Tổng quan về phương pháp xác định gốc tự do và các dạng hoạt dộng cùa chúng

RỘ&ÁM Y TÊơw JÍỜ3 TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI 83C8 caso VŨC8 Đổ thực đế tài này, nhận đươc quan tâm, hướng dẫn tận tình thấy cô Tôi xin bàv tỏ lòng kính Lrọng biết ơn sâu sắc tới: - Thầy giáo-PGS* TLSKH Lẽ Thành Phưức - Cô giáo-Ths Hoàng Thị Tuyết Nhung TRỮỠNG THỊ MAN quan tầm, hết lòng giúp đỡ, hướng dẫn hoàh thành khoá luận TỔNG QUAN VỂ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH GỐC Tự DO Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể thầy, cô, anh VÀ CÁC DẠNG HOẠT ĐỘNG CỦA CHÚNG chị kỹ thuật viên Bộ môn tạo điều kiện thuân lợi giúp đỡ thựcKHÓA khoá xin gửi lờisĩcảm ơn59 tới(2004-2009) cán LUẬNluận TỐTTôi NGHIỆP Dược KHỚA thư viện ĐH Dược HN; thư viện Quốc Gia; thư viện khoa học kỹ thuật, giúp đỡ tìm tài liệu quý giá trinh làm luận văn Tôi xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, Đảng Uỷ nhà trường toàn thể thầy cô giáo tao điều kiện tốt cho thực khoá luận - Người hướng dăn : P(ỈS TSKH* Lê Thành Phước Cuối cùng, xin gửi lòi cảm ơn sâu sắc đến gia dinh bạn bè ThS Hoàng Thị Tuyếí Nhưng động viên giup hoàn khoáHóa luận - đỡ Nưitôi Ihực hiệnthành : Bộ mân Đại Cương - Vô Cơ - Thcfi gian thực : 02/2009 - 05/2009 Hà Nội, ngày 14 tháng năm 2009 HÀ NỘI-5/2009 MỤC LỤC Trang ĐẶT VÂN ĐỂ Phẩn lĩ ĐẠI CƯƠNG VỀ Gốc Tự DO VÀ CÁC DẠNG HOẠT ĐỘNG CỦA CHÚNG 1.1- Gốc tự dạng hoạt dộng chúng 1.1.1- Khái niệm 1.1.2= Sự lílĩlh thầnh gốc tự eơ 1.1.3- Vai irò lấc hại cua gốc lự .6 1.2- Hệ thống bảo vệ chồng gốc tự ccr thể 1.2.1- Các enzym nội bào 1.2.2- Các chất phi enzym phân tử nhó 1.2.3- Các phối tử tạo phức khoá kim loại 10 1.3- Các nhóm chất chông gốc tự 10 1.3.1- Nhóm chất biết rõ cấu tạo phân tủ chế tác dụng 10 1.3.2- Nhóm dược liệu, chế phẩm từ dược liệu, thực phẩm cố hoạt tính chống oxy hoá 10 1.3.3- Hormon 11 Phẩn 2: CÁC PHƯƠNG PIIẢP XÁC ĐỊNH GỐC Tự DO VẢ CẮC DẠNG HOẠT ĐỘNG CỦA CHÚNG .13 2.1- Các phương pháp xác định trực Eìếp 2.1.1- 13 ESR bẫy spin 13 2.1.6- Phái dạng elor hoá (HOCI) .20 2.1.7- Phát hydrogen peroxid {H202) 21 2.1.8- Phát oxy đơn bội ('02) 22 2.2- Các phương pháp dáu vân tay 23 2.2.1- Đo trình peroxyd hoá lipid (POL) 23 2.2.2- Đo tổn thương ADN 2.2.3- Đo tổn thương protein 31 2.2.4- Đo hoạt tính enzym superoxyd dismutase (SOD) 30 32 2.2.5- Đo cấc chất chống peroxỵd GSH GSHPx 33 2.2.6- Đo hàm lượng selen 35 2.3- Các phương pháp hoạt tính chống oxy hoá toàn phần .36 2.3.1- Phương pháp TRAP 36 2.3.2- Phương pháp ABTS 37 CHÚ GIẢI CHÙ VIẾT TẮT ABTS: 2,2-aáno bỉs-(3- ethylbenzothiazolm-6-sunfonic acid) ESR: Electron Spin Resonance (Cộng hường spin electron) EPR: Electron Paramgnetic Resonancc ( Cộng hưởng thuận từ eỉectron) FAD : Flavin Adenin Dinucleotid FMN : Fiavin tnononuclcotidc GC-MS: Gas chrornatography- mass spectrometry (Sẳc ký khí - khối phổ) GR: Glutathion rcductase QSHi Ỡltỉtâửliỡn GSHPs: Glutathion peroxydase HPLC: High pcríormance liquid chromatographyỊSãc ký lỏng hiệu can) IsoPs: Các Isoprostan MDA: Maìondĩaldehyd NAD : Nicotinamid Adenin Dinudeotid NADPH.2; Díhvdronicotinainide adenine dinucleotid phosphat POL: Peroxvd hoá lipid PUFAs: Polyunsaturated fatty aci.ds (Các acid béo khổng có khả sinh cholesterol) ROS : Reactive oxygen species (Dạng oxy hoạt động) RCS : Reactive chlorine spccics (Dạng clor hoạt động) RN§ : Rsâcỉivc ĩiitrogên spẽcỉês ( Dạng nitỡlìoặt động) SOD: Superoxyd dismutase TAS; Total Antioxidant Status ( Hoạt tính chồng oxy hoá toàn phần) TRAPr ToiaL peroxy radical Irapping antioxyđant pararaeter assay (Đo thông số chống oxy hoá toàn phần bãy gốc (pcroxyl) ) TBA: Thiobarbituric acid TBARS: TBA - reactivity or TBA reactive material (Chất phản ứng vối TBA) ĐẶT VẤN ĐỂ Trong năm gần dây, gốc Lự dạng hoại động chúng mổi quan tâm lớn người, đặc biệt Y- Dược học đại tiên quan cùa chúng đến nhiểu chế bệnh lý nghiêm trọng người Gốc tự sinh từ trình chuyển hoá CƯ thể từ ngOíũ môi tnrờng xâm nhập vầo thể Các gốc tự dạng hoạt động chúng có khả oxy hoá cao, phát sinh phản ứng dây chuyền làm tổn hại đến tế bào, tổ chức, gây nhiều loại bệnh như: bệnh lý tim mạch, ung thư, đái Lháo đường làm Lãng quấ trình lão hoá người Do gốc tự quan tâm nghiên cứu để tìm chất chống gốc Lự do, chống oxy hoá hiệu dùng cho phòng diểu trị nhiều loại bệnh tật góp phần bảo vệ sức khoe, kéo dài tuổi thọ người Để đánh giá lác động vai trò gày lổn thương oxy hoá cùa gốc tự dạng hoạt