XÁC ĐỊNH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÁO CÁO TIỂU LUẬN HỌC PHẦN PHÂN TÍCH HÓA LÍ THỰC PHẨM 1 XÁC ĐỊNH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL GVHD Nguy.

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM BÁO CÁO TIỂU LUẬN HỌC PHẦN PHÂN TÍCH HĨA LÍ THỰC PHẨM XÁC ĐỊNH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL GVHD: Nguyễn Cẩm Hường SVTH: Nhóm TP HỒ CHÍ MINH, 2020 MỤC LỤC MỤC LỤC HÌNH ẢNH LỜI NĨI ĐẦU Chất đạm Protein chất dinh dưỡng (dưỡng chất) thiết yếu thể người thể động vật nói chung Chất đạm cung cấp thành tố để cấu trúc nên thể sinh học Protein thành phần dinh dưỡng quan trọng cấu tạo nên phận thể Chúng có mặt thành phần nhân chất nguyên sinh tế bào, chúng tham gia vào thành phần bắp, bạch huyết, máu, hormone, men, kháng thể, tuyến tiết nội tiết Ngoài ra, protein polyme thiên nhiên cấu tạo chủ yếu chuỗi polypeptide với số đơn vị amino acid lớn 50 Protein có thể sống ( động vật, thực vật) Thành phần chủ yếu protein C (50 – 52 %), H ( 6,8 – 7,7 %), O ( gần 24 %), N (15 – 18 %), S ( 0,5 – %) lượng nhỏ P, kim loại Protein chất đạm, thành phần quan trọng sống Trái đất Thiếu hay dư protein ảnh hưởng đến sức khỏe Có nhiều phương pháp giúp phân tích nồng độ protein phương pháp Dumas, sử dụng tia UV, phương pháp Biure, Tuy nhiên phương pháp nhiều phịng thí nghiệm sử dụng phương pháp Kjeldahl Trong tiểu luận nhóm giới thiệu phương pháp Kjeldahl xác định hàm lượng protein phương pháp Kjeldahl Xác định hàm lượng protein • Khái niệm ý nghĩa Protein polyme thiên nhiên cấu tạo chủ yếu chuỗi polypeptide với số đơn vị amino acid lớn 50 Protein có thể sống (động vật, thực vật) Thành phần nguyên tố chủ yếu protein C (50 – 52 %), H (6,8 – 7,7 %), O (gần 24 %), N (15 – 18 %), S (0,5 – %) lượng nhỏ P, kim loại Hình Protein thực vật Hình Protein động vật Dựa vào thành phần hóa học, protein chia thành hai nhóm: - - Protein đơn giản protein thủy phân hoàn toàn cho hỗn hợp amino acid Ví dụ; anbumin (có sữa, lịng trắng trứng, đậu Hà Lan, …), globulin (có sữa, lịng đỏ trứng, đậu tương, máu, …) Prptein phức tạp hay protein liên hợp protein thủy phân hoàn tồn tạo thành khơng hỗn hợp amino acid mà cịn có thành phần phi protein khơng chứa amino acid như: lipid, nucleic acid) Tùy theo thành phần phi protein, ta có protein phức tạp: phosphoprotein, glycoprotein, nucleoprotein, metaloprptein Để đánh giá chất lượng protein thực phẩm, người ta thường xác định hàm lượng protein tổng, hàm lượng amino acid, hàm lượng ammonia tự Protein thực phẩm xác định thông qua hàm lượng nitrogen tồn phần nhân với 6,25 (hệ số trung bình thơ), nghĩa protein nói chung chiếm khoảng 16% N tùy