Nghiên cứu sử dụng thực khuẩn thể trong phòng trị bệnh thối hạt trên lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae.

Nghiên cứu sử dụng thực khuẩn thể trong phòng trị bệnh thối hạt trên lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae.Nghiên cứu sử dụng thực khuẩn thể trong phòng trị bệnh thối hạt trên lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae.Nghiên cứu sử dụng thực khuẩn thể trong phòng trị bệnh thối hạt trên lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae.Nghiên cứu sử dụng thực khuẩn thể trong phòng trị bệnh thối hạt trên lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae.Nghiên cứu sử dụng thực khuẩn thể trong phòng trị bệnh thối hạt trên lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae.Nghiên cứu sử dụng thực khuẩn thể trong phòng trị bệnh thối hạt trên lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae.Nghiên cứu sử dụng thực khuẩn thể trong phòng trị bệnh thối hạt trên lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae.Nghiên cứu sử dụng thực khuẩn thể trong phòng trị bệnh thối hạt trên lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae.Nghiên cứu sử dụng thực khuẩn thể trong phòng trị bệnh thối hạt trên lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae.Nghiên cứu sử dụng thực khuẩn thể trong phòng trị bệnh thối hạt trên lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae.Nghiên cứu sử dụng thực khuẩn thể trong phòng trị bệnh thối hạt trên lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae.Nghiên cứu sử dụng thực khuẩn thể trong phòng trị bệnh thối hạt trên lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae.Nghiên cứu sử dụng thực khuẩn thể trong phòng trị bệnh thối hạt trên lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae.Nghiên cứu sử dụng thực khuẩn thể trong phòng trị bệnh thối hạt trên lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae.

GIỚI THIỆU

Tính cấp thiết của luận án

Bệnh thối hạt hay bệnh lép vàng trên lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae (Ou,

Bệnh thối hạt, được ghi nhận lần đầu tại Nhật Bản vào năm 1950, đã trở thành một tác nhân gây thiệt hại nghiêm trọng về năng suất và phẩm chất lúa gạo trên toàn cầu, đặc biệt là ở Việt Nam Tại Việt Nam, bệnh này lần đầu tiên được phát hiện ở Đồng bằng sông Hồng.

Bệnh thối hạt do vi khuẩn B glumae đã gây thiệt hại năng suất lúa khoảng 75% vào năm 1992 và ảnh hưởng nghiêm trọng đến nhiều giai đoạn phát triển của cây lúa, đặc biệt là giai đoạn mạ và giai đoạn ngậm sữa, dẫn đến mất mùa (Trung et al., 1993; Tsushima et al., 1986; Li et al., 2017) Trong bối cảnh biến đổi khí hậu toàn cầu, bệnh thối hạt dự kiến sẽ trở thành mối đe dọa lớn đối với an ninh lương thực khi nhiệt độ trái đất tăng lên, vì B glumae phát triển tốt nhất trong khoảng 30–35°C (Zhou-qi et al., 2016; Mizobuchi et al., 2020) Một nghiên cứu tại Hoa Kỳ cho thấy, nếu nhiệt độ tăng 1°C, bệnh thối hạt có thể gây thiệt hại nghiêm trọng cho các vùng sản xuất lúa, ảnh hưởng đến 2,7 triệu người không có đủ gạo ăn (Shew et al., 2019) Do đó, nghiên cứu về bệnh thối hạt và các biện pháp quản lý là rất cần thiết để tìm ra giải pháp giảm thiểu tác động đến an ninh lương thực toàn cầu trong bối cảnh nhiệt độ ngày càng gia tăng.

Tại Việt Nam, việc quản lý bệnh do vi khuẩn trên lúa chủ yếu dựa vào biện pháp hóa học như oxolinic axit và thuốc gốc đồng, tuy nhiên, biện pháp này đang gây ra vấn đề kháng thuốc, như trường hợp vi khuẩn B glumae đã kháng oxolinic axit tại nhiều vùng ở Nhật Bản Hơn nữa, việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật không chỉ ảnh hưởng trực tiếp đến môi trường mà còn làm giảm đa dạng sinh học, ảnh hưởng đến chất lượng nông sản và sức khỏe con người.

