PHƯƠNG PHÁP xác ĐỊNH CAROTENE TỔNG số

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CAROTENE TỔNG SỐ Phương pháp xác định carotene có rau sản phẩm rau 1.1 Phạm vi áp dụng Dùng để xác định hàm lượng caroten ( C40H56) sẵn có bổ sung vào rau , sản phẩm rau ,quả 1.2 Phương pháp A: xác định hàm lượng carotene có sản phẩm có chứa hàm lượng chất béo nhỏ % khối lượng 1.2 nguyên tắc Chiết caroten khỏi mẫu thử hỗn hợp ete dầu mỏ axeton loại bỏ axeton tách caroten từ carotenoid sắc kí cột xác định hàm lượng carotene đo phổ 1.2.2 thuốc thử vật liệu thử Chỉ sử dụng loại thuốc thử loại tinh khiết phân tích nước cất nước đá loại khoáng nước có độ tinh khiết tương đương +) ete dầu mỏ có dải sơi khoảng 500C đến 700C +) Hỗn hợp chiết chuẩn bị sau : hòa tan 0.2g hydroquinone 40ml axeton ,sau thêm 160 ml ete dầu mỏ +) natri sulphat ,khan sấy nhiệt độ 100 0C/2-3h giữ bình kín +)cát thạch anh rửa axit sấy khô lị nung +) chất nhồi cột +) nhơm oxit khử hoạt tính tạo huyền phù nước sau : nung nhơm oxit 3h lị nung 500 0C, để nguội giữ tủ hút ẩm trước sử dụng , chuyển 50 g nhôm oxit chuẩn bị vào bình cầu có khớp nối thủy tinh mài , thêm 5,5 ml nước trộn kĩ nhận huyền phù đồng pH nằm khoảng 910 +) hỗn gợp magie oxit/bột thủy tinh với tỉ lệ :2 +) hỗn hợp nhôm oxit/ canxi hydroxit với tỉ lệ 1:1 +) hỗn hợp nhôm oxit/natri sulphat khan với tỉ lệ 3:1 +)natri clorua dung dịch 300g/l 1.2.3 dụng cụ ,thiết bị +)máy đo phổ đo bước sóng 450 nm trang bị cuvett có chiều dài đường quang cm +) dụng cụ lọc witt có phểu cổ nối mài bên ,nắp đậy thủy tinh mài ,ống bên cạnh để lọc vào cốc có mỏ bình khác áp suất giảm +)bơm nước +) nồi cách thủy có khả trì nhiệt độ 30 – 35 C +)bộ cô chân khơng +) cột sắc kí có đường kính 10 – 15 mm +) lọc loại P40 +)bông sợi nhúng ete dầu hỏa +) cối chày phòng thí nghiệm +) bình hút ẩm chứa chất hút ẩm hiệu +) bình nón dung tích 500 ml +) bình cầu đáy trịn dung tích 100-500 ml , có khớp nối thủy tinh mài +) phễu chiết dung tích 1000 ml +) bình định mức vạch dung tích 50 ml 100ml 1.2.4 chuẩn bị mẫu thử 1.2.4.1 sản phẩm khơng đồng dạng lỏng Ví dụ nước , nước đặc, siro Trộn kĩ mẫu phịng thử nghiệm 1.2.4.2 sản phẩm dạng sánh ví dụ : mứt nhuyễn nước đường sản phẩm dạng rằn ví dụ : rau Loại bỏ hạt cần bỏ phần vỏ cứng , sau trộn kĩ mẫu phịng thí nghiệm Cân tất hạt phần cỏ cứng ,… Đã tách khỏi mẫu để hiệu chỉnh kết phân tích thu 1.2.4.3 sản phẩm đông lạnh đông lạnh sâu Rã đơng mẫu phịng thí nghiệm bình kín cho chất lỏng tạo thành trình rả đông vào sản phẩm trộn kĩ 1.2.5 cách tiến hành Chú ý : thực nơi tối , tránh ánh sang trực tiếp 1.2.5.1 phần mẫu thử Cân lượng từ – 10 g mẫu thử chuẩn bị có chứa khoảng – 150µg carotene 1.2.5.2 chuẩn bị dung dịch thử + Chuyển định lượng phần mẫu thử vào cối thêm khoảng 20ml hỗn hợp chiết.thêm 20 g natri sulphat 30 g cát thạch anh nghiền kĩ Gạn dịch chiết thu qua lọc cho vào bình nón 500 ml lặp lại việc chiết thu dịch chiết không màu , thu lấy dịch chiết lọc vào bình nón chuyển định lượng phần cịn lại vào lọc rữa hỗn hợp chiết , thu lấy nước rửa vào bình nón + chuyển hỗn hợp dịch chiết thu sang phễu chiết 1000 ml rửa vài lần với tất khoảng 300 ml đến 400 ml nước để loại hết axeton khuấy trộn cẩn thận dịch chiết để tránh tạo