Hệ đệm thông dụng nhất là bicarbonate dưới 5 % CO2 Cơ chế của hệ đêm này cũng giống như hệ đệm trong sinh lý máu Hệ đệm có vai trò quan trọng là ổn định nồng độ CO2 và pH của môi trường

- Kháng sinh

Các loại kháng sinh thường dùng là penicillin, streptomycin, gentamycin Các loại kháng sinh đều có vai trò quan trọng nhất là giảm nguy cơ nhiễm khuẩn từ các tác nhân bên trong và bên ngoài trong quá trình nuôi cấy

 Thành phần bổ sung

- Hormon

Hầu hết các môi trường IVM đều được bổ sung hormon, đặc biệt là FSH và

LH FSH giúp noãn giãn nở hạt tụ và vượt qua chướng ngại trong giảm phân nhưng không giúp phát triển hơn nữa Ngoài ra còn bổ sung estradiol, progesteron vào môi trường Tỷ lệ MII khi thêm estradiol (14,7%) cao hơn so với đối chứng(1,5-8,2%), khi thêm progesterone cao hơn (10 %) so với đối chứng (4,8 %) (Kim et.al., 2005)

- Yếu tố tăng trưởng

Trên chó, EGF được thu từ ống dẫn trứng EGF được thêm vào môi trường nuôi cấy làm tăng tỷ lệ MII (16,7%) so với đối chứng (4%) (Bogliolo et.al., 2002) Khi bổ sung EGF với nồng độ 20 ng/ml thì tỷ lệ trứng chín tăng (13,3%) so với đối chứng (2,7%) (Kim et.al., 2004)

- Chất chống oxy hóa

Các chất trong môi trường nuôi cấy có thể bị oxy hóa và tao một số chất độc gây ảnh hưởng xấu tới noãn Do đó chất chống oxy hóa thường được cho vào môi trường là β- mercaptoethanol Tỷ lệ trứng đạt đến MII tăng 20% so với đối chứng khi bổ sung 50µM vào môi trường nuôi cấy (Kim et.al., 2004)

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả IVM

2.3.3.1 Thời gian

Cho đến nay cũng chưa có một công bố chính thức về thời gian tối ưu nhất

cho nuôi chín trứng in vitro trên chó, có nhà khoa học cho rằng thời gian tốt nhẩt là

48h (Bogliolo et.al., 2002), nhưng cũng có kết quả cho là không có sự khác biệt giữa 48 giờ và 72 giờ (Kim et.al., 2006)

2.3.3.2 Chất lượng noãn và kích thước nang noãn

Theo Sorrensen và Wassaman (1976), nang noãn nguyên thủy chứa noãn không có khả năng hỗ trợ quá trình giảm phân và phát triển của phôi Tỷ lệ noãn có khả năng giảm phân và hỗ trợ quá trình phát triển của phôi tăng dần theo đường kính của noãn Để đạt hiệu quả IVM cao thì kích thước noãn thường được lấy là

100 µm (Kim et.al., 2006)

2.3.3.3 Tuổi và tình trạng sinh dục chó cái

Hewitt và England (1998) so sánh noãn chó từ 2 nhóm tuổi : từ 1 - 6 tuổi và trên 7 tuổi Kết quả chứng minh rằng noãn từ các chó từ 1 - 6 tuổi đạt tỉ lệ trưởng thành nhiều hơn nhóm thứ hai

Yamada et.al., (1992) đã báo cáo rằng có đến 32% trứng lấy từ chó siêu bài noãn đạt đến MII sau 72 giờ nuôi cấy; trong khi đó, trứng lấy từ chó ở giai đoạn không động dục thì không có dấu hiệu tiếp diễn giảm phân kể cả khi nuôi tới 144 giờ

2.3.3.4 Thời gian và nhiệt độ bảo quản mẫu buồng trứng

Nhiệt độ tốt nhất bảo quản mẫu buồng trứng là 37oC trong môi trường nước muối sinh lý có đệm phosphate (phosphate buffered saline - PBS), thời gian tối đa cho phép trữ mẫu từ lúc lấy buồng trứng ra ngoài cơ thể là 2 giờ (Kim et.al., 2006)

Ngoài ra còn có một số yếu tố khác như: điều kiện vô trùng, thao tác người thực hiện, tủ nuôi cấy…

2.4 Phó tinh hoàn

 Vị trí: nằm ở một bên thân và đầu dưới của tinh hoàn (Nguyễn Đình Nhung

và ctv, 2005)

 Cấu tạo

Về giải phẫu học, phó tinh hoàn gồm 3 phần (Hoàng Văn Tiến và ctv, 1995)