Nghiên cứu các chế phẩm sinh học nhằm giảm thiểu sử dụng thuốc hóa học đang trở thành xu hướng quan trọng để nâng cao chất lượng sản phẩm nông nghiệp và bảo vệ môi trường Thực khuẩn thể, hay còn gọi là bacteriophages, là virus chuyên ký sinh vào tế bào vi khuẩn và đã được ứng dụng trong phòng trừ bệnh hại vi khuẩn trên cây trồng Chúng có nhiều ưu điểm như hiện diện phong phú trong tự nhiên với mật độ cao, khả năng sinh sản nhanh chóng trong vòng 15 phút đến 1 giờ, không gây độc hại cho tế bào nhân thực, và đặc biệt, là giải pháp tiềm năng trong bối cảnh gia tăng tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn.

Ngày nay, liệu pháp thực khuẩn thể đã đạt nhiều thành công trong việc quản lý các bệnh do vi khuẩn gây ra trên cây trồng, như bệnh loét trên cam do Xanthomonas axonopodis pv citri (Balogh et al., 2008), bệnh héo xanh trên cà chua do Ralstonia solanacearum (Fujiwara et al., 2011), và bệnh cháy lá trên hành do X axonopodis pv allii (Lang et al., 2007; Nga et al., 2021) Ngoài ra, Erwinia carotovora subsp carotovora gây thối nhũn cây hoa loa kèn (Ravensdale et al., 2007) và X oryzae pv oryzae gây bệnh cháy bìa lá trên lúa (Ou, 1985; Dong et al., 2018) cũng đã được kiểm soát hiệu quả Đặc biệt, sản phẩm từ thực khuẩn thể đầu tiên, AgriPhage, đã được Cục Bảo vệ Môi sinh Hoa Kỳ (EPA) phê duyệt thương mại hóa vào năm 2005 để quản lý bệnh đốm lá cà chua do vi khuẩn.

Pseudomonas syringae pv tomato và đốm lá ớt do vi khuẩn X campestris pv vesicatoria đã được đưa vào sản xuất và ứng dụng từ năm 2012 Thực khuẩn thể được coi là một tác nhân tiềm năng trong việc phòng trừ các bệnh hại do vi khuẩn, với nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực y học, thực phẩm và nông nghiệp.

Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào về hiệu quả của thực khuẩn thể trong quản lý bệnh thối hạt lúa ở điều kiện ngoài đồng, đặc biệt là về mặt hình thái và di truyền của các dòng thực khuẩn thể Nghiên cứu "Sử dụng thực khuẩn thể trong phòng trị bệnh thối hạt trên lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae" được thực hiện nhằm giảm thiểu lượng thuốc bảo vệ thực vật trong quản lý bệnh thối hạt lúa Đồng thời, nghiên cứu cũng đi sâu vào di truyền của các dòng thực khuẩn thể, góp phần xây dựng chiến lược quản lý bệnh an toàn tại Việt Nam.

Mục đích nghiên cứu

Mục đích của luận án là xác định hiệu quả và tính an toàn của thực khuẩn thể trong quản lý bệnh thối hạt lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae gây hại Nghiên cứu nhằm tìm ra điều kiện nuôi cấy thực khuẩn thể tối ưu để ứng dụng trong quản lý bệnh thối hạt lúa, góp phần giảm sử dụng thuốc hóa học trong quản lý bệnh hại ở Đồng bằng sông Cửu Long và trên toàn quốc.

Nội dung nghiên cứu

Đề tài thực hiện gồm những nội dung năm nội dung chính:

- Nội dung 1: Phân lập, tuyển chọn thực khuẩn thể và vi khuẩn gây bệnh thối hạt lúa.

- Nội dung 2: Đánh giá khả năng phòng trị bệnh thối hạt của các dòng thực khuẩn thể triển vọng trong điều kiện nhà lưới.

- Nội dung 3: Xác định tính an toàn của các dòng thực khuẩn thể triển vọng trong thực tiễn sản xuất.

