Đang tải... (xem toàn văn)
Khóa luận tốt nghiệp GVHD Th s Đỗ Thị Thanh Huyền VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề Tài NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ ENZYME, NHIỆT Độ VÀ THỜI GIAN PHẢN ỦNG ĐẾN.
GVHD: Th.s Đỗ Thị Thanh Huyền Khóa luận tốt nghiệp VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề Tài NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ ENZYME, NHIỆT Độ VÀ THỜI GIAN PHẢN ỦNG ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN TIU’ vien VieniJaT nợưMơ rra Nọi PROTEIN TÙ’ LÁ CHÙM NGÂY Giáo viên huóug dẫn : Th.s ĐỎ THỊ THANH HUYÊN Sinh viên thực : ĐỎ THỊ THOM Lóp : 13-02 Hà Nội - 2017 Đồ Thị Thơm - 1302 LỜI CẢM ƠN Đe luận văn đạl kết quà tốt đẹp, em nhận hỗ trợ, giúp đờ cùa nhiều quan, tổ chức, cá nhân Với tình cảm sâu sắc, chân thành, cho phép bày tò lòng biết ơn sâu sắc đến tất cá nhân quan tạo điều kiện giúp đỡ trình học tập nghiên cứu đề tài Lời em xin gửi tới thầy cô giáo Khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mớ Hà Nội lời chúc sức khỏe lời cảm ơn sâu sắc Với quan tâm, dạy dỗ, chì bào tận tình chu đáo thầy cơ, giúp cho em có kiến thức bồ ích suốt năm tháng học vừa qua, giúp đờ em nhiều việuc nắm bat kiến thức động viên lớn mặt tinh thần Đặc biệt em xin gửi lời cám ơn chân thành tới thầy giáo Thạc sỳ Đỗ Thị Thanh Huyền, người quan tâm giúp đỡ, hướng dẫn em tận tình trình thực đề tài, giúp em vượt qau khó khăn hoàn thành tốt luận văn TnửViẹn ViệnDạiĩiọcMơHà NỘI thời gian qua Em xin tó lịng biết ơn đến anh chị thuộc môn Enzym Protein Viện ông Nghiệp Thực Phẩm, người giúp đỡ tạo điều kiện giúp đỡ em suốt qáu trình nghiên cứu Cuối cùng, em xin gửi lời càm ơn tới gia đình, bạn bè bên động viên, giúp đỡ suốt thời gian học tập thực khoá luận Em xin chân thành câm ơn! Hà Nội, ngày 13 tháng năm 2017 Sinh viên Đỗ Thị Thơm Đồ Thị Thơm - 1302 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: Th.s Đồ Thị Thanh Huyền MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC ĐỊ THỊ MỞ ĐÀU PHẦN I: TÓNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu Chùm ngây 1.1 1.1.1 1.1.2 Giới thiệu chung Đặc điêm sinh học Chùm ngây Thành phần hóa học dinh dường Chùm ngây 1.2 1.2.1 1.2.2 Thành phần hóa học Thành phần dinh dưỡng Cộng duns 1.3 1.3.1 1.3.2 Mw '' Công dụng thực phàm ' 11 Công dụng y dược 12 1.4 Những nghiên cứu khoa học Chùm ngây 13 1.5 Sản phấm từ Chùm ngây 15 1.6 Enzym thuỷ phân protein từ thực vật 17 1.6.1 Giới thiệu chung 17 1.6.2 Phân loại protease 17 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20 2.1 Nguyên vật liệu 20 2.2.1 Nguyên liệu 20 2.2.2 Hoá chất 21 2.2.3 Dụng cụ thiết bị .21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Phương pháp thu nhận protein thô 22 Đồ Thị Thơm - 1302 2.2.3 Phương pháp làm giàu protein 22 2.3.4 Phương pháp thuỳ phân protein 23 2.3 Phương pháp phân tích 24 2.3.2 Xách định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford 24 2.2.3 Phương pháp xác định độ thuỳ phân protein 26 PHÁN 3: KÉT ỌUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 l.Xác định hàm lượng protein nguyên liệu Chùm ngây 29 3.2 Nghiên cứu lựa chọn chúng loại enzyme thích hợp cho q trình thủy phân protein từ Chùm ngây 29 3.3 Nghiên cứu tỳ lệ enzyme sử dụng cho trình thuỷ phân protein.31 3.4 Nghiên cứu điều kiện thủy phân thích hợp 32 3.4.1 Anh hướng cùa PH tới trình thủy phânp protein 32 3.4.2 Anh hướng nhiệt độ đến trình thuỳ phân 34 3.4.3 Anh hưởng thời gian tới trình thuỷ phân protein 35 PHÀN 4: KẾT LUẬN 41 TÀI LIỆU THAltiWẰíỔ1 Y.Ìể.1l.Đa4_hOC_M J;Ị a_N 0ị 42 Đồ Thị Thơm - 1302 GVHD: Th.s Đồ Thị Thanh Huyền Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điếm sinh thái cùa Chùm ngây Báng 1.2 Hàm lượng dinh dưỡng có 100g tươi 10()g khô Bàng 1.3 So sánh hàm lượng dinh dưỡng có 100g tươi khô Bảng 2.1 Các enzyme sử dụng đặc điểm Bảng 2.2 Các thiết bị dùng đề tài Báng 2.4 Xây dựng đường chuấn hàm lượng protein theo phương pháp Bradford Bảng 3.1 Hàm lượng protein nguồn nguyên lịêu Chùm ngây Bảng 3.2 Ánh hưởng chủng loại enzyme đến độ thuỷ phân protein Bảng 3.3 Tỷ lệ enzyme sử dụng cho trình thuỳ phân protein Bảng 3.4 Ánh hưởng pH đến trình thuỳ phân protein Bảng 3.5 Anh hưởng nhiệt độ đến trình thuỷ phân protein Bảng 3.6 Ánh hướng thời gian tới trình thuỳ phân enzym endoprotease Báng 3.7 Ảnh hướng cùa thời gian tới trình thuỷ phân enzyme exoprotease Đồ Thị Thơm - 1302 GVHD: Th.s Đồ Thị Thanh Huyền Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Một số hình ảnh Chùm ngây Hình 1.2 So sánh chất dinh dưỡng 100g Chùm ngây tươi khô với loại thực phấm khác Hình 1.3 Một số sán phẩm từ Chùm ngây giới Thư viện Viện Đại học Mờ Hà Nội Đồ Thị Thơm - 1302 GVHD: Th.s Đồ Thị Thanh Huyền Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC ĐỊ THỊ Hình 3.1 Đồ thị hình biếu diễn ánh hưởng tỷ lệ enzyme sử dụng đến trình thuỳ phân protein Hình 3.2 Đồ thị hình biểu diễn ánh hưởng pH tới trình thuý phân protein Hình 3.3 Đồ thị hình biếu diễn ành hưởng nhiệt độ tới trình thuỷ phân protein Hình 3.3 Đồ thị hình biểu diễn ánh hưởng cùa thời gian đến trình thuỹ phân protein enzym endoprotease Hình 3.4 Đồ thị hình biếu diễn ánh hưởng thời gian đến trình thuỹ phân protein enzym exoprotease Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Đồ Thị Thơm - 1302 MỎ ĐÀU Cuộc sống xã hội ngày phát