thuộc vào dạng amino acid có thực phẩm Hệ số chuyển đổi hàm lượng nitơ hàm lượng protein tham khảo theo bảng Phụ lục VI Phương pháp Kjeldahl 2.1 Phương pháp Kjeldahl gì? Đây phương pháp giúp xác định hàm lượng nitơ hợp chất hữu vô Phương pháp phân tích nitơ Kjeldahl tiêu chuẩn tồn giới để tính tốn hàm lượng protein nhiều loại vật liệu khác nhau, từ thức ăn người động vật, phân bón, nước thải hóa thạch Phương pháp Kjeldahl phát triển vào năm 1883 nhà sản xuất bia tên Johann Kjeldahl Một loại thực phẩm tiêu hóa axit mạnh để giải phóng nitơ xác định kỹ thuật chuẩn độ phù hợp Đây phương pháp nhiều tổ chức cơng nhận AOAC, USEPA, ISO, DIN, Pharmacopeias 2.2 Phương pháp Kjeldahl gồm quy trình nào? Phương pháp Kjeldahl bao gồm ba bước, phải thực theo thứ tự bước sau: • Chuyển đổi nitơ amin thành ion amoni mơi trường H2SO4 Đây cịn gọi q trình tiêu hóa • Chưng cất: Chuyển đổi ion amoni thành khí amoniac • Chuẩn độ: Lượng amoniac xác định cách chuẩn độ dung dịch chuẩn Sau ta xác định hàm lượng nitơ Hình Sơ đồ phương pháp Kjeldahl Phương pháp Kjeldahl gồm quy trình gồm tiêu hóa, chưng cất chuẩn độ Chi tiết cách thực quy trình gồm: Bước 1: Phân hủy chất hữu Mục đích quy trình phân hủy là phá vỡ tất liên kết nitơ mẫu chuyển đổi tất liên kết nitơ thành ion amoni (NH4+) Hợp chất carbon hydro tạo thành carbon dioxide nước • Cân khoảng gm mẫu chứa protein, ghi trọng lượng đặt mẫu vào bình phân hủy, với 12-15 ml axit sulfuric đậm đặc (H2SO4) • Thêm 7g kali sulfat chất xúc tác, thường đồng • Đưa ống / bình phân hủy hỗn hợp đun sôi (khoảng 370oC đến 400oC) • Đun nóng hỗn hợp ống bình nhìn thấy khói trắng, sau tiếp tục gia nhiệt khoảng 60-90 phút • Làm mát ống bình từ từ thêm 250 ml nước Tốc độ phân hủy cải thiện nhiều việc bổ sung muối nitrat chất xúc tác Kali sulfat thêm vào để tăng điểm sôi axit sunfuric chất xúc tác thêm vào để tăng tốc độ hiệu trình phân hủy Các tác nhân oxy hóa thêm vào để cải thiện tốc độ phản ứng • PTPƯ: Protein (-N) + H2SO4 = (NH4)2SO4 + CO2 + H2O Bước 2: Chưng cất Trong bước chưng cất ion amoni (NH4+) chuyển thành amoniac (NH3) cách thêm kiềm (NaOH) Amoniac (NH3) chuyển vào bình thu phương pháp chưng cất nước • NH4)2SO4 + 2NaOH = 2NH3+ Na2SO4 + 2H2O Khí amoniac sinh giải phóng khỏi dung dịch di chuyển khỏi bình phân hủy vào bình tiếp nhận, nơi chứa lượng dư axit boric Độ pH thấp dung dịch bình tiếp nhận chuyển đổi khí amoniac thành ion amoni đồng thời chuyển axit boric thành ion borat: • NH3 + H3BO3 (axit boric) = NH4 + + H2BO3 Bước 3: Chuẩn độ Nồng độ ion amoni thu được xác định hai loại chuẩn độ: Khi sử dụng dung dịch axit boric làm dung dịch hấp thụ, việc chuẩn độ axit-bazơ thực cách