động chúng bệnh lý người đánh giá hiệu thuốc phòng điều trị bệnh trẽn, người ta dựa vào việc xác định gốc tự dạng hoạt dông chúng, Hiện nay, nhiều trường Đại học, Viện nghiên cứu triển khai ứng dụng phương pháp nghiên cứu, xác dinh gốc lự Irong sinh học dược học Xuất phát từ thực tế trẽn thực đề tài: “ Tổng quan phương pháp xác định gốc tự dạng hoạt dộng cùa chúng” vtìri hai mục tiêu: Viết tổng quan hình thành gốc tự dạng hoại động chúng thổ, tự nhỉcn Hộ thống nguyên tắc phương pháp xác định gốc tự dạng hoạt dộng chúng PHẦN I : ĐẠI CƯƠNG VỂ Gốc Tự DO VÀ CÁC DẠNG HOẠT ĐỘNG CỦA CHỦNG 1.1-GỐC tự dạng hoạt động chúng [6] [12] 1.1.1- Khái niệm Gốc tụ (R‘) tiểu phan hoá học (phán tử, mảnh phân tử, nguyên tử, ion) có electron độc thân ( e- hưú trị) tồn độc lập Ví dụ; 0H\ộ ỉị Từ phản ứng thứ cấp gỏ'c tự do, nhiều chất gốc hoạt lính oxy hoú mạnh tạo thành Ngày lý thuyết gốc tự chứng minh thể người tồn nhiều loại gốc tự dạng hoạt động chúng (bảng 1) 1.12- Sự hình thánh gốc tụ thể Trong thể, gốc tự hình thành Ihoo đường: 1.12.1- Từ chuồi hô hấp tểbào trơng ty thể Chuỗi vận chuyển Hydro c-( tóm tắt); Ferocytocrom + 4H‘ + 02 = Fericytocrom 4- 2ĩFO (Fe3+) (FC2+) Đó phản ứng tổng kết cho ví dụ vận chuyển 4H+ 4- 4Ể theo sơ dồ sau; Xúc tác bởi; Các enzym vận chuyển hydro: Dehydrogenase (với NAD; ĩ ô 2+~e= '0'j (1) FAD; FMN Coenzym); enzym vân chuyển e (5 cytochrom phức Fe2+, Fe3+) catalase, peroxyda.se, glutalhĩon, vitamin c Sau đó, phân tử OT nhận electron: gổc anion superoxyd *0_2 + e+ 21 r = í2o2 (2) Hydroperoxyd H2G2 + ể + H* = H20 4- :GR (3) Gốc hydroxyl ‘OH + e + H+ = Hp Phản ứng tổng: (4) 02 + É? + 4H' = 2H ,0 + Năng lưựng(ATP) Do rò ri, thẩm lậu, tự huỷ gốc: '02 + '02 + 2H* = H2OZ + *02 (5) oxy đơn bội *02 + H202 = OH + ỎH + l02 (ố) 103 lít.mol"1 s không xúc tác: lỉaber - weìss K 2= cổ xúc tác Fe2f, Cu+: Fenton Tốc độ phản ứng Fcnton » phản ứng Habcr- wciss Từ phản ứng trên, xuất chất độc hại: o, Gốc xuất đáu tiên hô hấp tế bào, không độc, khơi mào cho phán ứng sinh gốc khác OII* Gốc nguy hiểm (gốc đom giản, khối lượng nhỏ, hoạt tính mạnh) H>02 Phan lử oxy hoá- khử mạnh, độc hại '02 Phan tử lượng cao, nguy hiểrn tiểu phân gọi chung dạng oxy hoạt động (OXHĐ) H2N^ ^.COOH H2N^ ^COOII 02 , NO-synthase C-NH(CH,)rCH ,C-NỊỊ(g[,)rCỊỊ HN ỉ 1.2.2TừL-Arginia trìnhỜ hoá ỉỉpìd =L-Cilrulĩn POL) ỉLI.12.3Từperoxyd phản ứng tạo(peroxydlìpid gốc khác thể thể ị nội môi) 2.5nhiễm mối trườngỉ ngoại môi)trung gây ôcơnhiễm NADPH ,l+1 oir ( POL phát triển nhiều gốc - Xenobiotic( dị rasinh): Hoá chất, trừhoạt sâu,đông diệt khác) cỏ, CC1 từ môi lạo ROS, RNS, RCS) -> Mịetạo + •Ochất Màng sinh học chủ yếu cấu tạo phospholipid với acid béo chưa no trường Fe2* + ô? —* Feỉ+ + •0 có áiR"lực mạnh(10 vói) OXHĐ vào hoá tạo H,0cơ-4thể RHsẽ+chuyển /QH (LH) Me"' L_ + Õ7 J Sơ đổ trình POL có thểVtóm lược sau; (70 % * X » X thể) - — * + X —» X'+ » (12) í.,-OII( Tham R* +gia LHPOL -» RH + L' Iĩyđroxyl hoá) OH- +LH-»H20 + l/ Tiếp tục: * CC14—>cr+ccv CCI3O2' + CC12’ (13) i í L +02^L00 gây POL mãnh liệt(7) gan - KỈm ỉoại nạng: LOO* + LH LOOH + L* Gốc NO' sinh nội mạcLOO* mạch máu (gây L’ + o, —► tiếp lụcgiãn quaymạch) vòng nhưtrong tế bào (gây1Ocác chức khác Hoặc a + LH -» LOOH ‘ khơicơmào gốccủa môi trường +t* Sự lạo Ihiinh gốc tự ■do02trong thể phản tácứng động Quú trình POL dẫn đến peroxyđ hoá lipid(LOOH), phân cắt LH (như acid 2+ Mgoài ra, Fe xúc lác phản ứng Fenton tạo ‘OH, '02 gây nguy hại (ngoại arachiđonic tạo MDA, ethan, pentan) - Thuữ'c( Blcomycin, Artcmisinin ) sinh): - HợpCác chái tia, Niiư:các Ar-bức NOn,xạR,R2NH- NO , Nitrcsamin 1.12.4Vi(7) khuẩn, virus, ký sinh vạt gốc + gốc (polymer hoá): Phản -ứng bị dập tắt • Tia phóng xạ( đâm xuyên) L* + L* -» L-L Polymerhoá I.Ỉ2.6- Cúc slressị tải thể "Ị chất tinh (8) thần) R,- R2 L* —^+Rị -tR T (11) R* -> L-R I Phá vỡ cân nội môi làm tăng R' thể gáy sựẹss oxy họẩ ( Hoặc lv peroxvd hoạt tính cao, tạo phản ứng sinh gốc vượt qua tải gổc tự do) gàyPOL H0do 2' màng: 1.1.3- Vai trò tác hại gốc tự [6] [8] Lì 3.1- Vai trờ gấc tự doJỊ[61 Ht LQQ* Hydroperoxyd(HO-,‘) mội acid diện lygổc hoàn toàn pH thể —> H+ + *0~2 Gốc hvdro Iípopcroxyd * Trong hoá học: Trong phán ứng phân huỷ, tổng hợp hoá học thực khai mào LOOH ► phản ứng sinh gốc.