nhũ hóa Nếu có tạo nhũ lặp lại việc chiết sử dụng phần mẫu thử khác tiến hành quy trình theo quy định , sử dụng dung dịch NaCl 300g/l thay cho nước + cho 15 g natri sulphat vào dịch chiết rữa , trộn để yên 15 chuyển dung dịch qua lọc, làm đầy đến bình cầu đáy trịn 500 ml natri sulphat khan Rữa natri sulphat lần , lần dung 10 ml ete dầu mỏ , thu lấy nước rửa vào dịch lọc bình nón + cô đặc dịch lọc thu cô chân không nồi cách thủy đặt nhiệt độ 30 – 35 0C.sau chuyển định lượng sang bình định mức vạch 100 ml thêm ete dầu mỏ đến vạch 1.2.5.3 rữa giải Chú ý : suốt q trình rữa giải , cột phải ln làm đầy ete dầu mỏ mức bề mặt chất hấp thụ _ chèn nút sợi tẩy nhờn vào phía cột sắc kí Đặt cột lên thiết bị witt vừa lắc nhẹ vừa cho huyền phù nhôm oxit khử hoạt tính,hoặc hỗn hợp magie oxit/bột thủy tinh vào cột đến khoảng 15 đến 20 cm nhôm oxit chất hấp thụ thích hợp để tách lycopene carotenoid Khi phân tích sản phẩm chứa lycopene(như cà chua sản phẩm cà chua ), dung hỗn hợp nhôm oxit / canxihydroxit làm chất hấp phụ Sử dụng bình cầu đáy trịn 100 ml làm bình thu nhận nối thiết bị witt với bơm nước _đổ ete dầu mỏ vào đầy cột mức ete dầu mỏ hạ xuống khoảng cm bề mặt chất hấp phụ cho thêm khoảng ml đến 20 ml dung dịch mẫu thử (v2) tùy thuộc vào cường độ màu dung dịch Khi dung dịch mẫu thử mức cao bề mặt chất hấp phụ khoảng cm thêm 30 ml ete dầu mỏ _tiến hành rửa giải đến dịch rửa giải khơng cịn màu _ tùy thuộc vào cường độ màu dịch rửa giải mà ta điều chỉnh thể tích dịch rửa giải cho ml dịch rửa giải chứa khoảng 0.4 _3.0µg caroten ghi lại thể tích cuối dịch rửa giải(v2) 1.2.5.4 đo phổ Tiến hành đo phổ dịch rửa giải dựa vào ete dầu mỏ làm mẫu trắng, bước sóng 450nm , dung cuvett có chiều đà đường quang 1cm Hệ số hấp thụ phân tử dung dịch đối chứng β – caroten ete dầu mỏ 450 nm 2530 1.2.5.5 biểu thị kết Tính hàm lượng caroten , biểu thị theo β – caroten ,theo công thức W(C40H56) Trong : W hàm lượng caroten (µg/g) A độ hấp phụ dịch rửa giải V1 thể tích dung dịch thử (ml) V2 thể tích dung dịch thử dùng để phân tích sắc kí (ml) V3 thể tích cuối dịch rửa giải(ml) 0.25 hệ số hiệu chỉnh β – carotene M khối lượng mẫu thử (g) 1.3 phương pháp B : xác dịnh hàm lượng carotene có sản phẩm chứa hàm lượng chất béo lớn 0.5 % khối lượng 1.3.1 ngun tắc Xà phịng hóa mẫu thử cách sử lí dung dịch KOH cồn chiết carotenoid hỗn hợp ete dầu mỏ dietyl ete ,rồi xác định hàm lượng carotene đo phổ 1.3.2 thuốc thử vật liệu thử +) ni tơ +) etanol , dung dịch 96% thể tích +) KOH dung dịch 500g/l Hịa tan nước cất 5g KOH đựng ống đong chia độ có nút đậy thủy tinh mài, thêm nước đến 10 ml +) pyrogalol Hòa tan 6.25 g pyrogalol nước đựng bình định mức vạch đến 25 ml thêm nước đến vạch Chuẩn bị dung dịch KOH 600g/l cách hòa tan 60g KOH nước đựng bình định mức vạch 100 ml.thêm nước đến vạch Chuẩn bị dung dịch kiềm cách trộn 15 ml dung dịch pyrogalol với 90 ml dung dịch KOH +) hỗn hợp chiết : trộn phần ete dầu mỏ với phần dyetyl ete không chứa peroxit +) KOH dung dịch 30g/l : hòa tan nước 1.5 g KOH nước đựng bình định mức vạch 50 ml , them nước đến vạch +) phenolphtalein dung dịch % Hòa tan 1gphenolphtalein dung dịch etanol 60% thể tích thêm etanol đến vạch +) chất chống oxy hóa 1.3.3 thiết bị dụng