- Nội dung 4: Đánh giá hiệu quả của các dòng thực khuẩn thể triển vọng phòng trị bệnh thối hạt lúa ở điều kiện ngoài đồng.

- Nội dung 5: Khảo sát điều kiện nhân nuôi thực khuẩn thể triển vọng.

Tính mới của luận án

- Xác định vi khuẩn gây bệnh thối hạt chủ yếu trên lúa ở ĐBSCL là do loài

Ba dòng thực khuẩn thể có tiềm năng cao trong việc phòng trị bệnh thối hạt đã được xác định, cho thấy hiệu quả giảm bệnh trên 50%, tương đương với thuốc hóa học Những dòng thực khuẩn thể này thuộc nhóm thực khuẩn thể độc (virulent phages), đảm bảo tính an toàn trong quản lý bệnh thối hạt do vi khuẩn B glumae.

Để đạt được mật số cao tương đương 10^10 pfu/ml, cần xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu cho dòng thực khuẩn thể triển vọng, nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng trên diện rộng.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

1.5.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của luận án là cây lúa, bệnh thối hạt lúa do vi khuẩn

Burkholderia glumae và thực khuẩn thể kí sinh vi khuẩn B glumae.

Luận án nghiên cứu thu thập mẫu bệnh và thực khuẩn thể từ các tỉnh ĐBSCL, sau đó phân lập và tuyển chọn TKT trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới Việc định danh các dòng TKT được thực hiện dựa trên đặc điểm hình thái qua kính hiển vi điện tử tại Viện Công Nghệ Kyoto, Nhật Bản, và trình tự bộ genome tại Đại học Leuven, Bỉ, nhằm xác định tính an toàn trước khi sử dụng rộng rãi Nghiên cứu cũng đánh giá hiệu quả phòng trị của thực khuẩn thể đối với bệnh thối hạt trong điều kiện ngoài đồng tại huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long, và khảo sát điều kiện nhân nuôi thực khuẩn thể trong phòng thí nghiệm.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Luận án nghiên cứu về bệnh thối hạt lúa và biện pháp phòng trừ bằng thực khuẩn thể, xác định vi khuẩn Burkholderia glumae là tác nhân chính gây bệnh Nghiên cứu đã tuyển chọn các dòng thực khuẩn thể tiềm năng và chứng minh hiệu quả của TKT trong việc phòng ngừa bệnh thối hạt trong điều kiện thực địa Thêm vào đó, việc đánh giá tính an toàn của tác nhân sinh học TKT từ góc độ sinh học phân tử cũng là một đóng góp khoa học quan trọng.

Nghiên cứu này sẽ hỗ trợ phát triển chiến lược quản lý bệnh do vi khuẩn một cách thân thiện với môi trường, đặc biệt là bệnh thối hạt lúa tại Việt Nam Kết quả cũng chỉ ra tính khả thi của việc ứng dụng thực khuẩn thể dựa trên hiệu quả giảm bệnh và phương pháp nhân nuôi.

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

- Thời gian: từ tháng 5 năm 2015 đến tháng 5 năm 2019

Bài viết đề cập đến địa điểm nghiên cứu tại Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Nghiệp, Trường Đại Học Cần Thơ, kết hợp với Viện Công Nghệ Kyoto, Nhật Bản, tại vùng trồng lúa huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long.

PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

3.2.1 Dụng cụ thiết bị và vật liệu

Kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử (HD-2700, Hitachi High-Technologies Corp, Nhật Bản, ở 200 kV) là những thiết bị quan trọng trong nghiên cứu khoa học Ngoài ra, các dụng cụ như lame, lamelle, máy đo pH, cân điện tử, tủ thanh trùng ướt, tủ thanh trùng khô, đèn cồn, đĩa Petri, bình tam giác, waterbath và ống falcon cũng đóng vai trò thiết yếu trong các thí nghiệm và phân tích.

(15 ml, 50 ml), micropipette (0,5 àl – 1000 àl), tủ lạnh, tủ ỳm, tủ õm -80 0 C, tủ õm -

- Giống lúa: giống OM4900 xác nhận (thực hiện thí nghiệm từ nhà lưới đến ngoài đồng).

- Nguồn thực khuẩn thể và vi khuẩn gây bệnh thối hạt được phân lập tại tỉnh An

Burkholderia glumae MAFF 106551, a bacterium studied at the Research Center of Genetic Resources in Japan, is found in regions such as Giang, Bạc Liêu, Kiên Giang, Sóc Trăng, Trà Vinh, Vĩnh Long, Đồng Tháp, Hậu Giang, and the city of Cần Thơ.

- Hóa chất: các hóa chất cần thiết cho môi trường King’s B, SM Buffer, PDA, PDAP, Nutrient.

- Các loại môi trường và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu sinh học

Các loại môi trường sử dụng trong nghiên cứu

1 Công thức môi trường King’s B (King et al., 1954)

2 Môi trường King’s B 0,8% agar được dùng nuôi thực khuẩn thể

400 mM Tris HCl (pH = 7,5) 125 ml

4 Môi trường Potato D-glucose agar (PDA) (Atlas, 2010)

5 Môi trường Potato D-glucose agar peptone (PDAP) (Louis & Cooke,

Các hóa chất dùng trong ly trích ADN từ thực khuẩn thể

Phenol (Merk), chloroform (Việt Nam), isoamyl alcohol (Merk), sodium acetate (Merk), ethanol 95%, ethanol 70%, nước cất 2 lần, Tris HCl (pH 8,0), TE buffer 1X

(10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA).

 Các hóa chất dùng cho phản ứng PCR

Milli Q (nước cất 2 lần), Mastermix (Phusa), cặp mồi đặc hiệu cho vi khuẩn B. glumae: đoạn mồi (1416S: (5’-GAGAGAATCGACCATGAAC-3’; 1414A: (3’-

GAGCGCATCCAGAACGAAGT-5’) (Schaad et al., 2001, Phụ bảng).

Các hóa chất dùng trong điện di

Ethium Bromide (Merk), loading buffer 10 X, ladder 1 kb (Thermo scientific),ladder 100 bp (Thermo scientific), agarose (Merk), 1X TAE buffer (400mM Tris acetate, 1 mM EDTA, pH 8).

NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1 Nội dung 1: Phân lập, tuyển chọn thực khuẩn thể và vi khuẩn gây bệnh thối hạt lúa Mục tiêu: chọn ra nguồn TKT và vi khuẩn gây bệnh thối hạt làm nguồn nguyên liệu từ đó tuyển chọn ra một số dòng thực khuẩn thể tiềm năng trong phòng trị bệnh thối hạt lúa.

3.3.1.1 Phân lập thực khuẩn thể và vi khuẩn gây bệnh thối hạt ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long

Mục tiêu : chọn ra nguồn TKT và vi khuẩn gây bệnh thối hạt làm nguồn vật liệu cho các thí nghiệm sau.

Phương pháp phân lập vi khuẩn gây bệnh (Goszczynska et al., 2000)

Phương pháp thu mẫu bệnh thối hạt bao gồm việc thu thập mẫu từ các ruộng lúa có diện tích từ 1.000 m² trở lên, với mỗi ruộng được coi là một địa điểm Trong giai đoạn lúa trổ đến trước khi thu hoạch, cần thu 5 điểm mẫu trên mỗi ruộng Triệu chứng điển hình của bệnh này là những hạt lúa bị thối nhưng vẫn giữ độ ẩm, khi tách vỏ trấu sẽ thấy hạt gạo có vết nâu ngậm nước (water-soaked) ở phần phôi.

Phương pháp phân lập vi khuẩn gây bệnh bắt đầu bằng việc thu thập các mẫu hạt, cần đặt trong túi ni-lông riêng biệt và ghi nhãn rõ ràng Việc phân lập mẫu nên được thực hiện trong ngày hoặc tối đa một ngày sau khi thu thập Tại phòng thí nghiệm, các mẫu bệnh sẽ được quan sát dưới kính hiển vi để xác định hiện tượng tuôn dịch vi khuẩn từ hạt lúa bị bệnh.

 Các bước phân lập vi khuẩn

Bước 1: Tách vỏ hạt lúa và khử trùng bề mặt hạt bằng cồn 70%.

