GIỚI THIỆU 1
1 1 Tính cấp thiết của luận án
Bệnh thối hạt hay bệnh lép vàng trên lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae (Ou,
Bệnh thối hạt, được ghi nhận lần đầu tiên tại Nhật Bản vào năm 1950 (CPC, 2007), đã gây thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng lúa gạo trên toàn cầu, đặc biệt là ở Việt Nam Tại Việt Nam, bệnh này lần đầu tiên được phát hiện ở Đồng bằng sông Hồng.
Bệnh thối hạt do vi khuẩn B glumae đã gây thiệt hại năng suất lúa lên đến 75% vào năm 1992 (Trung et al, 1993) và ảnh hưởng đến nhiều giai đoạn phát triển của cây lúa, từ giai đoạn mạ đến giai đoạn lúa ngậm sữa, dẫn đến sự giảm sút đáng kể về năng suất (Tsushima et al, 1986; Li et al, 2017) Trong bối cảnh biến đổi khí hậu toàn cầu, bệnh thối hạt trên lúa được dự đoán sẽ trở thành mối đe dọa lớn đối với an ninh lương thực, đặc biệt khi nhiệt độ trái đất tăng lên, vì điều kiện tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn B glumae là từ 30–35°C (Zhou-qi et al, 2016; Mizobuchi et al, 2020) Một nghiên cứu tại Hoa Kỳ cho thấy, nếu nhiệt độ tăng thêm 1°C, bệnh thối hạt có thể gây thiệt hại nghiêm trọng cho các vùng sản xuất lúa, ảnh hưởng đến 2,7 triệu người không có đủ gạo ăn Do đó, việc nghiên cứu và quản lý bệnh thối hạt là cần thiết để tìm ra giải pháp giảm thiểu tác động của nó đối với an ninh lương thực toàn cầu trong bối cảnh nhiệt độ trái đất ngày càng nóng lên (Shew et al).
Tại Việt Nam, việc quản lý bệnh do vi khuẩn trên lúa chủ lực chủ yếu dựa vào biện pháp hóa học như oxolinic axit, thuốc gốc đồng và thuốc gốc kháng sinh Tuy nhiên, việc sử dụng hóa chất này đã dẫn đến tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh Chẳng hạn, tại Nhật Bản, vi khuẩn B glumae đã phát triển khả năng kháng oxolinic axit ở nhiều vùng như Toyama, Nagano, Iwate, Niigata, Fukushima và Chiba.
Mặt trái của thuốc bảo vệ thực vật không chỉ tác động trực tiếp đến môi trường mà còn gián tiếp làm giảm tính đa dạng sinh học, ảnh hưởng đến chất lượng nông sản và sức khỏe con người (Mizobuchi et al, 2020).
Nghiên cứu các chế phẩm sinh học nhằm giảm thiểu việc sử dụng thuốc hóa học đang trở thành xu hướng quan trọng để nâng cao chất lượng nông sản và bảo vệ sức khỏe con người cũng như môi trường Thực khuẩn thể, hay còn gọi là phages, là loại virus ký sinh đặc hiệu trên tế bào vi khuẩn, đã được nghiên cứu và ứng dụng hiệu quả trong việc phòng trừ bệnh hại vi khuẩn trên cây trồng Một số lợi ích nổi bật của thực khuẩn thể bao gồm thời gian hoàn thành chu kỳ ngắn từ 15 phút đến 1 giờ, tính không độc hại với tế bào nhân thực, và khả năng trở thành giải pháp tiềm năng trong bối cảnh gia tăng kháng thuốc của vi khuẩn.
Ngày nay, liệu pháp thực khuẩn thể đã đạt được nhiều thành công trong việc quản lý các bệnh do vi khuẩn trên thực vật, như bệnh loét trên cam do Xanthomonas axonopodis pv citri (Balogh et al, 2008), bệnh héo xanh trên cà chua do Ralstonia solanacearum (Fujiwara et al, 2011), bệnh cháy lá trên hành do X axonopodis pv allii (Lang et al, 2007; Nga et al, 2021), bệnh thối nhũn cây hoa loa kèn do Erwinia carotovora subsp carotovora (Ravensdale et al, 2007), và bệnh cháy bìa lá trên lúa do X oryzae pv oryzae (Ou, 1985; Dong et al, 2018) Đặc biệt, sản phẩm từ thực khuẩn thể đầu tiên, AgriPhage, đã được Cục bảo vệ Môi sinh Hoa Kỳ (EPA) cho phép thương mại hóa vào năm 2005 để quản lý bệnh đốm lá cà chua do vi khuẩn.