[6] LO-tạo + OH* chất là(9) trình bẻ gãy liên kết, gốc tự đo dể hình thành liên kết mới, • N TiaGỐC tử ngoại alkaxyl gổc hvdroxyl chất mói ■'-* L* + -OOH Gốc acid béo gtíc hydrosuperoxyd Các gốc lại dóng vai trò R* ban đầu khơi mào lại phản ứng dây ST - > ST* -»ST + '02 u hắc tò ung thư da chuyên (7) 56 * Trong sinh học: R 'có nhiều vai trò quan trọng: > Dị hoá, ly giải chất > Tổng hợp chất (2 gốc dễ kếl hợp tổng hựp hormon sleroid} thông qua R' > Sản xuất nâng lượng ATP > Bảo vệ (tiêu huỷ virus; vỉ khuẩn; ký sinh trùng; lế hàn gíà, hỏng, ung thư) > Điểu hoà tính thấm màng Tuy nhiên, §ự ĩhẩm lậu, rò rỉ, dư thừa R' khỏi cấc trình hữu ích lằ mặt trái gay nguy hại cho thể ỉ ì 3.2- Tác hại gấc tự [R] Tất phân tử sinh học bị gốc tự cõng, phân tử lipid dễ Màng tế bào giàu acid béo chưa no, phân tử dễ bị gốc có tính oxy hoá tán công- Sự hưỷ hoại cấu trúc acid héo chưa no trình peroxyd hoá lipiđ (POL), sinh gốc mới: L*, LOO' Băn than gốc LOO’ chuyển dịch điện tử Lạo pcroxid nội phân huỷ thành mảnh có số nguyên tử cacbon ngắn hơn, dạng andehyd độc hại như: hydroxynonenal, malonyldiandehyd, etan, pentan Quá trình phân huỷ gây tiêu huỷ màng tế bào, lạo sản phẩm aldehyd độc hại Đây kiểu gây tổn thương, viêm hoại từ đặc biệt phần ứng gổc tự Quầ trinh nầy gắn liền với tổn thương mổ cảc bệnh (nhu tổn thương gan CC1 4, xơ vữa động mạch, tổn thương khối u ác tính ) Các ADN bị gốc có tính oxy hoẩ mạnh công, gốc hình thành gần sát phân tử ADN Những tmcleobase tìm thấy ỏ nuớc tiểu người chứng có công liên tục gốc tự phân tử ÀDN Dù sửa chữa với hiệu cao, mộl sổ tổn thương vân có GSH GSH H GS‘H‘HO* GS H20 O H GS-H-HO* —* H20 thể tíchchống tụ lại,oxh saungoại bào( thời gian lượng lích tụ lạingoại đù đểbào, dãn máu : tới dột hiến •OCác chất thân nước) gồm dịch GS từ mà sinh ung thư VitaminC, glutathion(GSH) 1.2- Hệ thống bảolấc vệdụng chống gốchoà tựgốc tự Các chấl trung docơ theo các[6] cách: Hê thống bảo vệ cư thể bao gổm: enzym, chất chống oxy hoá phi (Ị) Cơ chế Cần hẳng hydroquinon- qiùnon enzym phối tử tạo phức khoá ion kim loại ĩ.2.1- Các enzym nội bào * SOD (superoxyd dismutase): * Mn-SOD (superoxyđ dismustase chứa Mn/ ty thể) có tác dụng loại *0 lại sinh iỉ202 ; *cr2 ‘Cf2 2H+ ^gg-4 H2O2 302 (15) Hydrnquínoĩi (HvdrỡquitìOl Quiiion Lưỡng gốc bền Semiquinon (dãn Chat) dạng khử) (dạng oxy hoá) (dản Chat) _ Quinol *Cu-Zn-SOD (supcroxyd dismuslase chúa Cu, Zn/ bào tương) loại ‘0 từ ty thể thoát bào tương(như phản ứng 15), Phản E, ứngVitamin (16) có số vận tốc lớn K = 10 L.mol '.s có xúc tác Ví dụ: Vitamin c, CoQ J0, Flavonoid có kiểu chuyển đổi (tốc độ phản ứng tăng lên hàng triệu lổn so với phân ứng (5)) khỏng QuiSOD non Qụinol tạo ‘Q7 đỏc hại * Catalase (Fe**) tác dụng [H202] > 10‘8 moLL'1: b) Cơchếịổc + gốc ị nhờ chết + xúc tác 2Hcơ > Henzym): 202 202 02 (16) í Qtetiìien pẽrexyởa§s (Sê) = GSHPX; tắ£ dỵng [HA] ^ lô8 môl:L ■; H202 2GSH > GSSG 2H20 (17) 20H* 2GSH -4- GSSG 2H20 (18) 1.2.2- Các chất phi enzym phân lử nhủ (bầy gốc tự do) * Các chất chống oxh nằm màng lố bào: Vitamin E (a - tocoíerol), p - caroten, vitamin A, coenzym Q 1(l 2.3.1-Phương pháp TRAP [11] [12] Đã có số nghiên cứu nhằm đánh giá hoại lính chống oxy hoá loàn phần (TAS =Total Antioxidant Status) dịch thể mà không vào đánh giá hoạt tính riêng cửa thành phán hệ thống bảo vệ chống oxy hoá phức tạp Phương pháp định lượng đầu íiôn nhóm trở thành phổ biến phương pháp TRAP (Total (peroxyĩ) radical trapping antioxidant parameter assay- Đo thông số chống oxy hoấ toàn phần bẳng bẫy gốc(peroxyl)) Dịch sinh học ủ với AAPH, chúng bị phàn huỷ dể tạo sấ£ gếe pẽfôẴyl; RN=NR —► N2 + 2R’ R + 0-1 RO, Các gốc RO, * phản ứng với chất chống oxy hoá ương dịch sinh học (ví dụ ascorbate, GSH): Chỉ chất chống oxy hoá bị cạn kiệt gốc R02‘ còng lipid (các lipid dịch sinh học lipid thêm vào đó) để gây trình peroxyd hoá Bằng cách xác định khoảng thời chậm trước bắt đầu trình peroxyd hoá (xác định thông qua đo thc tích o, giảm) so sánh với mẫu có thêm chất chống oxy hoá biết (thưòng sử dụng chất có hoạt tính tương tự vitamin E tan nước Troỉox C), đố giá trị TRAP thu số micro moi gốc peroxyl bị bẫy / lít dịch Một plìảh tử Tiõỉòx £ bầy gổc Rờ>: Giá trị TRAP huyết tương người klioảng lữ* rnicroM( lmM) RO,'bị bẫy/i lít: cấc chất dóng góp chủ yếu đối vối TRAP urat (35-36%), protcin (10-50%), ascorbat (lẽn tới 24%) vitamin E (5-10%) Các chất chống oxy hoá dã bỉết khồng xác định khâ chống oxy hoẩ toàn thể Lhông qua gỉá trị TRAP, ví dụ cd thành phần Ể không xác định được’ Cẩn thiết để đảm bảo Oa khòng bị cạn kiột hoàn toàn suốt 36 thử nghiệm TR AP gốc carbon trung tãm (R') sính từ AAPH có thc tụ phản ứng với mội số chất chống oxy hoá Phương pháp TRAP có số thay dổi Một sử dụng chất sinh R02* tan lipid (ví dụ AMVN) Sự thay đổi khác sử dụng phương pháp phát khác, ví dụ ỉuminol - tăng phái quang phản ứng hoá học.Trong hai phương pháp dịnh lượng dựa vào phycoerythrin ABTS, đểu cho thấy urat chất đóng góp chủ yếu vào hoạt tính chống oxy hoá toàn phần huyết lương Trong nước bọt người, urat chất chống oxy ìioá chính, nồng độ âlbumin thấp vầ ã§oorbat xấp xỉ 10 mieroM: Trái lại dịch não người (CSF) nông độ ascorbat gấp khoảng lán nổng dộ urate thấp huyết tương, ascorbat chất đóng góp đáng kổ cho TRAP Tổng giá trị TRAP dịch não tuỷ thấp huyết tương 23.2- Phương phấp ÁBTS [8] [11] [12] Dựa khả ức ehể chất chống oxy hoá đổi với tạo ABTS+‘ LừABTS ABTS viết tắt chất 2,2’-Àzinobis (3-ethylbenzothiazolin-6- sulphonat) bị oxy hoá thành gốc cation ABTS +’ gốc nitơ trung tâm, bền, có màu xanh da trời, có phổ hấp thụ bước sóng cực đại 660, 734, 820 nm Oxy hoá ABTS thành ABTS +*bằng metmyọglobin/H202, peroxidase cày cải ngựa/ H2Õ2, đơn gian thảm Mnồn Những chát chống oxh huyết tương gỏm: glutathion, vitamin E, vitamin c, manitol, acid uric tổn mầu nhiều hay tỷ lệ với độ ức chế chất màu tạo Khi hệ đo có chất chổng oxh, chất cho hydro lượng cation gốc ABTS" bị giảm xuống Những chất chống oxh huvêt tương gồm: ascorbat, thiừlprotein, bilirubin, urat a -tocoíbrửl Những chất có khả 37 phức hoá vứi Fe2\ Cu7+ íihư ccruloplasmin, tran síerin đóng gổp vào khả nũng chống oxh toàn phần Phương pháp nhanh, dỗ dàng tự dộng hoá, đo bước sóng cao, tránh nhiễu hấp thụ hấu hết phân tử sinh học Có thể ứng dụng cho LDL, ứng dụng đo TAS huyết tương 23.3- Phương pháp xác định hoạt dộ chống oxy hoá xác định số iod [1J Twcen 80 polysorbat thành phần chứa nhiều acid béo, chủ yếu aeid oleiE: ầeid dtiợe úm trưng ehỉ §ố ioổ (ehi §ố ĨGỔ ỉẳ số gâiĩi [QÙ tác dụng với 100 gam chất cần thử) chọn Tween 80 làm chất oxy hoá sau trình peroxỵd hoá mạnh, số nối dôi acid oleic bị cắt giảm, số iod bị giảm Dựa trôn sở này, người la dã dề xuất “phương pháp xác định hoạt độ chống oxy hoá chí số iod” với nguyên tắc sau: Tiến hành peroxy hoá Tvvccn 80 nhiôt độ thời gian định (thí nghiệm dược tiến hành lọ mâu nâu), acid oleic Tween 80 bị cắt giảm dây dôi, số iod acid oleic bị giảm Ta xác định số iod Tvveen 80 sau phản ứng peroxyd hoá khí cho không cho chất cần thử Từ đó, xác định hoạt đò chống oxy hoá chất cần thử BÀN LUẬN Từ phương pháp xác định gốc tự dạng hoạt dộng chúng dã trình bày dây, lỏi xin đưa mội sổ bàn luận sau: * Cộng hưởng spin clcctron (ESR) phương pháp duỳ đổ xác địnhgốc tự cách trực tiếp dủ nhạy dể phát gốc hoạt dộng Kết hợp ESR với bẫy spin cho phép xác định trực tiếp gốc tự hoạt động 38 Các phương phấp bẫy hữu ích in vilro nghiên cứu với dông vật nhúng tính hữu ích hạn chế trẽn nghiên cứu người • Các phương pháp định lượng gián tiếp : Các phương pháp dấu vân tay không trực tiếp đo gốc tự dạng hoạt động mà đo sản phẩm đặc trưng tổn thương oxy hoá gày bởì chúng cho thấy mức độ tổn thương nhiều chứng tỏ gốc tự dạng hoạt động cúa nhiều Các phương pháp xác định gián Liếp dựa trôn hoạt lính enz,ym SOD đo chất chống peroxyd GSH GSHPx, đo Se đấnh giá khẩ nâng chống gốc lự thể: hoại độ enzym SOD, GSHPs; hàm lượng GSH hàm lượng Se lớn chứng tỏ gốc tự dơ thể Các phương pháp xác định trực tiếp phương pháp gián tiếp dánh giá hoạt tĩnh riêng thành phẩn hệ thống bảo vệ chống gốc tự (chống oxy hoá) phức tạp Và để xác định hoạt tính chống oxy hoá toàn phần dịch sinh học thể phép đo hoạt tính chống oxy hoá toàn phần: TRAP, ABTS, lựa chọn tối ưu Trong phương pháp xác định gián tiếp, phép đo IsoP coi mội sô' dáng tin cùa trình peroxyd hoá lipid hay stress oxy hoá thể, phương pháp có giá ưị đế đánh giá tình trạng stress oxy hoá giúp đánh gìá vai trò tổn thượng oxy hoá bệnh tạt ò người: cholesterol máu cao, dái tháo đường, xơ vữa động mạch .