Đầu: có rất nhiều ống dẫn ra (13 đến 20) đính vào ống dẫn của phó tinh hoàn,

tạo nên một cấu trúc dẹt, gắn vào một đầu của tinh hoàn

Thân: phần này hẹp, nối tiếp sau đầu phó tinh hoàn và tận cùng ở đầu kia của

tinh hoàn

Đuôi: phần này nối tiếp sau phần thân và rộng hơn thân phó tinh hoàn Đường

viền quanh của đuôi phó tinh hoàn là đặc điểm có thể thấy được ở gia súc còn sống Bên ngoài là lớp màng sợi, trong là các ống sinh tinh Ở đầu trên khoảng 15-

20 ống từ tinh hoàn đi lên, chúng uốn lượn, gấp đi gấp lại tập trung thành 6-10 ống

ở phần thân, đi xuống đuôi chỉ còn 2-3 ống, cuối cùng còn 1 ống dẫn ra khỏi đuôi phó tinh hoàn (Nguyễn Đình Nhung và ctv, 2005)

Phó tinh hoàn có 2 loại tế bào (Nguyễn Quang Mai và ctv, 2005)

- Tế bào hình trụ có tiêm mao: có chức năng hấp thu

- Tế bào đáy: có chức năng bài tiết

 Chức năng

Làm tinh trùng thành thục và dự trữ tinh trùng:

Những giọt bào tương còn sót lại trên cổ tinh trùng tụt dần xuống các phần tận cùng của đoạn giữa tinh trùng, hoạt lực tinh trùng tăng lên khi tinh trùng đi vào thân phó tinh hoàn Tại đuôi phó tinh hoàn, tinh trùng được cung cấp những yếu tố làm tăng khả năng thụ tinh, tinh trùng ở đuôi phó tinh hoàn có khả năng thụ tinh cao hơn tinh trùng ở phần thân, ngoài ra cũng có khả năng thụ tinh mà không cần bổ sung chất bài tiết của các tuyến phụ Những bất bình thường về hình thái tinh trùng trong tinh dịch có thể làm tăng lên trong quá trình tinh trùng đi qua và thành thục trong phó tinh hoàn (Hoàng Văn Tiến và ctv, 2005)

Trong phó tinh hoàn, tinh trùng được bao bởi một màng glycoprotein giúp tinh trùng vận động tiến thẳng, thể đỉnh thành thục (Nguyễn Quang Mai và ctv, 2005) Tinh trùng nằm trong phó tinh hoàn có thể giữ được năng lực thụ tinh trong vài tuần lễ và ống phồng trong đuôi phó tinh hoàn là cơ quan bảo tồn chính Khả năng đặc biệt của đuôi phó tinh hoàn để bảo tồn tinh trùng phụ thuộc vào nhiệt độ thấp của bao tinh hoàn và hoạt tính của hormon tính dục đực (Hoàng Văn Tiến và ctv, 2005)

Phó tinh hoàn làm tăng nồng độ K+, mà K+

có tác dụng ức chế sự vân động của tinh trùng, làm tăng tuổi thọ tinh trùng Tinh trùng được chuyển xuống và dự trữ ở

đuôi phó tinh hoàn, môi trường ở đây rất phù hợp để tinh trùng kéo dài tuổi thọ: Na+thấp, K+

cao, phân áp oxy thấp, CO2 cao, pH tương đối thấp, tinh trùng bị ức chế hầu như không vận động (Nguyễn Quang Mai và ctv, 2005)

Tinh trùng di chuyển trong phó tinh hoàn sẽ biến đổi cấu trúc để có thể sống lâu: giảm lượng nước, giảm thể tích, sinh ra protein mới bao quanh tinh trùng làm tinh trùng mang điện tích âm nên không bị ngưng kết với nhau, hoàn chỉnh khả năng thụ tinh, tinh trùng sống trong phó tinh hoàn 7-10 ngày, tối đa 2 tháng (Nguyễn Đình Nhung và ctv, 2005)

Bảng 2.1 Lượng tinh trùng dữ trữ trong các phần của phó tinh hoàn

(Nguồn: Davol, 2000)

Hấp thu và bài tiết dịch:

Hầu hết lượng lớn chất dịch ra khỏi tinh hoàn hằng ngày bị hấp thu ở phần đầu của phó tinh hoàn, phần đuôi cũng có khả năng hấp phụ những phần tử nhỏ kể cả tinh trùng Dòng chảy của chất dịch màng lưới tinh hoàn đi ra những ống dẫn ra và ống của phó tinh hoàn là cần thiết cho việc duy trì hình thái bình thường của những ống này Sự vận chuyển tinh trùng thông qua phó tinh hoàn là do dòng chảy của chất dịch màng lưới, hoạt động của biểu mô có nhung mao của các ống dẫn ra và sự

co rút của thành cơ của ống phó tinh hoàn (Hoàng Văn Tiến và ctv, 2005)

