TÌM HIỂU PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO XÁC ĐỊNH ĐÔNG THỜI VITAMIN B1, B6, B12 TRONG SỮA BỘT VÀ SỮA TƯƠI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA CÔNG NGHỆ BÁO CÁO ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH CNHH TÌM HIỂU PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO XÁC ĐỊNH ĐÔNG THỜI VITAMIN B1, B6, B12 TRONG SỮA BỘT VÀ SỮA TƯƠI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA CÔNG NGHỆ  BÁO CÁO ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH CNHH TÌM HIỂU PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO XÁC ĐỊNH ĐÔNG THỜI VITAMIN B1, B6, B12 TRONG SỮA BỘT VÀ SỮA TƯƠI CÁN BỘ HƯỚNG DẪN NHÓM SV THỰC HIỆN: Tháng 09/2021 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập thực đồ án chuyên ngành, nhóm nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ từ thầy mơn Cơng nghệ hóa học, gia đình bạn bè Nhóm đồ án chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc tới: Bộ mơn Cơng nghệ Hóa học – khoa Công nghệ - trường Đại học Cần Thơ, thầy cô tham gia giảng dạy cung cấp kiến thức suốt q trình nhóm thực đồ án Đặc biệt, nhóm đồ án xin gửi lời cảm ơn sâu săc tới cô…………….là người trực tiếp hướng dẫn tận tình suốt thời gian nhóm thực đồ án Sau cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè người ln động viên, quan tâm giúp đỡ nhóm Trong thời gian thực đồ án, khả nghiên cứu nhóm cịn đơi phần hạn chế cộng với tình hình dịch bệnh diễn biến căng thẳng, chắn đồ án nhóm cịn thiếu sót Nhóm chúng em mong nhận ý kiến đóng góp từ thầy với bạn nhóm đồ án khác Cần Thơ, ngày…tháng…năm 2021 Sinh viên thực MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC .iii DANH SÁCH HÌNH v DANH SÁCH BẢNG .v DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT v Chương I: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Nội dung nghiên cứu .1 Chương II: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan Vitamin B1, Vitamin B6 Vitamin B12 2.1.1 Vitamin B1 .2 2.1.2 Vitamin B6 .4 2.1.3 Vitamin B12 .6 2.2 Sơ lược sữa tươi sữa bột 2.2.1 Sữa tươi 2.2.2 Sữa bột .8 2.3 Tổng quan xác định vitamin B1, B6 B12 phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 2.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 2.3.2 Nguyên tắc phương pháp HPLC .9 2.3.3 Các đại lượng đặc trưng trình sắc ký: 10 2.3.4 Sơ đồ máy HPLC 12 Chương III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 3.1 Nội dung nghiên cứu 13 3.2 Phương pháp nghiên cứu 13 3.2.1 Chọn detector 13 3.2.2 Chọn pha tĩnh 13 3.2.3 Lựa chọn dung môi 13 3.2.4 Chọn pha động .14 3.2.5 Khảo sát bước sóng hấp thụ quang vitamin B1,B6 B12 14 3.2.6 Khảo sát lựa chọn tỉ lệ pha động 14 3.2.7 Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng chảy 15 3.3 Sơ đồ nghiên cứu phương pháp phân tích 16 TÀI LIỆU THAM KHẢO .17 DANH SÁCH HÌ Hình Công thức cấu tạo thiamin Hình 2 Phản ứng oxy hóa thiamin Hình Công thức cấu tạo pyridoxine .4 Hình Cơng thức cấu tạo pyridoxal pyridoxamine Hình Cơng thức cấu tạo hai dạng vitamin B12 Hình Sữa tươi .8 Hình Sữa bột Hình Sắc ký đồ phương pháp HPLC 10 Hình Sơ đồ máy sắc ký lỏng hiệu cao .12 Y Hình Sơ đồ phương