Định lượng TsoPs lằ tiến hộ qiiãn ỉtộĩig vể kha nẵng đế lìm hiếu Vai tro cua strcss ổxỹ hoa sinh lý học bộnh học người KẾT LUẬN Sau thời gian thực khóa ỉuận tốt nghiệp, với hai mục tiêu dề ra, khoá luạn chúng tồi đạt nhũng kết sau: Đã viết tồng quan gốc tự do, dạng hoạt dộng chúng hệ chất chống gốc tự thể, tự nhiên 39 Đã sấp xếp tất câ phương pháp xác định gốc tự dạng hoạt động cúa chúng thành ba loại lớn: > Phương pháp xác định trực tiếp: Xác định trực tiếp gốc tự cộng hường spỉn electron (ESR), bẫy spin phương pháp bẫy khác Xác định trực tiếp số gốc tự dạng hoạt dộng: OH\ ■ 02\ N0‘, ONOO\ HOCI, H2Ơ2, '02 > Phương pháp dấu vân tay: XấE định gấẼ sản phẩm dật trang mang điểm thỉ tủa quế trình tổn tlirag oxy hoá thể > Phương pháp đo hoạt Lính chống oxy hoá toàn phân Đã hệ thống tìguvẽn tác cụ thổ phương pháp xác định để phái hiện: OHY02' * NO\ ONOO, HQC1, H202> ' 0>, peroxyd lipid, tổn thương ADN tổn thương protein enzym SOD, GSHPx, GSH, Selen, hoạt tính chống oxy hoá toàn phổn Tiếp tục nghiên cứu triển khai phương pháp xác định gốc tự dạng hoạt động đé’ đánh giá xốc vai trồ chúng chế bệnh lý, từ nâng cao hiệu cùa thuốc chống oxy hoá điều trị bệnh có liên quan 40 TÀI LIỆU THAM KIIẢO TẢI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ mỏn dược liệu, Giáo trình Bài giảng Dược Liệu 'Tập L Trường ĐH Dược Hà Nội, tập 1, tr 286-287 Mai Khánh Chi (2000), Góp phần hoàn thiện kỹ thuật đo hoạt tính chổng oxy hoá invivữ, Khoá luân LỐI nghiệp DS ĐH Lê thị Cẩm Hương (1998), Nghiên cứu phương pháp xác định hoạt độ chông oxy hoú thuốc dông dược, Khoá luận tốt nghiệp DS ĐH Nguyên Thị Thanh Nhài (2004), Nghiên cứu đinh lượng selen số chề phẩm thuốc nang mềm phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử, Lưận văn Thạc sỹ Dưực hục, Trường ĐH Dược Hà Nội, PGS.TSKH Lê Thành Phước, Hoàng Thi Tuyết Nhung, Phan Tiến Lực,Định lượng selen nấm men phương pháp cực phổ xung vi phàn, Tạp chí Dược học, số 336, tr 24-26 PGS.TSKH Lê Thành Phước (2007): Chuyên đề ‘Gốc tự chất chổng oxy hoá Y-Dược”, Trường Đại Học Dược Hà Nội Vũ Thị Phương Thảo (2002), Tổng quan selen dạng thuốc chứa seỉen, Luận văn Lốt nghiệp DSĐH, Trường ĐH Dược HN s T§.Nguyẻri Quang Thương (2003): Ngkiểh cứu ừng đụng mật sỗ phương pháp xác định gốc tự chất chống oxy htìầ thể, Trường Đại Học Dược Hà Nội Nguyễn Ngọc Tuấn (1996), Đánh gìú hàm lượtìg nguyên tố iod, Thu V ngán Asen số đổi tượng môi trường phương pháp kích hoạt nơtron, Luận án PTS khoa hoá học, ĐH KHTN, ĐH Quốc Gia Hù Nội 10 Nguyễn Tường Vi (2007) Nghiên cứu thành phấn hoá học tiêu chuẩn hoứ chất lượng dầu gấc Việt Nam, Tr 7-8 TÀI UỆU TIẾNG ANH 11 Academic Press New York (1982), Free Radìcaỉ in Biỡỉogy 12 Barry Halliwell (NalionaL Ưniversity of Singapore) ,Food-Derived Anĩioxỉdants : IIoMvtv Evaiuate tkeir importance in Food and In Vivo, Handbook of Antioxìdant, Chapter 01;“p.p.07-27 13 Collỉns, A., CadeỌ J., Epe, 13 and Gedik, c (1997) yProblems in the measurement ữf 8-oxoguamne in human DNA ,Carcinogenesis 18, 1833-1836 14 Collins, A., Dusinska, M., Pranklin, M., Somorovska, M., Petrovska, H., Duthic, s., Fỉllion, L-, Panayiotidis, M., Raslova, K and Vaughan, N (I997a) ,Comet ữssay in human biỡmonitoring studỉes: reliabỉUty, vulidaiìon, and applìcaíỉons Environmental and Molecnlar Mulagenesis 30, 139-146 15 Collins, A.R., Dusìnská, M., Gedik, C.M and Stctina, R (I996),0xidative damage to DNA: we have reliabỉe biomarker?.Environmenlal Health Perspeetives 104(snppl.3), 365-496 16 Collins, A.R.t Raslova, K-, Somorovska, VI., Petrovska H., Ondrusova, À., Vohnout, B.t Fabry, R and Dusinska, M (1998b) ,DNA datnage in diabetes; correlation wi[h a clinìcal marker , Free Radical Biology and Medidne 25, 373-377 17 Collins, A.R., SJ., Fiìlion, L., Fedik, C.M., Vaughan, N and Wood, S.G (1997b) yOxidative DNA damage in humart celts: the inýluence of antioxidants and DNA repair , Biochcmical Socictv Transactions 25, 326-331 18.Frank Tictze (1969) mymatic methữdfor qmntitaĩive determimtion af nanogram amounís of íolal and oxidixed ghưathiơn :Appỉicaiioris to mammaỉian blood and uther tixsues.Analy tical Biochemystxy.27 , p.p.502-522 19.Ha?cnton G.A.& Lang A.c (1980)}Gluĩathion contents of tissues in the aging /»ữMJ£.Biochem, Ị.,ỉ 88,No I, p.p.25-30.“ Frcc Radical in Biology”, Academic Press New York 1982 20.iournal of Inorganic Biochemislry 99 (2005) 2217-2225 www.el5e¥Ìeĩ.Gom/taỉe/iinorghio 21.Na7,lin k.howelland suhur saeeđ, Free Radical in Bitìiơgy Trường khoa học sinh học, Đại học Surrcy Guildtord, A nh A Phương pháp Ngu yến tắc Hydnoxyl ho acid terephlulic Không phát quatig, bị hydroxyl hoá OH' Phụ lục 2- Một số phương pháp phát nỉtric oxid quang PHỤ LỤC Phụ lục 1- Một sô phương pháp phát gốc hydroxyl 2, Làm màu p-nilrosodimcthylanilin (PNDA) Chuyển methiona] PNDA phản ứng nhanh với OH’ khôn hnăc ’02 Phản ứng kèm theo mít màu vàng Đo khí ethylen phương pháp sắc ký khí(C (CHJSCH CHO} vàsổ cácphương hợp chất Không cho OH ■, bị