sử dụng dung dịch chuẩn axit sunfuric axit clohydric hỗn hợp chất thị Tùy lượng ion amoni có mặt, nồng độ khoảng 0,01N đến 0,5N sử dụng Ngồi ra, điểm cuối xác định phương pháp đo điện điện cực pH Cách gọi chuẩn độ trực tiếp • B(OH)O4 – + HX = X– + B(OH)3 + H2O (HX loại axit mạnh) Khi sử dụng dung dịch chuẩn axit sunfuric làm dung dịch hấp thụ, axit sunfuric dư (phần dư không phản ứng với NH3) chuẩn độ dung dịch chuẩn natri hydroxit chênh lệch lượng amoniac tính tốn Chuẩn độ gọi chuẩn độ trở lại • H2SO4+ 2NH3 =SO42- + 2NH4+ Công thức xác định nồng độ phần trăm nitơ Việc tính tốn% nitơ hoặc% protein phải tính đến loại dung dịch sử dụng yếu tố pha loãng sử dụng q trình chưng cất Phương trình sau sử dụng để xác định nồng độ phần trăm nitơ mẫu nặng m gam dung dịch axit HCl x M để chuẩn độ: Trong vs vb thể tích chuẩn độ mẫu mẫu trắng 14g khối lượng phân tử nitơ N Một mẫu trắng thường chạy lúc với vật liệu phân tích để tính đến nitơ dư thuốc thử sử dụng để thực phân tích Khi hàm lượng nitơ xác định chuyển đổi sang hàm lượng protein cách sử dụng thích hợp chuyển đổi yếu tố: % Protein = F % N 2.3 • • Ngun lí phương pháp chưng cất đạm Kjeldahl Phương pháp xác định đạm bao gồm sưởi ấm chất với axít sulfuric, phân hủy chất hữu q trình oxy hóa để giải phóng lượng nitơ giảm amoni sulfat Trong bước này, kali sulphat (K2SO4), Đồng Sunphat (CuSO4.5H2O) thêm vào để tăng điểm sôi môi trường (từ 337°C đến 373°C) Sự phân hủy hố học mẫu hồn tất môi trường ban đầu tối trở nên rõ ràng khơng màu Dung dịch sau chưng cất với lượng nhỏ natri hydroxyd, chuyển muối amoni thành ammonia Lượng amoniac diện, lượng nitơ có mẫu, xác định phép chuẩn độ Sự kết thúc bình ngưng nhúng vào dung dịch axit boric acid sulfuric Amoniac phản ứng với axit phần lại axit sau trung hịa NaOH 0.1N a Giai đoạn phá mẫu: Mẫu + H2SO4 → (NH4) 2SO4 (aq) + CO2(g) + SO2(g) + H2O (g) b Giai đoạn chưng cất giải phóng Amoniac: (NH 4) 2SO4 (aq) + 2NaOH → Na2SO4 (aq) + 2H2O (l) + 2NH3 (g) c Hấp thụ Amoniac: B (OH)3 + H2O + NH3 → NH4 + + B (OH) 4d Phản ứng ngược: B (OH) + H2O + H2SO4 → NaHCO3 (aq) + NaB (OH) (aq) + CO2 (g) + H2O 2.4 Ưu nhược điểm phương pháp Kjeldahl Ưu điểm: Phương pháp Kjeldahl sử dụng rộng rãi phạm vi quốc tế phương pháp tiêu chuẩn để so sánh với tất phương pháp khác Tính phổ biến, độ xác cao khả tái sản xuất tốt khiến trở thành phương pháp để ước tính protein thực phẩm Nhược điểm: Nó khơng đưa thước đo protein thực sự, tất nitơ thực phẩm không dạng protein Các protein khác cần yếu tố hiệu chỉnh khác chúng có trình tự axit amin khác Việc sử dụng axit sunfuric đậm đặc nhiệt độ cao gây mối nguy hiểm đáng kể, việc sử dụng số chất xúc tác có Kỹ thuật tốn thời gian để thực Xác định protein phương pháp Kjeldahl 3.1 Nguyên tắc Mẫu sau vơ hóa thu nitơ dạng Dùng kiềm mạnh đẩy ammonia khỏi muối chưng cất đạm Dùng nước kéo ammonia giải phóng sang bình hấp thu rịi định lượng kỹ thuật chuẩn độ kỹ thuật chuẩn độ ngược với thị Tashiro Protein Đẩy khỏi muối kiềm mạnh (NaOH): Định lượng bay acid HCl 0,1N (kỹ thuật chuẩn độ thế): Hoặc sử dụng 0,1N dư, chuẩn độ lượng dư dung (kỹ thuật chuẩn dộ ngược): dịch NaOH 0,1N Phạm vi áp dụng: Áp dụng cho tất loại thực phẩm Tài liệu trích dẫn: TCVN 8099 – : 2009 3.2 Dụng cụ, hóa chất, thiết bị 3.2.1 Dụng cụ - Dụng cụ thủy tinh thông thường phịng thí nghiệm Bình kjeldahl dung tích 500ml Bộ chưng cất Kjeldahl Hình Dụng cụ thủy tinh thơng thường phịng thí nghiệm 3.2.2 Hóa chất - Dung dịch H2SO4 đậm đặc Hỗn hợp xúc tác CuSO4: K2SO4 = 1:10 Dung dịch H3BO3 4% pH = 5,5, điều chỉnh pH dung dịch NaOH - 0,1N Dung dịch HCl 0,1N Dung dịch NaOH 0,1N Dung dịch H2SO4 0,1N Dung dịch Phenolphthalein 1% Dung dịch Tashiro alirazin natri sunfonate 10 - 3.3 Giấy quỳ tím Cách pha hóa chất * Đồng (II) sulfat kết tinh ( * Acid sulfuric, d = 1,84 g/mL, khơng có amoni * Acid chlohydric (HCl), dung dịch chuẩn độ tiêu chuẩn 0,1 M 0,2 M * Natri hydroxit (NaOH), dung dịch 40 %: cân 400 g natri hydroxit vào cốc dung dịch 1000 mL, thêm 400 mL nước, khuấy tan, chuyển sang bình định mức dung dịch 1000 mL, thêm nước đến vạch định mức Để yên dung dịch cho lắng hết cặn carbonat, sử dụng phần dung dịch Bảo quản dung dịch bình nhựa kín * Acid boric , dung dịch %: Cân 50 g acid boric vào cốc dung tích 1000 mL, thêm 900 mL nước nóng, khuấy tan, để nguội; thêm vài mililit dung dịch hỗn hợp thị, lắc đều; sau nhỏ giọt NaOH 0,1 M toàn dung dịch có màu hồng nhạt (pH khoảng 5), chuyển sang bình định mức dung dịch 1000 mL, thêm nước đến vạch định mức, lắc trộn đều, dung dịch chuẩn bị trước sử dụng Bảo quản kín 200C chai sẫm màu Chú thích: Có thể pha riêng dung dịch acid boric Khi sử dụng, 50 mL dung dịch acid boric cần cho thêm 10 giọt hỗn hợp thị, sau nhỏ giọt dung dịch NaOH, 0,1 M dung dịch có màu hồng nhạt (pH khoảng 5) * Hỗn hợp thị Hỗn hợp thị bromocresol xanh methyl đỏ: Cân 0,1 g bromocresol xanh 0,3 g methyl đỏ hòa tan 100 mL ethanol 95 % Bảo quản kín 20 0C chai sẫm màu 11 Hoặc sử dụng hỗn hợp methyl xanh methyl đỏ thay hỗn hợp bromocresol xanh-methyl đỏ Hòa tan 0,1 g methyl đỏ vào mL ethanol 95 %, thêm 0,05 g methul xanh, lắc cho tan hết, thêm ethanol cho đủ 100 mL lắc Bảo quản kín 200C chai sẫm màu * Amoni sulfat , dung dịch tiêu chuẩn 0,5 mg N/mL: Cân 2,3571 g amoni sulfat (đã sấy 1000C h, để bình hút ẩm) vào cốc dung tích 1000 mL, thêm 400 mL