cụ +) thiết bị xà phịng hóa có dịng khó trơ đối lưu , gắn với bình hấp thụ chứa dung dịch kiềm pyrogalol để loại hết oxy khỏi dịng khí +) phễu chiết 250 ml 1.3.4chuẩn bị mẫu thử 1.3.5 cách tiến hành 1.3.5.1 phần mẫu thử Cân lượng mẫu thử chuẩn bị có chứa khoảng 50 – 150 µg carotene cho vào bình cầu đáy trịn 100 ml 1.3.5.2 chuẩn bị dung dịch thử +) cho 30 ml dung dịch etanol , ml dung dịch KOH chút chất chống oxy hóa vào phần mẫu thử , nối bình cầu vào thiết bị xà phịng hóa mở dịng khí nito cho xà phịng hóa dịng khí đối lưu , giữ dung dịch sơi nồi cách thủy 30 +) làm nguội hỗn hợp chuyển định lượng vào phễu chiết 250 ml dung 20 ml nước cất để tráng cho vào phễu chiết này.chiết chất xà phịng hóa cách khuấy trộn hai lần với 50 ml lần với 20 ml hỗn hợp chiết rửa kĩ dịch chiết thu 50 ml dung dịch KOH sau dó rử bang nước cất dịch chiết hết hẳn kiềm +) loại nước khỏi dung dịch chiết Cô dịch chiết 1.3.5.3 rửa giải đo phổ 1.3.5.4 biểu thị kết phương pháp xác định hàm lượng carotene có thức ăn chăn nuôi 2.1 nguyên tắc phương pháp Dựa khả hòa tan carotene dung môi hữu cho màu vàng,cường độ màu tỉ lệ thuận với hàm lượng carotene đo máy quang điện hay quang phổ kế bước sóng 440 – 450nm carotene tinh thể dễ bị oxy hóa khơng khí nên việc chẩn bị thang chuẩn thường sử dụng dung dịch kali bicromat hay azobenzen Trong dung mơi hữu khơng carotene mà cịn sắc tố diệp lục chất khác bị hịa tan cần thiết phải tách chúng khỏi carotene phương pháp sắc kí hấp phụ 2.2 lấy mẫu 2.3 dụng cụ hóa chất 2.3.1 dụng cụ Máy cắt mẫu thực vật , bảo đảm phần cắt nhận có độ dài – cm Máy nghiền mẫu phịng thí nghiệm Máy so màu quang điện có kính lọc màu xanh ứng với bước song 440 – 450 nm hay quang phổ kế Cân phân tích có độ xác đến 0.001g Cân kĩ thuật có độ xác đến 0.05g Cối chày sứ ống đong dung tích 100 ml buret dung tích 50 ml bình định mức dung tích 100ml ; 1000ml bình nón có nút mài 100-150 ; 200 ml bình bunden dụng cụ có hút chân khơng cột hấp phụ đường kính – cm đũa thủy tinh 2.3.2 hóa chất Kali bicromat Azobenzen Ete petrol hay xăng trắng Oxyt nhôm ( khan ) Oxit canxi(khan) Natri sulphayt(khan) Natri bicabonat Cồn etylic Nước cất hay nước có độ tinh khiết tương đương 2.4 chuẩn bị thử +) chuẩn bị nhơm oxit có độ ẩm 10% Thêm 100 ml nước cất vào 900g nhôm oxit khan trộn thuốc thử bảo quản lọ có nút mài sử dụng để phân tích khơng sớm ngày sau lúc chuẩn bị +) chuẩn bị cột hấp phụ Đặt vào chỗ hẹp ống allin nút hút ẩm đổ lên đo – cm chất hấp phụ -oxit nhơm có độ ẩm 10% dung đũa thủy tinh dồn nhẹ lớp oxyt nhơm xuống , phủ len miếng mỏng đổ tiếp lên – cm natri sulphat khan lắp ống hấp phụ vào nút bình bunden Trước chạy sắc kí cần đổ lượng ete petrol lên hút nhẹ chân không ete petrol thấm ướt cột hấp phụ, chảy xuống phía cịn lại phía chất hấp phụ +) chuẩn bị dung dịch gốc kali bicromat Hòa tan 0.720 g kali bicromat (đã sấy khô đến khối lượng không đổi )trong nước cất đưa thể tích dung dịch lên vạch 1000 ml ml dung dịch tương ứng theo màu sắc với 0.00416 mg carotene dung dịch bảo quản tới năm sau chuẩn bị +) chuẩn bị dung dịch gốc azobenzen Hòa tan 14.5 mg azobezen tinh thể 100 ml cồn etylic 96 , ml dung dịch tương ứng theo màu sắc với 0.00235 mg carotene +) chuẩn bị thang dung dịch chuẩn