oxy hoá hời F PhụJCH lục 21Một pháp phát hiệnđặc cáctrưng gốc hydroxyl .1 liốn quan( mcthionin acid 2-kctomột số enzym peraxídase Phụ lục 2- Một số phương pháp phát hiộn nitric oxid _ ni 4-methytthiobutanoic) thành khí ethylene(H Phụ lục 3- Một số phương pháp phát H202 hệ sinh học .VỊ 2C=CH,) Phương pháp Tryptophan Phản óng cùa OH’ với tryptophan tạo Phụ lục 4- Một số phương pháp đo peroxyd lĩpid (LOOH) vm Chuyển caffein thính 8-oxocaffein Caffeìne bị oxy hoá ỏ vị trí 8, sản phẩm tạo thí Phụ lục 5"S-Vr - Định lượng F2- IsoProstan X "jụr HPLC với detector điện hoá ANXN Tương tựhuỳnh phân tíchtrong 8- OH-deoxyguanos Phụ lụcCH,6-CH,Sự hình thành sán phẩm phát quang trinh 8-oxocaffein từ caffein nội sinh dùng dể Caffein 8-0\ccaffdn pcroxyd hoá lipid XI trình rang pha cà phô ỉi,3.7-triniethvluric acid) Huỳnh quang coumaiũi Acid coumarin-3- carboxylic(CCA) bị hyđro phẩm phát huỳnh quang Các gốc OH' phản ứng với DMSO, tạo ra, khí methan phương pháp íormaldehyd đoIbằng phương pháp đo mì (CHj);SO + OH- -> CH3SC Phương pháp Dimelhylsulphoxiđ (DMSO) ■ CHj + 02-4 CH300- 2CHsOO* -» HCHO + CH ■CH3 + R-H CH, + RPhiíỡhg phắp khổng dặc hiịìĩ chõ ŨH', ví dụ ONOO Huỳnh quang berưoat Phàn ứng add benzoic với OH' tạo thàri chất có khắ phát huỳnh quang bước thích bước sóng 3ơ5nm Là phương pháp nhí 9, Bãy splny HPLC Sự kết hợp nguyên tắc bẫy spin hyt thơm, phương phấp HPLC sủ dựng để tác bảy spin, nhu DMSO Dùng detector đỈÊn hoá cho độ nhạy cat n Phương pháp Phương pháp tiếp Sự phát xạ ánh sáng Nguyên Lắc trực Phản ứng NO* với o, tạo ánh sáng, qua ưạng thái kích thích nitrogen dioxid NO + 03 -* N02* N02 4- h Độ nhạy cao( cỡ nM) Chỉ đo pha khí NO* Khả nâng bị cản trỏ cấc hệ phát ánh sáng khác Để phân tích, NO* phải chuyển từ nguyên liệu sinh học sang pha khí Ví dụ, kích thích N2, đói chuyển NO* sang pha khí không định lượng Các điện cực NO* Trong phần tử nhậy porphyrin, NO’ liên kết với Ni2+- porphyrin bám trôn điện cực anot bị oxy hoá điộn hoá học Phụ lục 3-mMột số phương pháp phát H202 hệ sinh học Ni (p) + NO’ -* Ni(P)NO ^ Ni(P)NO+ + eDòng electron tỷ lệ với nồng dộ NO* NO* phản ứng với oxyhaemoglobin, cuối biến đổi thành methamoglobin, đo AA Độ nhạy cõr nM Thực dơn giản Bẫy Haemoglobin Các bẫy có hiộu lực bao gồm: Bẫy spin ESR - Haemoglobin{ ESR biến đổi, đo AA) - Các protein hem khác( trạng thái Fc2*) - Fe2*- dithiocarbamat - Fe2+- thiosulphat NO' phối tử tốt đối vớỉ ion Fe2+ phức hợp nitrosyl dược tạo có phổ ESR đặc trưng( ví dụ HbNO, NoFc[DTC]2, PclSnO^LNOh) - Rihonuclcotid rcductasc (cnzỵm chuyển gốc tyrosyl vị trí hoạt động bửi NO' làm Bãy spin ESR tín hiệu ESR) Phụ thuộc vào hiêu lực enzym, không sủ dụng rộng rãi - Bảy Nitroxylnitroxid phản ứng với NO* tạo imino nitioxid cổ thể phát ESR cố phổ ESR dặc trưng Hoặc dùng 7,7,8,8-tetra- methyl-o-quinodừnethan Các phương pháp gián sử dụng dể phát NO' Chúng gắn vối NO' để tạo gốc nitroxid, phát Phản ứng Gricss: N02' phản ứng với sulphanilamid dung dịch acid (1Vmột sản phẩm màu azo (AA= 548nm) naphthyl) ethylenediamin để tạomraIV tiếp Đo N02- Phản ứng NOj với 2,3- dỉaminonaphtalen tạo thành chất huỳnh quang 1HnaphthotriazoI Độ nhạy: microM, dễ thực N02 Đo sản phẩm oxy hoá khác Dựa sụ hình thành nhiều dạng hoạt động trình chuyển NO* thành N02‘ với có mặt 02 Do NO* oxy hoá terrocyanide thành íerricyanid (AA=420nm) oxy hoá ABTS không màu thành ÀBTS + có màu(AA=660nm) Nitro hoá sulphanilamid tạo Đo sản phẩm oxy phẩm màu azo Các phương pháp ghi phổ đơn giản song đẽ bị nhiễu RNS khác, ví dụ, ONOO' hoá khác N02 hít vào Có thể chất ức chế nói chung tất dạng đồng phân NOS chọn lọc Sử dụng chất chếNOS Phương phấp ức dạng rièng biột Các chất ức chế nói chung NOS mà chất nển ỉà L- argininc như: N- munomethy - L-arg mi ne (L-N MMA) N-nitro-L-argimne mcthyl e stc r{ L-N AIVÍE) Các chất ức chế chọn lọc gồm N-iminoethyl-L-omithine(eNOS), Nguyên tắc/ hệ ứng dụng aminoguanidme(iNOS) 7-nitro-indazole(ĩiNQS) Enzym oxy hoá cytochrom c dạng khử dặc hiệu với H202 Hình thành phức hợp VỚI l.Cytochrom c peroxidase PL02 hấp thụ ỡ 419 iưn, klii enzym tự hấp thụ 407 nm Áp dụng cho ty thể động vật thực vật, động vật nguyên sinh, peroxisome Phương pháp khó áp dụng cho hệ sinh học có mặt cytochrom c reductase/ oxỉdase khác 2.Horseradish Scopolctin chất phổ biến: chất khác gồm có acid homovanillic( acid 3- peroxidase + methoxy-4-hydroxyphenylacetic) đò Amplex (N- acctyl-3,7- di hy drophcnox azi n), chúng bị