Phó tinh hoàn hấp thu rất mạnh, làm giảm nồng độ Na+, Cl-, tăng nồng độ K+

trong dịch của phó tinh hoàn (Nguyễn Quang Mai và ctv, 2005)

(109 tế bào/ml) 1,1 ± 0,18 1,85 ± 0,16 2,27 ± 0,24 Đuôi phó tinh hoàn

(109 tế bào/ml) 2,06 ± 0,31 3,3 ± 0,36 4,68 ± 0,39

trùng được đẩy ra khỏi phần đuôi phó tinh hoàn và được kết hợp với tinh thanh từ tuyến tiền liệt tại niệu đạo (Nguyễn Đình Nhung và ctv, 2005)

Tinh trùng có hình dạng giống nòng nọc Tinh trùng chó có hình dạng đặc thù khác biệt so với các loài khác Nó có dạng sợi dài, đường kính của đầu hơi nhỏ, còn đuôi thì khá dài, chiều dài toàn bộ khoảng 50 - 60 µm (Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005)

2.5.2 Quá trình sinh tinh

Theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), sự sản sinh tinh trùng xảy ra khi bắt đầu thành thục tính dục Đó là quá trình biệt hóa tế bào, bắt đầu từ tế bào mầm đến khi sản sinh ra các tinh trùng Quá trình này được chia làm 4 giai đoạn (Nguyễn Đình Nhung và ctv, 2005):

Giai đoạn sinh sản: tinh nguyên bào ở biểu mô ống sinh tinh (2n) liên tục

phân chia, dẫn đến tinh nguyên bào tăng về số lượng

Giai đoạn sinh trưởng: tinh nguyên bào ngừng phân chia, lớn lên thành tinh

bào bậc I nhưng số NST giữ nguyên 2n

Giai đoạn thành thục: tinh bào bậc I phân chia giảm nhiễm thành hai tinh bào

bậc II có số NST n và một NST giới tính X hoặc Y Tinh bào bậc II lại phân chia thành hai tinh tử có NST n

Giai đoạn tạo hình: tinh tử hoàn chỉnh cấu trúc thành tinh trùng Các tiền tinh trùng dài ra phát triển thành đuôi nối với nhau và kết nối với lớp dưới của tế bào Sertoli qua các cầu nối bào tương Các tế bào Sertoli giữ vai trò dinh dưỡng, nuôi các tiền tinh trùng (tinh tử) cho đến khi thành tinh trùng (Nguyễn Tường Anh, 2002) Chỉ sau khi sự biệt hóa hoàn chỉnh, các tinh trùng mới được giải phóng vào ống tinh Cuối cùng tinh trùng vào mào tinh (mào tinh là những ống tinh cuộn lại, nằm sát tinh hoàn) và tiếp tục trưởng thành trong một khoảng thời gian nhất định

2.5.3 Cấu tạo

Tinh trùng có cấu tạo gồm 3 phần: đầu, cổ và đuôi ( Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005)

Phần đầu: chứa vật chất di truyền, dài khoảng 5,6 µm Đầu tinh trùng gồm

2 phần: nhân và thể đỉnh (acrosome) Trong nhân chứa chromatin đậm đặc, đó là DNA liên kết với 1 protein, đặc biệt là phân tử DNP (deoxyribonucleoprotein) xếp

song song và gắn rất chặt chẽ với nhau làm cho cấu trúc của nhân gần như cấu trúc của tinh thể Phần trước đầu tinh trùng được bao bọc bằng một acrosome, có hình dạng như 1 cái túi mỏng gồm 2 lớp màng bọc sát vào nhân Trong acrosome có chứa các enzyme thủy phân như: hyaluronidase, phosphatase acid, esterase và các hydrolase acid Chúng có liên quan đến quá trình xâm nhập của tinh trùng qua màng trứng vào bên trong để thụ tinh: hyaluronidase có tác dụng phân hủy acid hyaluronic – là chất liên kết giữa các tế bào hạt bao quanh trứng

Phần cổ: chỉ dài khoảng 1µm, hơi co lại và cắm vào hõm ở đáy phía sau

của nhân

Phần đuôi: dài khoảng 49,26 µm - 50,26 µm, được bao bọc bằng 1 màng

chung và được chia thành 3 phần: đoạn giữa, đoạn chính và chót đuôi

2.5.4 Thành phần

Theo Nguyễn Quang Mai và ctv (2005), tinh trùng chứa 75% nước, 25% vật chất khô trong đó 85% protein, 13,2% lipid, 1,8% khoáng