triển người trọng việc bảo vệ sức khởe gia đình Sức khỏe quan tâm bảo vệ từ bữa ăn ngày Các loại rau ăn phái rau có tác dụng sức khóe người Trong đó, khơng thổ không nhắc đến Chùm ngây Trên giới, Chùm ngây sãn xuất sứ dụng từ lâu Cây biết đến sứ dụng từ hàng ngàn năm nước có văn minh cồ Hy Lạp, Ý, Àn Độ Được xem loài hữu dụng bậc giới toàn phần chùm ngây dùng làm thức ăn phục vụ cho mục đích khác nhau, nên chùm ngây khuyến khích trồng nhiều quốc gia giới, đặc biệt nước nghèo Rau chùm ngây nguồn thức ăn tốt cho trẻ sơ sinh bà mẹ vừa sinh con[3j Chùm ngây lịại cậy có giá trị dinh dưỡng cao, có tác dụng việc chống suy dinh dưỡng cho khu vực đói nghèo[ 16][17|f 18II 19| Lá Chùm ngây dùng làm rau ăn hàng ngày làm trà uống, rễ dùng làm trị nóng sốt, đau bao tử công nghệ sản xuất Chùm ngây nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu nhằm nâng cao giá trị dinh dường cũa đa dạng hóa sản phẩm Tại Việt Nam, năm gần Chùm ngây biết đến nghiên cứu rộng rãi Cây trồng rãi rác nơi, từ khu vực phía Bắc trồng Chương Mỹ( Hà Nội), Ninh Bình, Bắc Ninh đến khu vực phía Nam Đà Nằng, Nha Trang Với diện tích hàng chục hecta, suất trung bình năm thu từ 40-50tấn/ha Lá Chùm ngây có hàm lượng protein cao từ5-7g/100g tươi, hàm lượng protein gấp lần có sữa giàu axit amin Nó có chứa 18 axit Đồ Thị Thơm - 1302 amin yếu, có axil amin thiết yếu Các axit amin có vai trị quan trọng q trình xây dựng protein enzyme, hồ trợ hệ thống miễn dịch, cung cấp thành phần sử dụng để tạo thành phần sinh hóa thiết yếu the Nên lồi chứa protein “hoàn hão” giới thực vật Nhưng thực te protein Chùm ngây lại khó tiêu hóa, ta can chuyến hóa protein Chùm ngây dạng axit amin để thể dễ hấp thụ đàm bão cho việc nâng cao giá trị dinh dưỡng vốn có Từ cơng dụng Chùm ngây nêu tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng cua nồng độ enzyme, nhiệt độ thòi gian phản ứng đến trình thủy phân protein từ Chùm ngây” Mục tiêu đề tàẼNghiên cứu ánh hường nồng độ enzym, nhiệt độ thời gian phàn ứng đến trình thủy phân protein từ Chùm ngây Nội dung nghiênĩ&iỉỉViẹn Vicn Đại học Mơ Ha Nọi - Nghiên cứu lựa chọn chùng loại enzyme thích hợp cho q trình thúy phân protein từ chùm ngây - Nghiên cứu tý lệ enzyme sứ dụng cho trình thuỹ phân protein từ Chùm ngây - Nghiên cứu điều kiện thúy phân thích hợp cho trình thuỷ phân protein từ Chùm ngây Đồ Thị Thơm - 1302 1.1 PHẦN I: TÔNG QUAN TÀI LIỆU Giói thiệu Chùm ngây 1.1.1 Giới thiệu chung Cây Chùm ngây khoa học VàMoringa Oleifera Lamhay M.Pterygosperma thuộc họ Chùm ngây (Moringgaceae) Cây có nguồn gốc tiếu lục Ãn Độ trồng rộng rãi khu vực Châu Phi.Chùm ngây phát triển mạnh mẽ khí hậu nhiệt đới cận nhiệt đới, phát