nước, khuấy tan, chuyển vào bình định mức dung tích 1000 mL, thêm nước tới vạch định mức, lắc đều, dung dịch thu có nồng độ 0,5 mg N/mL, bảo quản kín 20 0C 3.4 Thiết bị Hình Bộ cất đạm Kjeldahl Bình hứng Bình cất 3, 6, Khóa Phễu Bếp điện Bình cầu Bình rửa 10 Ống sinh hàn 12 Bảng 1: Một số thị màu thông dụng Màu Chất thị pHcm pT Môi trường acid, dạng phân tử Môi trường base, dạng ion pKct Metyl da cam (MO) 3,1 -4,4 Đỏ Vàng 3,7 Metyl đỏ (MR) 4,4 - 6,2 Đỏ Vàng 5,1 Quỳ 5,0 – 8,0 Đỏ Xanh Phenol đỏ 6,8 – 8,4 Vàng Đỏ Phenolphtalein (PP) 8,0 – 10,0 Không màu Đỏ 9,2 Thymol phtalein 9,4 – 10,6 10 Không màu Xanh 9,7 Alizarin vàng 10,0 – 12,0 11 Vàng Tím nhạt 10,7 Bảng 2: Một số thị hỗn hợp thông dụng Màu Thành phần thị pHcm pT Môi trường acid, dạng phân tử Môi trường bazo, dạng ion 5,2 – 5,6 5,4 Tím hồng Lục 4,1 – 4,5 4,3 Vàng Lục chàm Chỉ thị Tasiro A: Metyl đỏ 0,2% rượu B: Metyl xanh 0,2% rượu Tỷ lệ thể tích A:B = 1:1 A Metyl cam 0,2% nước B: Bromcresol chàm 0,1% nước có 2,9ml NaOH 0,05N cho 0,1g Tỷ lệ thể tích A:B = 1:3 13 A Metyl đỏ 0,2% rượu B: Bromcresol chàm 0,1% rượu 4,9 – 5,3 5,1 Đỏ nho Lục Vàng Tím Tỷ lệ thể tích A:B =1:3 A: Thymol phtalein 0,1% rượu B: Alizarin vàng rượu 0,1% 10,0 – 10,4 10,2 Tỷ lệ thể tích A:B = 2:1 3.5 Cách tiến hành Vơ hóa mẫu phá mẫu nhiều ống: cân xác khoảng 2÷4 g mẫu V (ml) dung dịch mẫu cho vào ống phá mẫu, lưu ý khơng để mẫu dính lên thành bình Thêm g hỗn hợp xúc tác CuSO4: K2SO4 = 1:10 Rót từ từ theo thành bình 10 ml H 2SO4 đậm đặc Lắc nhẹ để acid trộn mẫu Đặt ống vào vị trí phá mẫu Mở máy cài đặt thông số thời gian công suất làm việc máy Thực vô hóa đến thu dung dịch suốt Để nguội cẩn thận định mức đến 100 ml nước cất Hình Bộ phá mẫu Kjeldahl 14 Tiến hành cất đạm cất đạm Kjeldahl: - - - - Lắp đạm hình 3.2, khớp nối bôi lớp mỏng vaseline Rửa cất đạm cách chưng cất đến dung dịch chảy đầu ống sinh hàn trung tính (khơng làm đổi màu giấy quỳ tím) Sau đó, giảm áp đột ngột bình cầu (tắt điện, thêm nước trùm khăn lạnh vào bình cầu) để rút tồn dung dịch từ bình cất bình rửa xả bỏ Bình hấp th chứa sẵn 20 ml dung dịch H 3BO3 bão hòa, thêm giọt Tashiro đầu ống sinh hàn phải ngập dung dịch Cho mẫu vơ hóa vào bình cất, tráng phễu nước cất lần để tránh mẫu, thêm giọt alizarin natri sunfonat, thêm từ từ dung dịch NaOH 30% dung dịch chuyển sang tím đậm, tiếp tục thêm khoảng ml dung dịch NaOH 30% Tráng rửa phễu, khóa phễu, giữ nước cất phễu Chưng cất khoảng 15÷30 phút, tiến hành thử xem NH hết chưa cách dùng quỳ tím hứng vài giọt dung dịch chảy ống sinh hàn ( tráng rửa đầu ống sinh hàn trước kiểm tra), quỳ tím khơng đổi màu kết thúc q trình chưng cất Nếu quỳ tím chuyển sang màu xanh