Đầu tinh trùng chứa 65% nhân, chủ yếu là DNA; đuôi chủ yếu là lipid

Tinh trùng thành thục và được dự trữ ở phó tinh hoàn Tại đây màng tinh trùng được bão hòa thêm một lớp glycoprotein giúp tinh trùng có khả năng vận động

2.5.5 Đặc tính sinh lý

Theo Trịnh Bỉnh Duy (2001), trong ống sinh tinh, tinh trùng có thể sống vài tuần nhưng khi được phóng ra ngoài, đời sống tối đa chỉ từ 24 - 48 giờ Khi trữ ở nhiệt độ thấp, chuyển hóa giảm nên thời gian sống của tinh trùng kéo dài hơn

Theo Trần Tiến Dũng (2002), tinh trùng có 5 đặc tính: tính chuyển động độc lập về phía trước, tính lội ngược dòng nước, tính tiếp xúc với vật lạ, tính tiếp xúc với hoá chất và tính tiếp xúc với điện Sự rung động của đuôi kết hợp với sự xoay quanh của trục giữa làm cho tinh trùng vận động tiến thẳng tới trước Tốc độ tiến thẳng của tinh trùng phụ thuộc vào các điều kiện nội tại và ngoại cảnh như: niêm dịch ở đường sinh dục cái tiết ra nhiều hay ít, phương thức phóng tinh của con đực

và độ co bóp của sừng tử cung, ống dẫn trứng Tinh trùng chuyển động nhờ đuôi lái nên nó có thể chuyển động ngược dòng nước và cũng có xu hướng lội ngược dòng

nước Đối với một vật lạ, tinh trùng có đặc tính vây xung quanh vật lạ ấy Do đó tinh trùng vào đến ống dẫn trứng, gặp tế bào trứng thì tinh trùng tập trung xung quanh tế bào trứng và tìm nơi lõm của tế bào trứng để đi vào Ống dẫn trứng tiết ra chất hóa học, kích thích tinh trùng hưng phấn, làm tinh trùng tập trung lại và tiến đến tế bào trứng Chất hóa học này gọi là chất fertilizin Ngoài ra trong ống dẫn trứng hay tử cung có một điện thế mà bản thân tinh trùng cũng mang điện nên cũng

có điện thế, mà đặc tính của dòng điện chạy từ cao đến thấp cho nên tinh trùng lội

có phương hướng nhất định

Theo Nguyễn Quang Mai và ctv (2005), tinh trùng sử dụng năng lượng theo 3 phương thức:

Oxy hóa yếm khí:

Fructose → acid lactic + CO2 + Q (27,7 Kcal)

Với enzyme xúc tác là hexokinase, photphatase

Oxy hóa hiếu khí:

C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O + 674 Kcal

Hệ số hô hấp của tinh trùng là số µl O2 tiêu hao cho 105 tinh trùng trong 1 giờ

ở 37oC Đây là chỉ tiêu đánh giá sức sống của tinh trùng

Phân giải ATP: do enzyme ATPase ở cổ và đuôi tinh trùng

ATP → ADP + P + Q (7-12 Kcal)

2.5.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của tinh trùng

Theo Nguyễn Quang Mai và ctv (2005), tuổi thọ và năng lượng vận động của tinh trùng phụ thuộc vào:

Nhiệt độ: khi ở nhiệt độ cao, tinh trùng vận động mạnh làm tiêu hao nhiều

năng lương nên tinh trùng nhanh chết Nhiệt độ thấp sẽ ức chế hoạt động của tinh trùng, do đó sẽ kéo dài tuổi thọ tinh trùng Cơ sở này đã được ứng dụng trong công nghệ làm tinh đông viên hoặc tinh cọng rạ -196o

C

pH: pH trung tính hay kiềm làm tinh trùng vận động mạnh, tiêu tốn nhiều

năng lượng, dẫn đến giảm tuổi thọ tinh trùng pH acid yếu ức chế vận động của tinh trùng nên sẽ kéo dài tuổi thọ của tinh trùng

Áp suất thẩm thấu: môi trường nhược trương hay ưu trương đều giảm thời

gian sống của tinh trùng

Ánh sáng: tia tử ngoại và hồng ngoại kích thích vận động cuả tinh trùng,

làm tinh trùng tiêu năng lượng và giảm tuổi thọ

Chất hóa học: tinh trùng mẫn cảm với muối kim loại nặng Màng tinh trùng

mang điện tích âm đẩy rời ra nhau, khi gặp điện tích dương thì điện tích âm bị trung hòa, do đó tinh trùng dính vào nhau và mất khả năng vận động tiến thẳng