Bước 2: Lam tiến hành khử trùng và cắt phần phôi giữa mô khỏe và mô bệnh, sau đó cắt nhỏ mẫu bệnh và thêm 1-2 giọt nước cất vô trùng Để yên khoảng 1 phút để vi khuẩn trong mẫu bệnh khuếch tán vào nước.

Bước 3: Rỳt 20 àl huyền phự vi khuẩn cho vào đĩa Petri chứa mụi trường King’s B 2% agar.

Bước 4: Vạch giọt huyền phù vi khuẩn trên môi trường dinh dưỡng King’s B 2% agar. Bước 5: Sau 24 giờ tiến hành tách ròng và trữ nguồn vi khuẩn.

Cách đặt tên các chủng vi khuẩn bao gồm việc sử dụng ký tự chữ để viết tắt tên vi khuẩn và tỉnh nơi thu mẫu bệnh Ký hiệu số thể hiện chỉ số dòng vi khuẩn được thu thập tại một tỉnh, với giá trị từ 1 đến 100.

Ví dụ về mã BurCT1, trong đó "Bur" là viết tắt của vi khuẩn Burkholderia glumae, "CT" chỉ vi khuẩn được phân lập tại tỉnh Cần Thơ, và số "1" thể hiện dòng vi khuẩn được thu thập từ một địa điểm cụ thể trong nhiều ruộng đã được lấy mẫu tại tỉnh Cần Thơ.

Phương pháp phân lập thực khuẩn thể (Nga & Giang, 2016 có hiệu chỉnh)

Để kiểm tra sự hiện diện của TKT trong hạt lúa bị bệnh, đầu tiên, tách bỏ vỏ trấu và lấy phần phôi nhũ thối, sau đó nghiền nát trong cối sứ Tiếp theo, thêm 5 ml nước cất vô trùng vào cối và tiếp tục nghiền cho đến khi hạt gạo mịn Ly tâm dung dịch ở tốc độ 6.000 vòng/phút trong 5 phút, rồi rút phần dung dịch phía trên chuyển vào ống tuýp mới Cuối cùng, bổ sung 5% choloroform (v/v) và ly tâm tiếp tục để thu được dung dịch trong, sẵn sàng cho việc kiểm tra.

Bước 2: Rút 100 µl huyền phù vi khuẩn (OD600nm: 0,3) đã được phân lập trước đó vào cùng một mẫu bệnh, sau đó thêm 10 ml môi trường King’s B 0,8% agar đã được nấu tan và làm nguội ở 50°C, khuấy đều dung dịch Tiếp theo, rút 5 µl dung dịch TKT (thu được từ bước 1) vào đĩa Petri đã chứa vi khuẩn ký chủ Cuối cùng, ủ đĩa trong điều kiện phòng và quan sát sự hình thành các đốm tan (plaque); nếu có đốm tan xuất hiện trên đĩa chứa vi khuẩn ký chủ, điều đó cho thấy có sự hiện diện của TKT.

Để thực hiện phương pháp tách ròng, chọn đốm tan đơn lẽ và cấy truyền bằng tâm bông vô trùng sang đĩa Petri chứa môi trường King’s B 0,8 % agar đã hòa vi khuẩn kí chủ Sau 24 giờ, thu hoạch TKT bằng cách thêm 5 ml nước cất vô trùng, tạo thành dung dịch chứa TKT với 5% Chloroform (v/v) Ly tâm huyền phù ở 6.000 vòng/phút trong 5 phút để thu được dung dịch trong chỉ chứa TKT và bảo quản ở nhiệt độ 4°C trong tối.

Cách đặt tên các dòng thực khuẩn thể được thực hiện theo quy tắc nhất định: kí hiệu thực khuẩn thể là Ф, theo sau là chữ viết tắt tên vi khuẩn kí chủ (Bur) và tỉnh nơi thu mẫu bệnh Số hiệu dòng thực khuẩn thể được chỉ định từ 1 đến 100, thể hiện số thứ tự thu thập tại một tỉnh Ngoài ra, chữ a hoặc b được sử dụng để phân biệt hai hình dạng đốm tan khác nhau dựa trên đường kính của chúng.