scopoletin( oxy hoá thành sản phẩm có huỳnh quang Áp dụng cho ty thể dộng vật thục vật, các chất khác) hạt ty thể, thực bào, nguyên sinh bào 3,Phương pháp diện Thêm lượng dư lớn catalase đo lượng oxy giải phóng: cực 02 lìiỊh(LOOH) => 2HjO 02 Phụ lục 4- Một số phương pháp đo peroxide lipid Dùng để nghiên cứu số tốc độ phản ứng H202, cách đo lượng H202 dư 4.Sự ức chếbdi caudase Sự ức chế Độ nhạy không cao nhung hiệu với hệ có nồng độ cao Áp dụng cho lạp lục, ty lạp thể Nếu phản ứng cíìn phải có H20,, bị ức chế catalase.Catalase phân giải châm Hi02 nồng độ thấp H202 phải thêm HoOo với lượng lớn, Thường sử dụng để nghiên cứu vai trò H2Oz huỷ hoại oxy hoá Catalase hoạt động pH thấp cao catalase Giải phóng GSSG Áp dụng cho quan dã phân lập Đo trình oxy hoá GSH 6.Sự ức chế aminotriazol Nấm, vi khuẩn khác nhau, mycoplasma, hồng cầu, mô khác động vật catalase 7.Decarboxyl hoá aciđ keto Glyoxylat, pyruvat, alpha- ketoglutarat phàn ứng với H2Ơ2 xúc tác enzym sử đụng chất có gắn 14 c cho phép phép đo ,4C02 giải phổng có độ nhạy cao Thuỷ tinh thể mắt, dịch thể, peroxisotne Phương pháp Mô xừ lý với Fe2'’' - diethy lenetriamin penta-acetic acid Mô xử lý bi oxy hoá nhuộm màu mồ hóa H202 tao phức sắt chelat, phức oxy hoá diaminobenzidine thành chất mang màu không học tan Áp dụng cho quan, tế bào, mổ mỏng Có thổ phát hiộn tác nhân oxy hoá khác nhựng dọ H?Ọ2 thị catalasẹ sệ ức chế 9-Oxy hoá dimethyỉthioure DMTƯ bị oxy hoá gốc OH*, HOC1, ONOO' H2OJ, với H207 tạo sản phẩm VI vm dioxid, Áp dụng cho enzym, bạch cẩu trung tính, phổi Không sử dụng rộng rãỉ (DMTU) thành sản phẩm dioxld Phương pháp A- Các phép đo pcroxyd toàn phần đơn giản l.Giải phóng ĩod Nguy ôn tắc Các peroxyd lipid oxy hoá r thành ĩ, ROOH + 21 + 2H+ -+ l2 + ROH + H20 Khi thừa I‘, I2 s c tổn dạng ion I3' đo bước sóng 358 nm Hiệu với lipid phan tử lổn H202 pcroxyd protein oxy hoá r thành I2 Phương pháp ứng dụng cho dịch chiết mảư sinh học mặt tác nhân oxy hoá Hàm lượng huyết tương người 2,1 - 4,6 uM 2.Phương pháp FOX (íerrous oxidation Đo thay đổi độ hấp thụ Các peroxyd oxy hoá Fe ,+ thành Fe(IIĨ)t phát xylenol da cam (đo AA 560nm) Hàm lượng ưong huyết tương người bình thường Lả 3-4 xylenol orange) pM, lớn nhiều so vdri phương pháp dựa HPLC, có lẽ ‘khuếch đại’ Phương pháp oxythồ hoấnghiệm lảy Qấe phần QÙâ LQQH vếi Fe2+ ẵẽ tậ6 rs gếe Lô' gây lân ỉruyền qyố sắt với thuốc thử trình peroxyd hoá Thường thèm chất chổng oxy hoá dể làm dừng trinh ưên Độ xylcnol da cam nhạy thấp khoảng pM 3.G]ưtathion Đo peroxyd acid bco (GSHPx không tác dụng aeid béo dã peroxyd hoá pcroxydasc(GSHPx) màng tế bào lipid LDL) GSHPx phàn ứng với H202 peroxyd hữu cơ, oxy hoá GSH thành GSSG- Việc thêm glưtathion reduetase NADPH để khù GSSG trở lại thành GSH dẫn đến tiêu thụ Glutathion NADPH Hoặc, cố thổ định lượng trực tiếp GSSH, ví dụ HPLC, Không thể đo peroxydase (GSHPx) peroxyđ màng tế bào trừ sử đụng phospholipasc trước Hàm lượng peroxide huyết tương khoảng |iM B Đo peroxyd sau phan Tách sản Đo peroxyđ lipid sau tách bàng HPLC phẩm Hem protein phân huỷ peroxyd lipid tạo thành gốc tác dụng với isoluminol tạo ánh sáng Hàm lượng peroxyd huyết tương người dược đo HPLC l.Đo peroxyd saukhoảng 40 nM Định tính peroxyd sau tách HPLC khống đơn giản dựa trôn tách HPLC thòi gian lưu giữ Detector mảng diod, kv thuật ghi phổ hấp thụ pic, phương pháp hiệu Một phương pháp khác phát peroxyd sau dùng HPLC cho chúng phản ứng với dãn chất diphenylphosphĩn, bị oxy hoá thành oxid phosphin có huỳnh quang 2.GC-MS Đo peroxyd lípid Các peroxyd chiết, thưcmg bị khử (ví dụ borohyđrid) thành alcohol, tách GC, xác định phổ khối Cần kiổm soát để alcohol mặt hệ trước trinh khử ví dụ: alcohol sinh hoạt tính glutathion peroxidase Phụ lục - Định lượng F2- IsoProstan Cường độ (%) Thời gian lưu giữ (phút) IX Phân tích Fr IsoPs huyết tương người binh thưrmg: 569m/z sắc phá dòng ion thể F2- IsoPs nội sình, sắc phổ 573 rn/z thể chất chuẩn nội [2H4]S-ìso-PGF2ll Đỉnh (*) cho biết nồng độ Fọ-lsoPs, Nổng độ Fr IsoPs huyết tuơng 47pg/mL X l.Sự nhóm Dùng thuốc thử Ellmans, acid 5,5’-[...]... 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH Gổc Tự DO VÀ CÁC DẠNG HOẠT ĐỘNG CỦA CHƯNG 2.1 -Phương pháp xác định trực tiếp Phương pháp xác định trục tiếp được phận thành ha loại như sau: 2.1. 