pháp nghiên cứu 16 DANH SÁCH BẢ Bảng Hàm lượng vitamin B1 số thực phẩm Bảng 2 Hàm lượng vitamin B6 số thực phẩm: .5 Bảng Hàm lượng vitamin B12 số thực phẩm Y Bảng Bảng điều kiện sắc ký .15 DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt: Tên gốc HPLC : sắc ký lỏng hiệu cao ACN: axetonitril PDA: Personal Digital Assistant Chương I: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Vitamin hợp chất hữu có cấu tạo khác nhau, đa dạng với nhiều loại Gồm loại vitamin A, B, C, D, E, K… Trong vitamin nhóm B biết đến nhóm vitamin đa dạng với loại B1, B2, B3, B5, B6, B9, B12 Các vitamin nhóm B có vai trị qua trọng hoạt động sống thể, đặt biệt vitamin B1, B6, B12 Vitamin B1 có vai trị quan trọng việc chuyển hóa lượng thể Vitamin B6 đóng vai trị loại coenzym giúp chuyển hóa chất đạm, chất béo, carbohydrat Cịn vitamin B12 có vai trị quan trọng việc phân chia trưởng thành tế báo thể Việc xác định xác hàm lượng loại vitamin B1, b6 B12 thực phẩm có ý nghĩa quan trọng sức khỏe người tiêu dùng Có nhiều để xác định hàm lượng vitamin thực phẩm dược phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) sử dụng phổ biến Chính lý đó, nhóm em đề xuất thực đề tài đồ án “Tìm hiểu phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao xác định đông thời vitamin B1, B6, B12 sữa bột sữa tươi” 1.2 Mục đích đề tài Mục đích đề tài nghiên cứu quy trình sắc ký lỏng hiệu cao để xác định đồng thời loại vitamin B1, B6, B12 sữa bột sữa tươi 1.3 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu sơ lược loại vitamin có sữa bột sữa tươi Tìm hiểu tính chất chúng, công dụng loại vitamin kể đời sống Tìm hiểu phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao, bước thực phương pháp tính tốn Cuối đề xuất quy trình thực để xác định đồng thời vitamin B1, B6, B12 sữa bột sữa tươi phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Chương II: Tổng quan tài liệu Chương II: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan Vitamin B1, Vitamin B6 Vitamin B12 2.1.1 Vitamin B1 2.1.1.1 Giới thiệu chung Tên thông thường: Vitamin B1 hay thiamine Tên IUPAC : 2-[3-[(4-amino-2-methylpyrimidin-5-yl)methyl]-4-methyl-1,3thiazol-3-ium-5-yl]ethanol Công thức phân tử: C12H17SON4 Khối lượng mol phân tử: 265,35 g/mol Cơng thức cấu tạo: Hình Cơng thức cấu tạo thiamin 2.1.1.2 Tính chất vật lý Vitamin B1 tinh thể trắng nhỏ hay bột kết tinh có mùi đặc trưng Khi tiếp xúc với khơng khí, chế phẩm khan nhanh chóng hút ẩm Tan tốt nước, bền acid, bị phân hủy nhanh chóng mơi trường kiềm Vitamin B1 khơng ổn định với ánh sáng độ ẩm Mất hoạt tính mơi trường trung tính base Một số dạng chế phẩm vitamin B1: thiamin monohydroclorua, thiamin mononitrat, 2.1.1.3 Tính chất hóa học Vitamin B1 dẫn xuất pyrimidin gắn với dẫn xuất thiazol qua nhóm metulen Ngồi thiamin cịn tồn dạng photphat este gồm thiamin monophotphat (TMP), thiamin driphotphat (TTP), thiamin pyrophotphat (TPP) dạng mà vị trí nhóm OH dính vào 1, gốc photphat Vitamin B1 bị oxy hóa K 3[Fe(CN)6] môi trường kiềm tạo thành thiocrom màu vàng phát huỳnh quang màu xanh da trời Phản ứng dùng để định tính hay định lượng vitamin B1 phương pháp đo huỳnh