Ví dụ: Ф BurCT1a, trong đó: Ф: thực khuẩn thể; Bur: vi khuẩn B glumae kí chủ;

CT được phân lập tại tỉnh Cần Thơ, với số 1 đại diện cho dòng vi khuẩn thu thập từ một địa điểm cụ thể trong nhiều ruộng mẫu Mẫu TKT hình thành cùng với mẫu phân lập cho thấy sự hiện diện của hơn một TKT.

Rỳt 5 àl huyền phự từng dũng TKT khỏc nhau được nhỏ trờn mụi trường cú hũa từng dũng vi khuẩn B glumae khỏc nhau

3.3.1.2 Đánh giá khả năng kí sinh của các dòng thực khuẩn thể trên các dòng vi khuẩn gây bệnh thối hạt lúa

Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định dòng TKT có khả năng ký sinh trên nhiều dòng vi khuẩn B glumae, cũng như tìm ra các dòng vi khuẩn dễ bị ký sinh bởi TKT Điều này sẽ hỗ trợ cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực này.

Vật liệu: 112 dòng TKT và 60 dòng vi khuẩn gây bệnh thối hạt.

Phương pháp nhỏ giọt (spot test, Kutter & Sulakvelidze (2004)) Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 2 lặp lại.

Chuẩn bị đĩa Petri vô trùng đã được kẽ và đánh số nghiệm thức tương ứng, rút

Dùng 10 ml môi trường King’s B 0,8% để nuôi cấy vi khuẩn, sau đó phơi đĩa trong 10 phút Cuối cùng, rút 5 ml huyền phù từ từng ống nghiệm tương ứng.

Hình 3.1: Phương pháp kiểm tra khả năng kí sinh của các dòng thực khuẩn thể lên từng dòng vi khuẩn Burkholderia glumae

Chỉ tiêu ghi nhận là xác định khả năng phân giải của các dòng TKT trên các ký chủ khác nhau, thông qua việc quan sát sự hình thành đốm tan trên đĩa Petri sau 24 giờ.

3.3.1.3 Định danh vi khuẩn gây bệnh thối hạt bằng kỹ thuật PCR (polymerase Chain Reaction)

Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định mức độ loài của các tác nhân gây bệnh thối hạt lúa tại Đồng bằng sông Cửu Long Để thực hiện nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng 06 dòng vi khuẩn được chọn lọc từ thí nghiệm 3.3.1.2, trong đó có nhiều dòng TKT ký sinh.

- Ly trích ADN của vi khuẩn dựa vào phương pháp đun sôi tế bào vi khuẩn (Unior et al , 2016)

Bước 1: Đặt vít một vòng lúp mẫu vi khuẩn đã tinh ròng cho vào ống eppendorf đã chứa 400 àl nước cất vụ trựng hoặc TE buffer.

Bước 2: Đun sôi eppendorf đã chứa sẵn dung dịch ở bước 1 trong 20 phút.

Bước 3: Chuyển eppendorf đã đun sôi vào nước đá và ủ trong 5 phút.

Bước 4: Trộn đều hỗn hợp và li tâm ở vận tốc 13.200 vòng/phút trong 5 phút.

Bước 5: Thu được phần ADN của vi khuẩn ở phía trên của dung dịch đã ly tâm.

Bước 6: Rỳt 2 àl dung dịch nổi phớa trờn chứa ADN này vào ống tuýp PCR.

Giữ ADN của vi khuẩn đã được ly trích ở nhiệt độ 4 0 C.

 PCR: Dựa trên nguyên tắc khuyếch đại đoạn 16S rRNA có kích thước 873 bp với cặp mồi đặc hiệu cho vi khuẩn B glumae (Schaad et al., 2001):

- Làm biến tính ADN: 95 0 C trong 5 phút (1 chu kỳ)

- Gắn mồi : 29 chu kỳ gồm (95 0 C trong 30 giây; 63 0 C trong 30 giây; 72 0 C trong 45 giây)

- Sự kéo dài ADN : 1 chu kỳ (72 0 C trong 5 phút)

 Xác định sản phẩm PCR bằng kỹ thuật điện di trên gel agrarose 1%