1Phương pháp cộng hưởng spin dectrnn (ESR) và bấy spỉn [11] [12] Quang phố cộng hưởng spin clcctron (ESR) là kỳ thuật duy nhất xác định trực tiếp các gốc tự do, còn gọi là cộng hưởng thuận từ electron (EPR) ESR đặc hiệu với các gốc. .. Số đường trong phổ ESR cùa một gốc dược gọi là cấu trúc siêu Tinh vi và cấu trúc này thường rất phức tạp khi các gốc có chứa nhiều hạl nhân Có thể xác định một gốc từ phổ ESR của nó bầng cách nhìn vào giá trị g, cấu trúc siêu tinh vi và hình dạng phổ, * Bẩy spỉn Phương pháp ESR không dũ nhạy để xác định trực tiếp các gốc rất hoạt đông như 'O 2, OH\ alk_oxyl(RO’j, R02* trong các cơ thể sống trừ khi... NG,C1 vào các protcin dẫn đến oxy hoá các nhóm thiol và các gđe methionin và clo hoá nhóm -NH-,, vòng thơm tyrosin ROS oxy hoá các nhóm SH, hydroxyl hoá lyrosĩn và phenylalanin, chuyển methionin thành dạng sultoxid và tạo ra các peroxyd prõtèỉn Một phương pháp phổ bicn đánh giá sự tổn thương protcin do oxy hoá là phương ptiáp carbonyl được sử đụng rộng rãi Dựa trên sự tấn công của inột số ROS vào các gốc. .. độ quang £: Hệ số hấp thụ moi 2.2J.6- Do các isoprostan (isoPs) Các mố dộng vật và các dịch cơ thể (gồm cả nước tiểu) chứa một lượng nhỏ các F2- Tsopiostan Các F2- isoprostan là các đồng phân của prostanglandinsản phẩm kết thúc đậc hiện của quá trinh peroxyd hoá các phospholipid có chứa acid arachidonic Các isoprostan trong huyết tương phần lớn bị ester hóa thành các phospholipid hưn là ử dạng tự do. .. này, Dựa vào phần trăm ức chế suv ra hoạt độ enzym SOD 2.2.5- Đo các chất chống peroxyd GSH và GSHPx [8] 118] 1191 32 Trong hệ thõng chống peroxyđ có hai chất chống oxy hoá quan trọng lã GSII và GSIIPx Có nhiều phương pháp xác định hai hợp chất trên như chuẩn độ ampc kế, cực phổ nhưng đặc hiệu và nhạy nhất Ja những phương pháp được giới thiệu dưới dây 2.2.5.1 -Xác định GSHPx theo phưorng pháp đo quang... hiộn tất cả các dạng đổng phrin hydroxyl và do đó là phương pháp bán định lượng Lý tưởng là nôn tách các sản phẩm khác nhau bằng phương pháp sác ký khí(GC) hoặc phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao( HPLC) và được đo bằng detector điện hoá, quang phổ hu^nh quang, phổ khối hoặc những phản ứng tạo màu đơn giản Ví dụ, tách bằng HPLC kết hợp với delector điện hoá nhạy đã đưực sử dụng dể đo các sản phẩm... 2.22.2- Phương pháp diện di gel dơn tế bàoị phương pháp comet, phương phấp "sao chổi'1) [11] [12] Đánh giá sự tổn thương base do oxy hoá Sau khi phân giải các tế bào, cho tiếp xuc vớỉ các enzym phục hốỉ ẢÌÌN (ví dụ endonucỉease ỉii cho các pyrimidin dã bị oxy hoá và PAPy glycosylase cho 8-OHdG và các sản phẩm từ gưanin khác) ADN bị phá vỡ tại các vị trí base biến đổi, tạo ra nhiều đoạn hơn Do đó so sánh các. .. trên ADN 2.2.3- Đo các tổn thirơng của proteỉn [11] Sự tấn công của các dạng hoạt động trên các proíein làm biến đổi các amino acid trên phân tử protein tạo ra nhiều các sản phám khác nhau Như RNS tân công tyrosin ( cả ỏ dạng tự do và trong các protein) tạo ra 3nitrotyrosin Sản phẩm này có thể đo hằng phương pháp miễn dịch học, hoặc bằng các kỹ thuật HPLC hoặc GC-MS sau khi thuỷ phân các protein để giải... [11] [12] ROS và RNS phản ứng theo những cách riềng với ADN, protein, lipid và mộl số chất chống oxy hoá khối lượng phần tử thấp( ví dụ ascorbic, urat) Do dó các sản phẩm tạo thành được coi như những ‘dâu vân tay’ của sự tân cổng oxy hoá Các phương pháp này không do các dạng hoạt động ROS/RNS mà 22 đo các sản phẩm của sự tổn thương oxy hoá gây bởi ROSỊ/RNS và các sản phẩm này phải là các chất đánh... phụ lục 7 sếe Ngoài eấe phương pháp [láu vân lay để Ẵấe Gịnh gián tiếp gốe tự đỡ vằ dạng hoạt động của chúng còn cổ các phương pháp xác định gián tỉếp khác: 2.2.4Đo hoạt tính enzym supeoxyd dismutase (SOD) [8] SOD là một enzym xúc tác cho phản ứng loại bỏ gốc tự do superoxyđ: •o~2 4- ’0r2 +2H+ ss > H 2O 2 + 3 O2 Hằng số tốc độ của phản ứng này rất lớn (k= 10° M/s), nôn nổng độ gốc *02 ở trortg tế bào ... tiêu: Viết tổng quan hình thành gốc tự dạng hoại động chúng thổ, tự nhỉcn Hộ thống nguyên tắc phương pháp xác định gốc tự dạng hoạt dộng chúng PHẦN I : ĐẠI CƯƠNG VỂ Gốc Tự DO VÀ CÁC DẠNG HOẠT ĐỘNG... 12 11 PHẦN 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH Gổc Tự DO VÀ CÁC DẠNG HOẠT ĐỘNG CỦA CHƯNG 2.1 -Phương pháp xác định trực tiếp Phương pháp xác định trục tiếp phận thành loại sau: 2.1. 1Phương pháp cộng hưởng... luạn chúng tồi đạt nhũng kết sau: Đã viết tồng quan gốc tự do, dạng hoạt dộng chúng hệ chất chống gốc tự thể, tự nhiên 39 Đã sấp xếp tất câ phương pháp xác định gốc tự dạng hoạt động cúa chúng