triển vùng đất khơ nóng có thè tồn đất màu mỡ, bị ănh hướng bới hạn hán [9], Trong năm qua Chùm ngây trớ thành nguồn dinh dường kinh tế cho nước phát triến Chùm ngây coi hữu ích giới, hầu hết thành phần sử dụng cho thực phấm, thuốc men mục đích cơng nghiệp Trong Chùm ngây chứa nhiều hàm'lượng protein, vitamin, khống chất Vì vật sử dụng rộng rãi dự án chống suy dinh dưỡng cho khu vực đói nghèo Vị trí phân loại Giới thực vật : Plantae Nghành Ngọc Lan : Magnoliophyta Lớp Ngọc Lan : Magnolipsida Bộ Cài : Brassicales Họ Chùm ngây : Moringaceae Chi : Moringa Loài : Moringa oleifera Lam Đồ Thị Thơm - 1302 PHÁN 3: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định hàm lưọng protein nguyên liệu Chùm ngây Mầu chùm ngây ngây sau thu mua, tiến hành tách riêng cành, đem rừa để Lấy lượng đem phơi khơ, sau đem bào quản để sử dụng Mầu tươi sử dụng trực tiếp Hai mẫu tươi khô đem nghiền nhỏ bồ sung nước cất theo ti lệ 1:10 Sau đem phân tích hàm lượng protein Kết thu bàng 3.1 Bảng 3.1 Hàm lưọìig protein nguyên liệu Chùm ngây Nguồn nguyên liệu Hàm lượng protein (%) Lá tươi 19,53 Lá khô 14,02 Từ báng 3.1 thây: Đại học Mờ Hà Nội Hàm lượng protein thu từ Chùm ngây tươi cao so với hàm lượng mầu protein khô Do vậy, lựa chọn sử dụng Chùm ngây tươi để tiến hành thí nghiêm 3.2 Nghiên cún lựa chọn chủng loại enzyme thích họp cho q trình thủy phân protein từ Chùm ngây Đế nghiên cứu lựa chọn chủng loại enzyme thích hợp cho q trình thuỷ phân protein Chùm ngây, chúng tơi tiến hành lựa chọn enzyme thích hợp sử dụng cho trình thuỷ phân Đồ Thị Thơm - 1302 29 Mầu thí nghiệm thực hiện: Lấy 10g mầu bố sung nước theo tỉ lệ 1:5 , sau bổ sung enzym Enzyme Alcalase 2.4 FG, Alcalase, enzyme protein.FlavourzymelOOOu/g, Enzyme Papain Flavouzyme (novozyme) , Flavourzyme 500u/g với nồng độ 1% ( so với khối lượng mẫu) Đem phàn ứng nhiệt độ thời gian thích hợp Ket thúc q trình phản ứng xác định mức độ thuỷ phân thông qua giá trị DH bang phương pháp đo quang bước sóng 340nm Ket quâ thu trình bày bàng 3.1 Bảng 3.2 Ánh hưỏng chủng loại enzyme đến độ thủy phân protein (%DH) Enzyme Exoprotease Enzyme Endoprotease TI Flavourzyme Flavourzyme (novozyme) 500u/g viện Viện Đạ ị học Mở Hà N Alcalase 10,21 Flavourzyme Declared activity lOOOu/g 3,16 15.06 Alcalase 2.4 FG 9,23 8,1 27,5 Enzyme protein 14,07 13,96 9,23 Papain 26.07 12,5 10,76 Qua kết bàng 3.1 thấy rằng: Mức độ thuỷ phân protein Chùm ngây đạt giá trị cao enzyme Alcalase 2.4 FG Flavourzyme 27,5%.Với hệ enzyme hàm lượng protein thu đạt giá trị cao so với hệ enzyme lại Hệ enzyme Papain Flavourzyme (novozyme) có mức độ thuỳ phân 26,07% cao đứng thứ Đồ Thị Thơm - 1302 30 Do vậy, đế tiến hành thí nghiệm lựa chọn kết hợp enzym sử dụng cho trình thuỳ phân protein enzyme Alcalase 2.4 FG vcriFIavourzyme Papain với Flavouryme (novozyme) đế thu hàm lượng protein tốt 3.3 Nghiên cứu tỷ lệ enzyme sử dụng cho trình thuỷ phân protein Sau lựa chọn đuợc enzyme thích hợp Chúng tơi tiến hành nghiên cứu tỷ lệ enzyme sử dụng nồng độ: 1%; 1,5%; 2%; 2,5% Mầu thí nghiệm thực hiện: lay 10g mẫu, bổ xung nước với tì lệ 1:5, chình pH = Tăng giữ nhiệt 50°C Bô xung nồng độ enzymeendoprotease mẫu Alcalase 2.4 FG mẫu Papain với nồng độ 1,5% Giữ nhiệt vịngóOphút Sau hạ pH 6, bố xung enzyme exoprotease mầu Flavounzyme 1000u/g mẫu Flavounzyme (novozyne) Giữ nhiệt 50°C/6giờ Ket thúc q trình nâng nhiệt ■Hiựện V iẹiWại lìợệ MaliaiNỤi s độ lên 80-100°C để bất hoạt enzyme Lọc thu dịch đem phân tích xác định giá trị DH Ket quà thu trình bày bàng 3.3 Bảng 3.3 Tỷ lệ enzyme sử dụng cho trình thuỷ phân protein! %DH) DH (%) Tỷ lệ enzyme sử Enzyme Alcalase 2.4 Papain vói dụng FG với Flavourzyme Flavourzyme 1000u/g (novozyne) 1% 27,52 26,20 1,5% 37,73 28,73 2% 29,50 28,62 2,5% 28,85 21,23 Đồ Thị Thơm - 1302 31 35 30 25 g 20 ẫ IS 10 a) Enzyme Alcalase 2.4 FG Flavounzyme lOOOu/g b) Enzyme Papain Flavourzyme (novozyne) Hình 3.1 Đồ thị hình biểu diễn ảnh hưởng tý lệ enzyme sử dụng đến trình thuý phân protein Quađồ thị hình 3.1 chúng tơi thấy: Thư viện Viện Đại học Mờ Hà Nội Ớ nồng độ 3.5% mức độ thiuỷ phân protein mẫu tương đối cao là: 37,73% 28,73% Ở nồng độ 1%, 2% 2,5% mức độ thuỷ phân cùa protein cao Tuy nhiên so sánh với nong độ 1,5% khơng có khác biệt nhiều Do vậy, sử dụng kết bố xung nồng độ enzyme mẫu 1,5% cho thí nghiệm 3.4 Nghiên cứu điều kiện thủy phân thích họp 3.4.1 Ảnh hưởng PH tới trình thủy phânp protein Mầu thí nghiệm thực hiện: lay 10g mẫu, bồ xung nước (tỷ lệ 1:5), chinh pH = Tăng giữ nhiệt 50°C Bố xung nồng độ enzyme endoprotease mầu mẫu với tý lệ 1,5% vịng 60phút Sau đo giá trị pH 5; 5,5; 6; 6,5 Bố xung enzyme exoprotease mầu mẫu với tỷ lệ 1,5% Giữ nhiệt 50°C/6giờ Ket thúc trình nâng nhiệt độ Đồ Thị Thơm - 1302 32 lên 80-100°C đế bất hoạt enzym Lọc thu dịch đem phân tích xác định giá trị DH Kết q thí nghiệm trình bày bàng 3.4: Bảng 3.4 Ánh hưỏng pH tói q trình thuỷ phân (%DH) DH (%) Enzyme Alcalase 2.4 FG Enzyme Papain vói pH vói Flavourzyme 1000u/g Flavourzyme (novozyne) 27,52 27,30 5,5 28,62 27,64 39,64 29,83 6,5 30,71 26,75 a) Enzyme Alcalase 2.4 FG b) Enzyme Papain Flavourzyme Flavounzyme lOOOu/g (novozyne) Hình 3.2 Đồ thị hình biếu diễn ảnh huỏng pH tói q trình thuỷ phân protein Qua đồ thị hình 3.2 chúng tơi thấy: pH có ảnh hưởng định tới trình thuý phân protein Tại pH = 6, mức độ thuỹ phân