quang Chương II: Tổng quan tài liệu Hình 2 Phản ứng oxy hóa thiamin Tổng hợp tiamin pyrophotphat (TPP): vitamin B1 phản ứng tốt với HBr để tạo thành hợp chất thiamin-bromo Các chất bromo phản ứng với dung dịch pyrophotphat bạc acid photphoric acid clohydric để tạo thành TPP Thiamin tạo kết tủa phản ứng với thủy ngân (II) clorua, acid picric, tanin Tổng hợp vitamin B1 tổng hợp từ phản ứng 2-metyl-4-amino-5bromo-metyl-pyrimidine-hydrobromide 4-metyl-5-β-oxy-etyl-thiazone Sau cho sản phẩm thu qua acid clohydric 2.1.1.4 Chức Vitamin B1 thành phần men thiamin pyrophotphat (TPP) có vai trị quan trọng chuyển hóa tinh bột, đường (gluxit) Cần cho q trình tổng hợp acid ribonucleic (RNA) acid deoxyribonucleic (DNA) acid liên quan đến di truyền, cần cho trình tổng hợp nicotinamit adenin dinucleotit photphat (NADP) cần cho tổng hợp acid béo, mà acid béo khơng no có nhiều vai trò quan trọng thể Vitamin B1 cịn tham gia q trình sản xuất giải phóng chất dẫn truyền thần kinh axetycolin, chuyển hóa số acid amin cần thiết leucin, isoleucin valin Khi thiếu vitamin B1 bị mắc bệnh Beri-beri 2.1.1.5 Nhu cầu vitamin B1 nguồn thực phẩm Với nồng độ cao Vitamin B1 hấp thụ chế thụ động nồng độ thấp hấp thụ hệ thống vận chuyển chủ động qua trung gian số chất mang bị photphony hóa Sau hấp thụ ruột non tá tràng, chuyển vào gan liên kết với photpho thành dạng hoạt động, vào máu để phân bố khắp thể Trong máu vitamin B1 gắn với protein huyết tương mà chủ yếu albumin hồng cầu quan dự trữ gồm cơ, tim, gan, thận não Hàm lượng vitamin B1 mơ nên thể phụ thuộc vào lượng thức ăn Chương II: Tổng quan tài liệu Hàm lượng Hàm lượng Thực phẩm (mg/100g) (mg/100g) Cao men bia 3.1 Bánh mì từ bột thơ 0,34 Đậu nành khơ 1.1 Lịng đỏ trứng gà 0,32 Đậu xanh hạt 0,72 Thịt bó 0,2 Thịt heo 0,53 Thịt gà 0,15 Gạo 0,41 Bảng Hàm lượng vitamin B1 số thực phẩm Thực phẩm 2.1.2 Vitamin B6 2.1.2.1 Giới thiệu chung Tên thông thường: Vitamin B6 hay pyridoxine Tên IUPAC : 4,5-di (hydroxymethyl)-2-methylpyridin-3-ol Công thức phân tử: C8H10NO3 Khối lượng mol phân tử: 169,18 g/mol Cơng thức cấu tạo: Hình Công thức cấu tạo pyridoxine Vitamin B6 tồn dạng: pyridoxine, pyridoxal, pyridoxamine Cả loại có thực phẩm từ động thực vật hoạt tính tương đương Hình Cơng thức cấu tạo pyridoxal pyridoxamine 2.1.2.2 Tính chất vật lý Pyridoxine base tinh thể không màu, vị đắng, nóng chảy 160 °C tan nước Pyridoxine hydrochloric nóng chảy 204 -206°C, bền vững đun nóng Bền đun sơi axit hay kiềm, khơng bền mơi trường có tính oxy hóa Vitamin B6 nhạy cảm với ánh sáng, chúng phân hủy nhanh chiếu sáng môi trường kiềm hay trung tính, cịn mơi trường axit pyridoxine, pyridoxal pyridoxamin bền Chương II: Tổng quan tài liệu Cả chất hấp thụ xạ tử ngoại đo phổ hấp thụ vùng tia tử ngoại để định tính định lượng vitamin B6 2.1.2.3 Tính chất hóa học Cả hợp chất dẫn xuất pyrin, có nguyên tử N nên mang lại cho pyridoxine tính base Pyridoxine dễ bị oxy hóa, tác nhân xúc tác q trình ánh sáng tia tử ngoại, pyridoxine tác dụng với Fe(III) cho muối phức màu đỏ Pyridoxine dạng dẫn xuất photphat pyridoxine photphat tham gia vào trình chuyển hóa acid amin, lipit, gluxit, chuyển protein thành gluxit Vitamin B6 giữ vai trị quan trọng chuyển hóa acid amin Ngồi ra, vitamin B6 cịn tham gia vào trình tách CO2 acid amin liên quan đến cân thể Các phản ứng chuyển hóa liên quan đến hình thành chất trung gian thần kinh chất điều hòa khác: taurine, histamine,… 2.1.2.4 Chức Những người mắc bệnh thận ruột non bị hạn chế hấp thụ chất dinh dưỡng từ thực phẩm (hội chứng hấp thu) có nhiều khả thiếu vitamin B6 Một số bệnh di truyền số thuốc động kinh dẫn đến tình trạng thiếu hụt vitamin B6 Điều gây tinh trạng thiếu hụt hồng cầu khỏe mạnh để mang oxy đến mô thể (thiếu máu, hệ thống miễn dịch suy yếu) Bổ sung vitamin B6 giúp điều trị số chứng bệnh: bệnh tim đột quỵ, ốm nghén, hội chứng kinh nguyệt, thiếu máu… 2.1.2.5 Nhu cầu vitamin B6 nguồn thực phẩm Điều trị bệnh thiếu vitamin B6 với phụ nữ có thai cho bú: 5-25mg/ngày tuần sau trì 1,5-2,5mg/ngày Hội chứng phụ thuộc pyridoxin 10-250mg/ngày; trẻ sơ sinh 2-15mg/ngày, viêm thần kinh thuốc 25-50mg/ngày Thực phẩm Hàm lượng Thực phẩm Hàm (mg/100g) (mg/100g) Mầm lúa mì 0,95 Thịt bị hầm 0,27 Chuối 0,51 Khoai tây 0,25 Thịt gà tây 0,44 Hàu nướng 0,12 Thịt gà 0,29 Bánh mì bột thơ 0,12 Cá trắng 0,29 Bảng 2 Hàm lượng vitamin B6 số thực phẩm: lượng Chương II: Tổng quan tài liệu 2.1.3 Vitamin B12 2.1.3.1 Giới thiệu chung Tên thông thường: Vitamin B12 hay cobalamin Tên IUPAC : -(5,6-dimetylbenzimidazolyl)cobanmitxianide Công thức phân tử: C16H88CoN14O14P Khối lượng mol phân tử: 1355,37 g/mol Công thức cấu tạo: Vitamin 12 thường tồn hai dạng: xianocobalamin hidroxocobalamin Hình Cơng thức cấu tạo hai dạng vitamin B12 2.1.3.2 Tính chất vật lý Vitamin B12 thường trạng thái kết tinh, có kích thước nhỏ, có màu đỏ sẫm, không mùi, không vị Vitamin B12 tan tốt nước, không tan dung môi hữu êt, axeton, benzen, clorofom Vitamin B12 bền bóng tối nhiệt độ thường, bền nhiệt Vitamin b12 dễ bị phân hủy ánh sáng Khi tiếp xúc với kim loại nặng dễ hoạt tính khơng bền mơi trường kiềm (pH > 7) 2.1.3.3 Tính chất hóa học: Vitamin B12 vitamin nhóm B có nguyên tử kim loại phân tử, có cấu tạo phức tạp Có thể chia thành hai phần: Phần thứ gồm nhân pyrol, nhân nguyên tử coban hóa trị III, nhân bị nhóm metyl, axetamit, propionamit Phần thứ hai phần Chương II: Tổng quan tài liệu nucleotit gồm 5,6-dimetylbenzimidazol este hóa acid photphoric Hai phần nối với qua cầu nối isopropanol Nguyên tử coban liên kết cộng hóa trị với nguyên tử nito nhân pyrol, liên kết cho nhận với ba nguyên tử nito lại nguyên tử nito nhan benzimidazol; liên kết ion với nguyên tử oxi phân tử acid photphoric Nguyên tử coban liên kết cới nhóm chức khác tạo vitamin B12 khác Vitamin B12 thường tồn hai dạng: xianocobalamin nguyên tử Co liên kết với nhóm –CN hidroxocobalamin nguyên tử Co liên kiết với nhóm –OH Vitamin B12 thành phần cấu tạo nên enzym xúc tác cho phản ứng chuyển hóa ribonucleotit thành deoxyribonucleotit Vitamin B12 xúc tác quan trọng hai loại phản ứng thiết yếu: đồng phân hóa, vận chuyển nhóm metyl 2.1.3.4 Chức Tham gia phản ứng tổng hợp thymidylete, thành phần phân tử DNA, cung cấp nguyên liệu để tổng hợp DNA, góp phần vào trình phân chia tế bào trưởng thành