Pseudomonas syringae pv tomato và vi khuẩn X campestris pv vesicatoria (Nagy et al, 2012) hiện đang được ứng dụng trong sản xuất Thực khuẩn thể đã chứng minh là một giải pháp tiềm năng trong việc phòng ngừa các bệnh do vi khuẩn gây ra, có ứng dụng rộng rãi trong y học, thực phẩm và nông nghiệp.
Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào về hiệu quả quản lý bệnh thối hạt lúa bằng thực khuẩn thể trong điều kiện ngoài đồng, đặc biệt là về mặt hình thái và di truyền của các dòng thực khuẩn thể Nghiên cứu "Sử dụng thực khuẩn thể trong phòng trị bệnh thối hạt trên lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae" được thực hiện nhằm giảm thiểu lượng thuốc bảo vệ thực vật trong quản lý bệnh thối hạt lúa Kết quả nghiên cứu sẽ làm rõ di truyền của các dòng thực khuẩn thể, đóng góp vào chiến lược quản lý bệnh an toàn tại Việt Nam.
Mục tiêu chính của luận án là đánh giá hiệu quả và tính an toàn của thực khuẩn thể trong việc kiểm soát bệnh thối hạt lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae gây ra Nghiên cứu sẽ tìm kiếm điều kiện tối ưu để nuôi cấy thực khuẩn thể, từ đó áp dụng vào thực tiễn quản lý bệnh thối hạt lúa, nhằm giảm thiểu việc sử dụng thuốc hóa học trong quản lý dịch hại, đặc biệt tại đồng bằng sông Cửu Long và trên toàn quốc.
1 3 Nội dung nghiên cứu Đề tài thực hiện gồm những nội dung năm nội dung chính:
Nội dung 1: Phân lập, tuyển chọn thực khuẩn thể và vi khuẩn gây bệnh thối hạt lúa
Nội dung 2: Đánh giá khả năng phòng trị bệnh thối hạt của các dòng thực khuẩn thể triển vọng trong điều kiện nhà lưới
Nội dung 3: Xác định tính an toàn của các dòng thực khuẩn thể triển vọng trong thực tiễn sản xuất
Nội dung 4: Đánh giá hiệu quả của các dòng thực khuẩn thể triển vọng phòng trị bệnh thối hạt lúa ở điều kiện ngoài đồng
- Nội dung 5: Khảo sát điều kiện nhân nuôi thực khuẩn thể triển vọng
1 4 Tính mới của luận án
- Xác định vi khuẩn gây bệnh thối hạt chủ yếu trên lúa ở ĐBSCL là do loài
Ba dòng thực khuẩn thể có tiềm năng cao trong việc phòng trị bệnh thối hạt đã được xác định, với hiệu quả giảm bệnh trên 50%, tương đương với thuốc hóa học Những dòng thực khuẩn thể này thuộc nhóm thực khuẩn thể độc (virulent phages), đảm bảo tính an toàn trong quản lý bệnh thối hạt do vi khuẩn B glumae.
Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu cho dòng thực khuẩn thể triển vọng nhằm đạt mật số cao khoảng 10^10 pfu/ml là rất quan trọng, giúp đáp ứng nhu cầu sử dụng rộng rãi trong các ứng dụng sinh học và y tế.
1 5 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
1 5 1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của luận án là cây lúa, bệnh thối hạt lúa do vi khuẩn
Burkholderia glumae và thực khuẩn thể kí sinh vi khuẩn B glumae
Luận án nghiên cứu thu thập mẫu bệnh và vi khuẩn gây bệnh thối hạt từ các tỉnh ĐBSCL, tiến hành phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn tiềm năng trong phòng thí nghiệm và nhà lưới Nghiên cứu cũng định danh các dòng vi khuẩn dựa vào đặc điểm hình thái dưới kính hiển vi điện tử tại Viện Công Nghệ Kyoto, Nhật Bản.