2.6 Thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro fertilization-IVF)

2.6.1 Lịch sử IVF

Sau khi IVM thành công trên một số loài thì các nhà khoa học trên thế giới tiếp tục nghiên cứu về kỹ thuật IVF IVF đã thành công trên rất nhiều loài động vật như chó, heo, thỏ, bò…Kỹ thuật ra đời đã mang lại một ý nghĩa to lớn trong việc giải quyết vấn đề vô sinh ở người

Năm 1959, con thỏ đầu tiên ra đời từ phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm Năm 1972, con chuột đầu tiên ra đời từ phôi đông lạnh

Ngày 25 tháng 7 năm 1978, lần đầu tiên trong lịch sử nhân loại, bé gái Louise Brown ra đời bằng công nghệ thụ tinh trong ống nghiệm tại một bệnh viện ở Anh Năm 1982, bé gái thứ hai Amadine ra đời bằng công nghệ này ở Pháp

Những năm 80 của thế kỷ XX, kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm phát triển mạnh Singapore được ghi nhận là nơi thực hiện thành công thụ tinh trong ống nghiệm đàu tiên ở châu Á vào năm 1983

Năm 1984, một phôi đông lạnh được rã đông để cấy vào tử cung, đã cho ra đời

bé trai đầu tiên là Zoe

Năm 1986, Cheng và ctv đã thành công IVF heo

Năm 1990, Gordon và Lu đã tạo thành công phôi bò IVF

Năm 1992, Yamada và ctv đã tạo phôi chó thành công

Năm 1994, Madan và ctv đã tạo thành công phôi trâu IVF

Năm 2006, Kim và ctv thành công IVF trên chó

Ở Việt Nam: Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp.HCM đã thành công trên bò, chuột

và heo Thụ tinh nhân tạo thành công trên người ở bệnh viện Từ Dũ, Hùng Vương

2.6.2 Cơ chế của sự thụ tinh (Phạm Thị Minh Đức và ctv, 2001)

Khi còn trong tinh dịch, một lượng lớn cholesterol bọc quanh đầu tinh trùng, tạo thành màng bao bọc quanh đầu bền vững và ngăn chặn sự giải phóng enzyme Khi di chuyển trong đường sinh dục cái lớp cholesterol bị mất, màng tinh trùng yếu

và tăng tính hấp thụ đối với Ca2+

, Ca2+ cao trong bào tương của đầu tinh trùng làm tăng vận động của tinh trùng và giải phóng enzyme

Đầu tinh trùng dự trữ lượng lớn hyaluronidase và enzyme thủy phân protein Hyaluronidase phá hủy liên kết các tế bào hạt quanh noãn, sau đó nhờ enzyme phân giải protein mà tinh trùng có thể chọc thủng màng trong suốt của noãn và tiếp cận với lớp vỏ bao quanh noãn Tại đây có các thụ thể cố định màng trước của tinh trùng vào lớp vỏ noãn, màng trước tinh trùng bị tiêu đi, giải phóng enzyme và mở đường xâm nhập vào lòng noãn, màng trong đầu tinh trùng tan ra và vật chất di truyền của đầu tinh trùng xâm nhập vào noãn

Hình 2.4 Các giai đoạn xâm nhập của tinh trùng vào trứng

(Nguồn: Naokazu et.al., 2005)

2.6.3 Các giai đoạn phát triển của phôi

Quá trình thụ tinh hoàn tất dẫn đến quá trình hình thành phôi ở dạng một tế bào Sau đó, phôi bắt đầu phân chia thành dạng 2, 4, 8, và 16 tế bào (tế bào nguyên phôi-blastomer) Các blastomer này ngày càng được phân chia nhiều hơn, nhỏ hơn

và kết hợp lại thành khối rắn chắc được gọi là phôi dâu (morula), lúc này rất khó nhìn thấy từng tế bào trong phôi, khối tế bào chiếm gần hết không gian của trứng Sau đó, phôi tiếp tục phát triển hình thành dạng phôi nang (blastocyst) và có sự tích lũy chất dịch bên trong tạo khối cầu rỗng Tiếp đó, blastocyst qua giai đoạn phôi nang trương nở (expanded blastocyst) và thoát khỏi màng trong suốt ở giai đoạn thoát nang (hatching blastocyst) rồi bắt đầu làm tổ trong tử cung