tế bào thể Thiếu vitamin B12cho thấy ảnh hưởng rõ rệt lên tế bào có phân bào cao nhiều tế bào máu, tế bào biểu môn Tham gia tổng hợp trao đổi chất có coban Vitamin B12 ảnh hưởng đến chuyển hóa lipit gluxit, cụ thể kích thích hoạt tính coenzym tham gia vào q trình chuyển hóa gluxit thành lipit 2.1.3.5 Nhu cầu vitamin B12 nguồn thực phẩm Hàm lượng vitamin B12 cần tối thiểu cho hoạt động bình thường thể 3g Trên nguyên tắc cần uống ly sữa đủ cung cấp vitamin B12 cho thể Trẻ sơ sinh thiếu vitamin B12 người mẹ ăn chay không uống sữa Nếu cung cấp vitamin B12 nhiều so với mức thông thường bị viêm dây thần kinh Thực phẩm Hàm lượng Thực phẩm Hàm lượng (g/100g) (g/100g) Thịt cừu non (rán) 83 Ngũ cốc 1,7 Gan heo 23 Cá tuyết (sống) Cá trích (nướng) 15 Thịt heo nạc (sống) Cá hồi Sữa bò 0,9 Trứng gà tươi 2,5 Cao men bia 0,5 Phomat 2,4 Thịt gà (sấy) Lượng nhỏ Thịt bò nạc (sống) Bảng Hàm lượng vitamin B12 số thực phẩm Chương II: Tổng quan tài liệu 2.2 Sơ lược sữa tươi sữa bột 2.2.1 Sữa tươi Sữa tươi sữa động vật (bị sữa, dê, cừu, ) dạng lỏng, chưa tiệt trùng hay trùng thiết bị xử lý nhiệt, chưa qua chế biến qua sơ chế Sữa tươi trình vận chuyển lúc bảo quản cần đảm bảo điều kiện có nhiệt độ thấp (khoảng - độ C) Loại sữa tươi thơng dụng sữa bị tươi Đồ án thực việc nghiên cứu sữa bò tươi Sữa tươi chứa Hình vi trùng sức khỏe chưa tiệt trùng qua 6hại Sữacho tươi thiết bị xử lý nhiệt Số lượng vi trùng sữa tươi phụ thuộc vào tình trạng sức khỏe gia súc, kỹ thuật lấy sữa, vệ sinh lúc lấy sữa Chính sữa tươi không sử dụng trực tiếp sau thu hoạch mà phải qua công đoạn trùng tiệt trùng 2.2.2 Sữa bột Sữa bột sản phẩm sản xuất từ sữa dạng bột khô, thực cách làm bốc sữa để khơ sau nghiền nhỏ, tán nhỏ thành bột Một mục đích sữa dạng bột khô phục vụ cho việc bảo quản, tích trữ, sử dụng Sữa bột có thời hạn sử dụng lâu hẳn so với sữa nước không cần phải làm lạnh, thân có độ ẩm thấp Một mục đích khác đểHình giảm2.khối lượng Sữa bột lớn việc vận tải qua tiết kiệm chi phí Sữa bột sản phẩm từ sữa bao gồm thành phẩm sữa khô nguyên chất, sữa khô chất béo, sữa khơ sản phẩm hỗn hợp sữa khô Nhiều sản phẩm sữa xuất phù hợp với tiêu chuẩn đặt Sữa bột sử dụng thông dụng loại thực phẩm đem lại nhiều lợi ích cho sức khỏe (dinh dưỡng) dùng công nghệ sinh học 2.3 Tổng quan xác định vitamin B1, B6 B12 phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Chương II: Tổng quan tài liệu 2.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) đời 1967-1968 dựa sở pháp triển cải tiến phương pháp sắc ký cột cổ điển Hiện phương pháp HPLC ngày pháp triển đại nhờ vào phát triển nhanh chống máy phân tích Nó áp dụng cho nhiều ngành kiểm nghiệm định lượng chất lượng nước giải khác, phân tích họp chất đa vịng,…., máy phân tích HPLC cơng cụ đắc lực phân tích thành phần có sản phẩm tiêu dùng cho phép tính định lượng phương pháp ngày mở rộng phổ biến 2.3.2 Nguyên tắc phương pháp HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phương pháp tách hỗn hợp chất lỏng dựa phân bố hai pha: pha di chuyển pha động (thường chất lỏng), pha tĩnh pha đứng yên ( thông thường chất rắn) pha động mang theo chất phân tích di chuyển qua pha