Bản) và đặc điểm trình tự bộ genome (tại Bộ môn Công Nghệ Gen, trường Đại học
Leuven, Vương quốc Bỉ) để xác định tính an toàn TKT trước khi sử dụng ở diện rộng
Nghiên cứu đã tiến hành thí nghiệm đánh giá hiệu quả phòng trị của thực khuẩn thể đối với bệnh thối hạt trên hai vụ lúa tại huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long Cuối cùng, khảo sát điều kiện nuôi cấy thực khuẩn thể được thực hiện trong phòng thí nghiệm để đảm bảo tính hiệu quả và khả năng ứng dụng trong thực tiễn.
1 6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Luận án nghiên cứu khoa học về bệnh thối hạt lúa, xác định vi khuẩn Burkholderia glumae là tác nhân gây bệnh chính Nghiên cứu đã tuyển chọn các dòng thực khuẩn thể tiềm năng để phòng trừ bệnh thối hạt và khẳng định hiệu quả của TKT trong điều kiện ngoài đồng Đồng thời, luận án cũng đóng góp mới về mặt khoa học bằng việc xác định tính an toàn của tác nhân sinh học TKT dựa trên khía cạnh sinh học phân tử.
Nghiên cứu này sẽ đóng góp vào việc phát triển chiến lược quản lý bệnh do vi khuẩn một cách thân thiện với môi trường, đặc biệt là bệnh thối hạt lúa tại Việt Nam Kết quả cũng chỉ ra rằng việc ứng dụng thực khuẩn thể là khả thi, nhờ vào hiệu quả giảm bệnh và phương pháp nhân nuôi hợp lý.
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 55
3 1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Thời gian: từ tháng 5 năm 2015 đến tháng 5 năm 2019
- Địa điểm: Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Nghiệp, Trường Đại Học
Cần Thơ và Viện Công Nghệ Kyoto, Nhật Bản, vùng trồng lúa tại huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long
3 2 1 Dụng cụ thiết bị và vật liệu
Kính hiển vi quang học, kính hiển vi điện tử (HD-2700, Hitachi High-
Công ty Technologies Corp tại Nhật Bản cung cấp nhiều thiết bị hiện đại như máy đo pH, cân điện tử, và các loại tủ thanh trùng ướt và khô Ngoài ra, họ còn cung cấp đèn cồn, đĩa Petri, bình tam giác, waterbath, và ống falcon, đáp ứng nhu cầu trong các lĩnh vực nghiên cứu và công nghiệp.
(15 ml, 50 ml), micropipette (0,5 àl – 1000 àl), tủ lạnh, tủ ỳm, tủ õm -800C, tủ õm -
- Giống lúa: giống OM4900 xác nhận (thực hiện thí nghiệm từ nhà lưới đến ngoài đồng)
- Nguồn th ự c khu ẩ n th ể và vi khu ẩ n gây b ệ nh th ối h ạt được phân l ậ p tạ i t ỉnh An
Giang, Bạ c Liêu, Kiên Giang, Sóc Trăng, Trà Vinh, Vĩnh Long, Đồng Tháp, H ậ u
Giang và TP C ần Thơ , vi khuẩn Burkholderia glumae MAFF 106551 (Research Center of Genetic Resources, NARO, http://www gene affrc go jp, Nhật Bản)
- Hóa chất: các hóa chất cần thiết cho môi trường King’s B, SM Buffer, PDA, PDAP,
- Các loại môi trường và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu sinh học
Các loại môi trường sử dụng trong nghiên cứu
1 Công thức môi trường King’s B (King et al , 1954)
MgSO4 7H2O Glycerol Agar Nước cất
2 Môi trường King’s B 0,8% agar được dùng nuôi thực khuẩn thể
400 mM Tris HCl (pH = 7,5) 125 ml
4 Môi trường Potato D-glucose agar (PDA) (Atlas, 2010)
Khoai tây Đường D-glucose Nước cất pH
5 Môi trường Potato D-glucose agar peptone (PDAP) (Louis & Cooke, 1985)
Khoai tây Đường D-glucose Peptone
Sodium chloride Yeast extract Nước cất pH
Các hóa chất dùng trong ly trích ADN từ thực khuẩn thể
Phenol (Merk), chloroform (Việt Nam), isoamyl alcohol (Merk), sodium acetate (Merk), ethanol 95%, ethanol 70%, nước cất 2 lần, Tris HCl (pH 8,0), TE buffer 1X
(10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA)
Các hóa chất dùng cho phản ứng PCR
Milli Q (nước cất 2 lần), Mastermix (Phusa), cặp mồi đặc hiệu cho vi khuẩn B glumae: đoạn mồi (1416S: (5’-GAGAGAATCGACCATGAAC-3’; 1414A: (3’-
GAGCGCATCCAGAACGAAGT-5’) (Schaad et al , 2001, Ph ụ bả ng)
Các hóa chất dùng trong điện di
Ethium Bromide (Merk), loading buffer 10 X, ladder 1 kb (Thermo scientific), ladder 100 bp (Thermo scientific), agarose (Merk), 1X TAE buffer (400mM Tris acetate, 1 mM EDTA, pH 8)
3 3 NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nội dung 1: Phân lập và tuyển chọn thực khuẩn thể cùng vi khuẩn gây bệnh thối hạt lúa nhằm mục tiêu xác định nguồn tài nguyên tiềm năng Qua đó, nghiên cứu sẽ lựa chọn một số dòng thực khuẩn thể có khả năng phòng trị hiệu quả bệnh thối hạt lúa.