mẫu đạt giá trị cao 39,64% Đồ Thị Thơm - 1302 33 29,83% Tại pH = 2,5 mức độ thuỹ phân cùa protein tương đối cao nhiên so sánh với giá trị pH = khơng có chênh lệch nhiều Do vậy, với giá trị pH =6 thích hợp đề sử dụng cho qúa trình thuỷ phân protein 3.4.2 Anh hưởng nhiệt độ đến trình thuỷphăn Mầu thí nghiệm thực hiện: lấy 10g mẫu, bồéung nước (tỷ lệ 1:5), chình pH = Tăng giữ nhiệt 50°C Bố sung nồng độ enzyme endoprotease 1,5% vòng 60phút Hạ pH Sau bổ xung enzyme exoprotease với tý lệ 3,5% Giữ nhiệt mức 40°C , 50°C, 55 °C , 60 °C 6giờ Kết thúc trình nâng nhiệt độ lên 80-100°C để bất hoạt enzyme Lọc thu dịch đem phân tích xác định mức độ thuý phân Ket quâ thí nghiệm trình bày bảng 3.5: Bảng 3.5 Ảnh hng nhiệt độ tói q trình thuỷ phân(%DH) DH (%) Enzyme Alcalase 2.4 FG vói Enzyme Papain vol Flavourzyme 1000u/g Flavourzyme (novozyme) 50 26,2 27,51 Nhiệt độ(°C) 55 27,41 26,24 60 39,53 28,51 65 37.44 28,15 Đồ Thị Thơm - 1302 34 Flavounzyme lOOOu/g (novozyne) Hình 3.3 Đồ thị hình biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến qúa trình thuỷ phân protein Qua đồ thị hình 3.3 chúng tơi thấy: Ớ nhiệt độ 60°C mức độ thuý phân protein đạt giá trị cao cùa mẫu là: 39,53% 28,51% Ở nhiệt độ 65 °C mức độ thuỷ phân protein cùa cá mầu tương đối cao 37,44 28,15% Nếu so sánh giá trị nhiệt độ mức độ thuý phân protein không khác biệt nhiều Tuy nhiên nhiệt độ 60°C mức độ thuỷ phân protein đạt giá trị cao Do vậy, 60°C nhiệt độ thích họp đế q trình thuỷ phân protein đạt hiệu cà mẫu thí nghiệm 3.4.3 Anh hưởng thời gian tới trình thuỷphân protein Trong khối đề tài cho phép, sử dụng kết hợp enzym Alcalase với Flanovourzyme đề nghiên cứu ánh hường thời gian tới trình thuỳ phân 3.4.3.1 Anh hưởng thời gian đến trình thuỷ phân enzytn endprotease Đồ Thị Thơm - 1302 35 Mầu thí nghiệm thực hiện: lấy 10g mầu, bô xung nước (tỳ lệ 1:5), chinh pH = Tăng giữ nhiệt 60°C Đồng thời bồ xung nồng độ enzyme Alcalase 2.4 FG 1,5% Giữ nhiệt khoảng thời gian 30, 60, 90, 120, 150 180 phút Hạ pH sau bồ xung enzyme Flavourzyme 1000u/g với tỳ lệ 1,5% Giữ nhiệt 50°C/5h Kết thúc trình nâng nhiệt độ lên 80-100°C đề bất hoạt enzym Ket thúc trình lọc thu dịch đem phân tích xác định giá trị DH Ket thí nghiệm trình bày bàng 3.6 Bảng 3.6.Ấnh hưỏng thòi gian đến q trình thuỷ phân đỗi vói enzym endprotease (DH%) Thòi gian DH (%) Enzyme Alcalase 2.4 FG (phút) 30 60 Tl-11 6,05 V1C11 V lộn Dại học J9 Q31 hì Nọi 90 27,19 120 33,36 150 30,08 180 27,29 200 27,96 Đồ Thị Thơm - 1302 36 Hình 3.4 Đồ thị hình biểu diễn ảnh hưởng thịi gian đến trình thuỷ phân enzym Alcalase 2.4 FG Qua đồ thị hình 3.4 chúng tơi thấy rằng: Mức độ thuỳ phân enzyme eqdoprotẹase