tĩnh đứng yên Do lực hấp thụ giải hấp thụ khác hợp phần có mẫu phân tích với pha tĩnh pha động mà chúng di chuyển dọc theo pha tĩnh (cột sắc ký) tốc độ khác nên khỏi cột Nguyên tắc trình sắc ký cột: Pha tĩnh yếu tố quan trọng định chất trình sắc ký loại sắc ký: - Nếu pha tĩnh chất hấp phụ ta có sắc ký pha thuận pha đảo - Nếu pha tĩnh chất trao đổi ion ta có sắc ký trao đổi ion - Nếu pha tĩnh chất lỏng ta có sắc ký chiết - Nếu pha tĩnh gel ta có sắc ký gel Để rữa rải chất phân tích khỏi cột, ta cần có pha động Chương II: Tổng quan tài liệu 2.3.3 Các đại lượng đặc trưng trình sắc ký: 2.3.3.1 Thời gian lưu thể tích lưu Trong đó: gian ( thời Tm: thời lưu chết gian lưu dung môi) gian Tr: thời lưu chất A Tr= thời Hình 8gian Sắc ký đồ pha tĩnh phương pháp HPLC gian pha động + thời Trong điều kiện sắc ký chọn, thời gian lưu chất định chất khác có thời gian lưu khác tùy vào chất, cấu tạo, tính chất chất Vì thời gian lưu đại lượng định tính chất Khi pha động qua cột với tốc độ không đổi thời gian lưu thay thể tích lưu Thể tích lưu thể tích pha động thu sau cột khoảng thời gian tương ứng với thời gian lưu 2.3.3.2 Hệ số phân bố Trong q trình sắc kí ln có phân bố chất tan pha động pha tĩnh Sự phân bố đặc trưng cân phân bố với hệ số phân bố tính theo cơng thức sau: Trong đó: CS,CM nồng độ chất phân tích tương ứng pha tĩnh pha động thời điểm cân 2.3.3.3 Số đĩa lí thuyết chiều cao đĩa lí thuyết Số đĩa lí thuyết N tính cơng thức: Trong đó:W chiều rộng pic pic đáy Chiều cao đĩa lí thuyết tính cơng thức: Trong đó: L chiều cao cột sắc kí Với điều kiện sắc kí định, chiều cao đĩa lí thuyết (H) số đĩa lí thuyết (N) định chất phân tích 2.3.3.4 Độ phân giải (RS) Chương II: Tổng quan tài liệu Độ phân giải đại lượng biểu thị độ tách chất khỏi điều sắc ký cho Độ phân giải hai pic cạnh tranh tính theo cơng thức sau: Trong đó: tRA,tRB: thời gian lưu tương ứng chất A, chất B WA,WB: chiều rộng pic đáy pic chất A, chất B 2.3.3.5 Phương trình Van-Deemter Phương trình Van-Deemter mơ tả ảnh hưởng tốc độ dịng pha động thơng số động học khác đến hiệu lục cột sắc kí: Trong đó: H: chiều cao đĩa lí thuyết u: tốc độ dịng pha A,B,C: hệ số thay đổi phụ thuộc vào cột sắc ký Chương II: Tổng quan tài liệu 2.3.4 Sơ đồ máy HPLC f) d) c) e) b) a) Hình Sơ đồ máy sắc ký lỏng hiệu cao Trong đó: a) Bình dung mơi b) Bơm- phận phân phối dung môi c) Bộ tiêm mẫu d) Cột e) Đầu dò- Detector f) Thiết bị thu thập liệu g) Bình thu hồi g) Chương III: Nội dung phương pháp nghiên cứu Chương III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung nghiên cứu Các nội dung nghiên cứu gồm: - Chọn detector Chọn pha tĩnh Lựa chọn dung môi Chọn pha động Khảo sát bước song hấp thụ quang vitamin B1, B6 B12 Khảo sát tỉ lệ thành phần pha động Khảo sát lựa chọn tốc độ dịng chảy Chuẩn bị dung dịch phân tích Khảo sát độ tuyến tính chất phân tích 3.2 Phương pháp nghiên cứu Lựa chọn điều kiện sắc ký 3.2.1 Chọn detector Các vitamin B1, B6 B12 hấp thụ ánh sang mạnh vùng tử ngoại (UV) Mặt khác detector PDA cho pháp quang trắc vitamin bước sóng vùng từ 200 nm đến 400 nm phép đo Đây điểm ưu việt detector PDA Căn vào điều chọn detector PDA 