3 3 1 1 Phân lập thực khuẩn thể và vi khuẩn gây bệnh thối hạt ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long
Mục tiêu : chọn ra nguồn TKT và vi khuẩn gây bệnh thối hạt làm nguồn vật liệu cho các thí nghiệm sau
Phương pháp phân lậ p vi khu ẩn gây b ệ nh (Goszczynska et al , 2000)
Phương pháp thu mẫu bệnh thối hạt được thực hiện bằng cách thu thập mẫu từ các ruộng lúa có diện tích từ 1.000 m² trở lên, với mỗi ruộng được xem là một địa điểm Trong quá trình thu mẫu, cần lấy 5 điểm trên mỗi ruộng vào giai đoạn lúa trổ đến trước khi thu hoạch Triệu chứng điển hình của bệnh này trên bông lúa là những hạt bị thối nhưng không quá khô; khi tách vỏ trấu, hạt gạo xuất hiện tình trạng lửng với vết nâu ngậm nước ở phần phôi.
Phương pháp phân lập vi khuẩn gây bệnh yêu cầu thu thập các mẫu hạt và đặt chúng trong túi ni-lông riêng biệt với nhãn ghi rõ thông tin Việc phân lập mẫu cần được thực hiện trong ngày hoặc muộn nhất là một ngày sau khi thu thập Tại phòng thí nghiệm, các mẫu bệnh sẽ được quan sát dưới kính hiển vi để ghi nhận hiện tượng tuôn dịch vi khuẩn từ hạt lúa bệnh.
Các bước phân lập vi khuẩn
Bước 1: Tách vỏ hạt lúa và khử trùng bề mặt hạt bằng cồn 70%
Bước 2: Lam đã được khử trùng và cắt phần phôi giới hạn giữa mô khỏe và mô bệnh Sau đó, mẫu bệnh được cắt nhỏ và thêm vào 1-2 giọt nước cất vô trùng, để yên khoảng 1 phút nhằm cho vi khuẩn trong mẫu bệnh hòa tan vào nước.
Bước 4: Vạch giọt huyền phù vi khuẩn trên môi trường dinh dưỡng King’s B 2% agar Bước 5: Sau 24 giờ tiến hành tách ròng và trữ nguồn vi khuẩn
Cách đặt tên các chủng vi khuẩn bao gồm việc sử dụng ký tự chữ để viết tắt tên vi khuẩn và tỉnh nơi thu mẫu bệnh Đồng thời, ký hiệu số sẽ chỉ định chỉ số dòng vi khuẩn được thu thập tại một tỉnh, với các giá trị từ 1 đến 100.
BurCT1 là tên gọi của một dòng vi khuẩn, trong đó "Bur" là viết tắt của vi khuẩn Burkholderia glumae, "CT" chỉ rõ vi khuẩn được phân lập tại tỉnh Cần Thơ, và số 1 thể hiện rằng đây là dòng vi khuẩn được thu thập từ một địa điểm cụ thể trong nhiều ruộng đã được lấy mẫu tại tỉnh Cần Thơ.