Dung buret cho vào bình định mức dung tích 100 ml 10;20;30;40;50 ml dung dịch gốc kali bicromat đưa thể tích đến vạch mức nước, cẩn thận trộn Đo mật độ quang dung dịch chuẩn máy so màu với cuvett có chiều dài 20 – 30 mm bước song 440 – 450 nm Dung dịch đối chứng nước cất Từ kết thu tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn 2.5 tiến hành thử Mẫu cỏ khô , rơm rạ cắt máy hay kéo thành đoạn có chiều dài – cm , trộn mảnh nilon sau từ chỗ khác lấy lượng mẫu 100 g nghiền nhỏ máy nghiền loại bột từ than xanh có kích thước – mm phân tích khơng cần phải nghiền Từ lượng mẫu trộn , cân – 2g mẫu với độ xác đến 0.05 g chuyển vào cối sứ nghiền nát cẩn thận với – 10 g cát hay thủy tinh giã nát Mẫu thức ăn giàu nước ( thức ăn xanh ,củ , thức ăn ủ ) cắt nhỏ, đảo ddeuf mảnh nilon từ nhiều chỗ khác cân lượng 2-4 g mẫu với độ xác đến 0.05g cho vào cối sứ chưa sẵn – 10 g cát hay thủy tinh giã nhỏ mẫu thức ăn ủ chua hay ủ héo cho thêm lượng soda đầu mũi giao nhỏ nhanh chóng nghiền nát hỗn hợp cối sứ với thời gian khơng – phút Để nhận khố lượng rời m, khử nước mẫu cần them vào 15 – 25 g natri sulphat khan, đảo Chuyển cẩn thận lượng mẫu xử lí vào bình nón dung tích 100-150ml, rót vào 20 – 25 ml ete petrol Rửa cối chày sứ vài lần ete petrol chuyển vào bình nón Dung đũa thủy tinh khuấy đậy nắp bình lại để yên 20 – 24 h bóng tối Sau thời gian chiết suất , cẩn thận chất chắt dịch chiết lên cột sắc kí chuẩn bị sẵn tiến hành lọc chân khơng yếu rửa phần cịn lại bình nón ete petrol lại đổ lên cột tiến hành vài lần đến dung dịch chảy trở nên khơng màu Đo thể tích dung dịch ete petrol có chứa carotene thu từ bình bunden ống đong xilanh.sau đo mật độ quang dung dịch máy so màu với cuvett có chiều dày 20 – 30 mm bước sóng 440 – 450 nm Dung dịch đối chứng ete petrol Trong trình phân tích lượng đáng kể carotene bị tác dụng mạnh ánh sang phá hủy khơng khí đo mật độ quang dung dịch chiết cần tiến hành khoảng thời gian ngắn Nếu mật độ quang dung dịch chiết > 0.6 cần pha lỗng cách lấy xác 25 ml dd cho vào 50 ml them tiếp ete petrol đến vạch mức.kết trường hợp nhân đơi 2.6 tính tốn kết Hàm lượng carotene (X) biểu thị mg 1kg mẫu theo cơng thức : X 1000 Trong : A : lượng tương đương với dung dịch gốc tìm thấy đồ thị chuẩn(ml) 0,00416 : hệ số chuyển ml dung dịch gốc kali bicromat lượng tương đương với carotene (mg) V: thể tích dịch lọc mẫu thử sau qua cột hấp phụ(ml) B : thể tích dung dịch chuẩn(ml) M : khối lượng mẫu thử (g) 1000 : hệ số chuyển kg mẫu Hàm lượng carotene (X1) biểu thị mg kg dạng vật chất khô : Trong đó: X : hàm lượng carotene kg mẫu dạng khơ khơng khí (mg) W : độ ẩm mẫu (%) ... thị kết phương pháp xác định hàm lượng carotene có thức ăn chăn nuôi 2.1 nguyên tắc phương pháp Dựa khả hòa tan carotene dung môi hữu cho màu vàng,cường độ màu tỉ lệ thuận với hàm lượng carotene. .. kí (ml) V3 thể tích cuối dịch rửa giải(ml) 0.25 hệ số hiệu chỉnh β – carotene M khối lượng mẫu thử (g) 1.3 phương pháp B : xác dịnh hàm lượng carotene có sản phẩm chứa hàm lượng chất béo lớn 0.5... thử cách sử lí dung dịch KOH cồn chiết carotenoid hỗn hợp ete dầu mỏ dietyl ete ,rồi xác định hàm lượng carotene đo phổ 1.3.2 thuốc thử vật liệu thử +) ni tơ +) etanol , dung dịch 96% thể tích