3.2.2 Chọn pha tĩnh Cột chứa pha tĩnh côi trái tim hệ thống HPLC Cột pha tĩnh thông thường làm thép khơng rỉ, chiều dài cột khoảng 10-30cm, đường kính 3-10m Chất nhồi cột có ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng phân tích mẫu Pha tĩnh thơng dụng silicagan có gắn gốc ankyl mạch dài, khơng phân cực, thơng dụng –C18H37 Trong điều kiện phịng thí nghiệm, chúng tơi lựa chọn cột C18 với đường kính hạt pha tĩnh 5m, chiều dài cột tách 250mm, đường kính cột 6.1mm để tìm điều kiện khác tối ưu hóa việc tách để xác định vitamin B1, B6 B12 3.2.3 Lựa chọn dung môi Các vitamin B1, B6 B12 chất hịa tan tốt mơi trường nước axit axetic nhiên khó tan etanol 96% methanol, khơng tan este,benzene hay clorofom Vitamin B1 bền môi trường axit, cịn mơi trường kiềm dễ bị phân hủy đun nóng Vitamin B6 bền đun sôi axit hay kiềm, không bền môi trường có tính oxy hóa Vitamin B12 bền bóng tối nhiệt độ thường, bền với nhiệt vitamin B12 dễ bị phân hủy ánh sáng Khi tiếp xúc với kim loại nặng dễ bị hoạt tính không bền môi trường kiềm (pH>7) Chương III: Nội dung phương pháp nghiên cứu Căn vào tính chất vitamin B1, B6, B12 tài liệu tham khảo Chúng chọn dung dịch đệm photphat (pH=3) làm dung mơi cho q trình nghiêm cứu 3.2.4 Chọn pha động Trong trình sắc ký, pha động lựa chọn tùy thuộc vào tính chất mẫu phân tích nồng độ Pha động dung mơi đơn hay hỗn hợp nhiều dung mơi trộn theo tỉ lệ thích hợp Khi chọn cần ý đến yêu cầu: Trơ khơng tác dụng hóa học với pha tĩnh Bền ổn định q trình chạy sắc ký Hịa tan tốt hỗn hợp chất phân tích Phù hợp với detector chọn Pha động yếu tố linh động, ta dễ dang thay đổi thu kết tách tốt cách thay đổi tỉ lệ thành phần loại dung môi hữu Pha động hệ dung mơi khơng phân cực hệ dung môi phân cực Người ta thường dùng hệ CH3OH-H2O hệ exetonitril- dung dịch đệm photphat Hệ sắc ký dùng để tách nhiều hỗn hợp từ phân cực đến không phân cực, phạm vi sử dụng phong phú Phương pháp sắc ký lỏng pha ngược HPLC sử dụng thành phần pha động theo gồm kênh A đệm photphat kênh B axetonitril sử dụng hiệu việc phân tích vitamin nhóm B sữa bột mẫu thực phẩm Do đó, dung môi lựa chọn pha động gồm kênh A đệm photphat kênh B axetonitril để xác định B1,B6,B12 mẫu sữa 3.2.5 Khảo sát bước sóng hấp thụ quang vitamin B1,B6 B12 Chúng tơi chuẩn bị dung dịch chuẩn vitamin B1 có nồng độ (ppm), dung dịch chuẩn B6 có nồng độ (ppm) dung dich chuẩn B12 có nồng độ 0,8 (ppm) sử dụng chế độ chạy sắc ký với thành phần pha động không đổi Do vitamin nhóm B hấp thụ ánh sáng mạnh vùng tử ngoại (UV) Chúng chọn detector PDA khảo sát vitamin bước sóng vùng từ 200nm-400nm Các điều kiện khác cố định không đổi gồm kênh A dung đệm photphat, kênh B axetonitril với tỉ lệ 80:20 thể tích, tốc độ dịng 1ml/phút để tiến hành quét phổ hấp thụ dung dịch chứa vitamin riêng rẽ B1,B6 B12 từu bước sóng 200nm đến bước sóng 400nm để tìm bước sóng tối ưu cho việc phân tách vitamin 3.2.6 Khảo sát lựa chọn tỉ lệ pha động Chúng chuẩn bị dung dịch chuẩn vitamin B1 có nồng độ (ppm), dung dịch chuẩn B6 có nồng độ (ppm) dung dich chuẩn B12 có nồng độ 0,8 (ppm) sử dụng chế độ chạy sắc ký với thành phần pha động khơng đổi Khi tăng tỉ lệ ACN thời gian lưu trữ chất cột tăng, dẫn đến vitamin tách muộn gây doãn chân pic, ngược lại giảm tỷ lệ ACN thời gian lưu giữ chất phân tích cột sắc ký giảm, vitamin tách sớm, chiều cao tăng nhiên khơng tách hồn tồn vitamin Hệ dung mơi pha động với tỷ lệ ACN dung dịch đệm photphat theo tỷ lệ 30:70; 20:80 10:90 thể tích Các điều kiện Chương III: Nội dung phương pháp nghiên cứu khác cố định khơng đổi bao gồm tốc độ dịng 1mL/phút, detector PDA với bước sóng chọn lọc vitamin: B1 (246 nm); B6 (291 nm); B12 (316 nm) Tiến hành khảo sát để tìm tỉ lệ tối ưu ACN dung dịch đệm photphat 3.2.7 Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng chảy Chúng tơi chuẩn bị dung dịch chuẩn vitamin B1 có nồng độ (ppm), dung dịch chuẩn B6 có nồng độ (ppm) dung dich chuẩn B12 có nồng độ 0,8 (ppm) sử dụng chế độ chạy sắc ký với thành phần pha động không đổi Tiến hành khảo sát pha động tốc độ 0,8 mL/phút; 1mL/phút 1,2 mL/phút Các điều kiện khác cố định không đổi bao gồm kênh A dung dịch đệm photphat, kênh B axetonitril với tỉ lệ 80:20 thể tích, dectector PDA với bước sóng chọn lọc vitamin: B1 (246nm); B6 (291 nm); B12 (316 nm) Tiến hành khảo sát để tìm tốc độ dịng chảy tối ưu cho phép phân tích: Điều kiện sắc ký Máy HPLC Detector Cột tách Dung môi Pha động Bước sóng hấp thụ quang Tỉ lệ pha động Tốc độ dòng Cụ thể Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu cao HPLC PDA Cột C18 với đường kính hạt pha tĩnh 5m, chiều dài cột tách 250mm, đường kính cột 6,1mm Dung dịch đệm photphat (pH=3) Kênh A: dung dịch đệm photphat (pH=3) Kênh B: dung dịch axetonitril Khảo sát vitamin bước sóng vùng từ 200nm đến 400nm Khảo sát hệ dung môi pha động với tỷ lệ ACN dung dịch đệm photphat theo tỉ lệ 30:70; 20:80 10:90 Khảo sát pha động tốc độ 0,8 mL/phút; 1mL/phút 1,2 mL/phút Bảng Bảng điều kiện sắc ký Chương III: Nội dung phương pháp nghiên cứu 3.3 Sơ đồ nghiên cứu phương pháp phân tích Khảo sát điều kiện sắc ký Khảo sát khoảng tuyến tính nồng độ vitamin B1, B6, B12 Khảo sát khoảng tuyến tính nồng độ vitamin B1, B6, B12 mẫu thực Kiểm tra tính thích hợp hệ thống Xác định nồng độ vitamin B1, B6, B12 phương pháp đương chuẩn Xác định nồng độ vitamin B1, B6, B12 phương pháp đương chuẩn Kết luận Hình Sơ đồ phương pháp nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Đồ án có tham khảo tài liệu từ trang: https://vi.wikipedia.org/ Tham khảo phương pháp HPLC từ trang: https://vstytw2.com.vn/sac-ky-longhieu-nang-cao-hplc-74-25 ... án ? ?Tìm hiểu phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao xác định đông thời vitamin B1, B6, B12 sữa bột sữa tươi? ?? 1.2 Mục đích đề tài Mục đích đề tài nghiên cứu quy trình sắc ký lỏng hiệu cao để xác định. .. hiểu phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao, bước thực phương pháp tính tốn Cuối đề xuất quy trình thực để xác định đồng thời vitamin B1, B6, B12 sữa bột sữa tươi phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Chương... học 2.3 Tổng quan xác định vitamin B1, B6 B12 phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Chương II: Tổng quan tài liệu 2.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) đời 1967-1968