tiếp tục chưng cất quỳ tím khơng đổi màu Rửa cất đạm sau kết thúc trình chưng cất Lưu ý: Ngoài việc cất đạm cất đạm Kjeldahl, ta thực máy cất đạm tự động Chuẩn độ: Lấy bình hấp thu ra, chuẩn độ dung dịch chuẩn HCl 0,1N với thị Tashiro, dung dịch chuyển từ màu xanh sang màu tím Ghi thể tích dung dịch chuẩn HCl 0,1N tiêu tốn Nếu chuẩn độ ngược, thay 20 ml dung dịch H 3BO3 bão hào 20,00 ml dung dịch chuẩn H2SO4 0,1N Chuẩn độ dung dịch chuẩn NaOH 0,1N, dung dịch chuyển từ màu tím sang màu xanh Ghi thể tích dung dịch chuẩn NaOH 0,1N tiêu tốn Tiến hành tương tự mẫu trắng (thay dung dịch mẫu nước cất hai lần) 3.6 Tính kết Hàm lượng N tồn phần tính theo cơng thức (1) (2): Đối với mẫu rắn: N toàn phần (g/100g) (1) Đối với mẫu lỏng: N toàn phần (g/l) = (2) 15 Trong đó: V: thể tích dung dịch HCl 0,1N (ml) N: nồng độ đương lượng dung dịch HCl Vm: thể tích mẫu thử (ml) m: khối lượng mẫu thử (g) Hoặc hàm lượng N tổng số theo kỹ thuật chuẩn độ ngược tính theo cơng thức (3) (4): Đối với mẫu rắn: N toàn phần (g/100g) = (3) Đối với mẫu lỏng: N toàn phần (g/l) = (4) Trong đó: V1: thể tích dung dịch NaOH 0,1N V2: thể tích dung dịch H2SO4 0,1N N: đương lượng dung dịch H2SO4 0,1N Vm: thể tích mẫu thử (ml) m: khối lượng mẫu thử (g) F: hệ số điều chỉnh nồng độ dung dịch NaOH 0,1N Hàm lượng protein tổng xác định cách lấy kết N toàn phần nhân với hệ số 6,25 (hay hệ số tương ứng trường hợp cụ thể) Một số lưu ý phương pháp Kjedahl • Ngồi việc cất đạm cất đạm Kjeldahl, ta thực máy cất đạm tự động • Trong trình chưng cất đạm, dung dịch bình cất bị hút phía bình thải nguồn cung cấp nhiệt cho hệ thống cất đạm khơng ổn định • Có thể thay thị Tashiro thị metyl red 1% pha cồn Trong trình chưng cất đạm, màu dung dịch bình hứng chuyển sang màu xanh lục thị Tashiro màu vàng thị methyl red có nghĩa lượng sulfuric acid bị thiếu, cần thêm lượng sulfuric acid vào bình hứng 16 Tài liệu tham khảo: Giáo trình phân tích hóa lí thực phẩm https://tailieuxanh.com/vn/tlID2122399_tieu-luan-phan-tich- hoa-ly-xac-dinh-protein-bang-phuong-phap-kjedahl.html 17 ... phương pháp Biure, Tuy nhiên phương pháp nhiều phịng thí nghiệm sử dụng phương pháp Kjeldahl Trong tiểu luận nhóm giới thiệu phương pháp Kjeldahl xác định hàm lượng protein phương pháp Kjeldahl Xác. .. hàm lượng protein tham khảo theo bảng Phụ lục VI Phương pháp Kjeldahl 2.1 Phương pháp Kjeldahl gì? Đây phương pháp giúp xác định hàm lượng nitơ hợp chất hữu vô Phương pháp phân tích nitơ Kjeldahl. .. lượng nitơ xác định chuyển đổi sang hàm lượng protein cách sử dụng thích hợp chuyển đổi yếu tố: % Protein = F % N 2.3 • • Ngun lí phương pháp chưng cất đạm Kjeldahl Phương pháp xác định đạm bao