Phương pháp phân lập thực khuẩn thể theo Nga & Giang (2016 có hiệu chỉnh) bắt đầu bằng việc tách bỏ vỏ trấu của mẫu hạt lúa có triệu chứng bệnh điển hình, sau đó lấy phần phôi nhũ thối và nghiền trong cối sứ Tiếp theo, rút 5 ml nước cất vô trùng vào cối chứa hạt gạo bị bệnh, nghiền đến khi hạt gạo mịn, rồi ly tâm ở 6.000 vòng/phút trong 5 phút Phần dung dịch phía trên được chuyển vào ống tuýp mới, bổ sung 5% choloroform (v/v), và tiếp tục ly tâm ở 6.000 vòng/phút trong 5 phút để thu được dung dịch trong, dùng để kiểm tra sự hiện diện của TKT.
Bước 2: Rút 100 µl huyền phù vi khuẩn (OD 600nm: 0,3) đã được phân lập trước đó trên cùng một mẫu bệnh, sau đó cho vào 10 ml môi trường King’s B 0,8% agar đã được nấu chảy và để nguội ở 50°C, khuấy đều dung dịch Tiếp theo, rút 5 µl dung dịch TKT (thu được từ bước 1) vào đĩa Petri đã chứa vi khuẩn ký chủ Cuối cùng, đĩa được ủ trong điều kiện phòng và quan sát sự hình thành các đốm tan (plaque); nếu có đốm tan xuất hiện trên đĩa chứa vi khuẩn ký chủ, điều đó chứng tỏ có sự hiện diện của TKT.
Bước 3: Thực hiện phương pháp tách ròng bằng cách chọn đốm tan đơn lẽ và cấy truyền bằng tâm bông vô trùng sang đĩa Petri chứa môi trường King’s B 0,8% agar đã hòa vi khuẩn ký chủ Sau 24 giờ, TKT được thu hoạch bằng cách thêm 5 ml nước cất vô trùng, tạo ra dung dịch chứa TKT với bổ sung 5% Chloroform.
Ly tâm huyền phù với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 5 phút giúp tách phần dung dịch chỉ chứa tế bào vi khuẩn kí chủ và TKT Sau đó, dung dịch này được trữ ở nhiệt độ 4 độ C để bảo quản nguồn.
Cách đặt tên các dòng thực khuẩn thể được quy định như sau: kí hiệu thực khuẩn thể là Ф, tiếp theo là kí tự chữ viết tắt tên vi khuẩn kí chủ (Bur) và tỉnh nơi thu mẫu bệnh Kí hiệu số thể hiện chỉ số dòng thực khuẩn thể thu thập tại một tỉnh, có số thứ tự từ 1 đến 100 Cuối cùng, chữ a hoặc b được sử dụng để phân biệt hai hình dạng đốm tan trên một kí chủ, dựa vào đường kính của đốm tan.
Ví dụ: Ф BurCT1a, trong đó: Ф: thực khuẩn thể; Bur: vi khuẩn B glumae kí chủ;
Tại tỉnh Cần Thơ, chúng tôi đã tiến hành phân lập vi khuẩn từ nhiều ruộng khác nhau Số lượng vi khuẩn được thu thập tại một địa điểm cụ thể trong tỉnh này là một Đặc biệt, mẫu TKT hình thành cùng với mẫu phân lập cho thấy sự hiện diện của hơn một TKT.
3 3 1 2 Đánh giá khả năng kí sinh của các dòng thực khuẩn thể trên các dòng vi khuẩn gây bệnh thối hạt lúa
Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định dòng TKT có khả năng kí sinh nhiều dòng vi khuẩn B glumae, cũng như tìm ra các dòng vi khuẩn mà TKT có thể kí sinh hiệu quả Những phát hiện này sẽ phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực này.
V ật liệ u: 112 dòng TKT và 60 dòng vi khuẩn gây bệnh thối hạt
Phương pháp nhỏ giọ t (spot test, Kutter & Sulakvelidze (2004))
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 2 lặp lại
Chuẩn bị đĩa Petri vô trùng đã được kẽ và đánh số nghiệm thức tương ứng, rút
Môi trường King’s B 0,8% là một loại agar được sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn Sau khi chuẩn bị 10 ml môi trường, cần phơi đĩa trong 10 phút Cuối cùng, rút 5 ml huyền phù từ từng ống nghiệm tương ứng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Rỳt 5 àl huyền phự từng dòng TKT khác nhau được nhỏ trên môi trường có hòa từng dòng vi khuẩn B
Hình 3 1: Phương pháp kiểm tra khả năng kí sinh của các dòng thực khuẩn thể lên từng dòng vi khuẩn Burkholderia glumae