TIỂU LUẬN:VIRUS PRRS VÀ PROTEIN TÁI TỔ HỢP N ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN ppt

Được phát hiện ở Mỹ vào năm 1987 cho đến nay đã xuất hiện rộng rãi ở Châu Âu và các nước Châu Ávà có nguy cơ lây lan thành dịch.Đây là bệnh gây thiệt hại lớn về kinh tế, được xếp vào nhó

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

****0O0****

VIRUS PRRS VÀ PROTEIN TÁI TỔ HỢP N

ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN

Giáo viên hướng dẫn: Bộ môn : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI Sinh viên thực hiện:

MSSV: 06126081 Thành Phố Hồ Chí Minh

31/10/2009

I Đặt vấn đề

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở heo (Porcine Reproductive and

Respiratoty Syndrom ) là bệnh do virus Nidovirales, họ Arteviridae gây ra

Được phát hiện ở Mỹ vào năm 1987 cho đến nay đã xuất hiện rộng rãi ở Châu

Âu và các nước Châu Ávà có nguy cơ lây lan thành dịch.Đây là bệnh gây thiệt

hại lớn về kinh tế, được xếp vào nhóm B trong danh mục các bệnh của Tổ chức

sức khỏe động vật thế giới.PRRS đặc trưng bởi rối loạn hô hấp, xẩy thai ở heo

nái và gây tỉ lệ tử vong cao trên heo con, dẫn đến sự thiệt hại lớn về kinh tế

toàn cầu Trong vòng 20 năm kể từ khi xuất hiện, PRRS đã gây ra nhiều ảnh

hưởng nghiêm trọng lên nền chăn nuôi thế giới và an sinh xã hội Theo báo

cáo, PRRS chiếm 1/3 chi phí cho các bệnh xâm nhiễm trong nghành công

nghiệp chăn nuôi heo ở Mỹ, PRRS cũng gây thiệt hại kinh tế đáng kể ở Châu

Âu Gần đây biến chủng mới của PRRS virus ở Trung Quốc đã giết 400.000

trong 2.120.000 số heo bị xâm nhiễm trong vòng 4 tháng ở 10 tỉnh phía đông

TRung Quốc Tại Việt Nam, từ tháng 3 đến tháng 7 năm 2007, 44 ổ dịch đã

bùng phát trong hai dịch bệnh chính, lần đầu xảy ra ở các tỉnh phía bắc trong

thời gian từ tháng 3 đến tháng năm, lần thứ hai xảy ra ở các tỉnh phía nam trong

khoảng thời gian từ tháng 6 đến tháng 7 Khoảng 44000 con heo bị nhiễm,

trong đó hơn 4000 con bị chết Chính vì thế virus PPRS và bệnh do virus này

gây nên đang được quan tâm nghiên cứu nhằm tìm hiểu và nắm bắt cơ chế phát

sinh và gây bệnh của virus này để phát triển phương pháp phòng chống quản lý

bệnh, phát triển phương pháp chẩn đoán, phát hiện cũng như chế tạo, sản xuất

vaccine Trong bài báo cáo này em xin trình bày những kiến thức, hiểu biết về

virus PRRS và protein tái tổ hợp của Virus này, cùng với quy trình sản xuất

một số protein tái tổ hợp để ứng dụng trong chẩn đoán cũng như chế tạo

vaccine

II.Tổng quan

A Tổng quan về virus PRRS

1 Lịch sử phát hiện bệnh

Được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1987 tại Mỹ nhưng một số nghiên cứu

dịch tễ học cho rằng có thể bệnh đã lưu hành trước đó tại Canada Bệnh xuất

hiện ở Châu âu vào năm 1990 và hiện đã lưu hành ở nhiều nước thuộc châu lục

này Các kiểm tra huyết thanh học và virus học cho thấy PRRS cũng đã có mặt

tại Nhật Bản, Hàn Quốc, Philippines, Nam Mỹ, các nước vùng Ca-ri-bê

Trong những ngày gần đây, bệnh đã xuất hiện tại Trung Quốc và cũng đã xuất

hiện ở nhiều địa phương ở nước ta và gây thiệt hại kinh tế lớn trong nghành

chăn nuôi heo trên thế giới

2 Virus PRRS

2.1 Hình thái, cấu tạo phân tử virion của PRRSV:

Virus Nidovirales hay còn được gọi là virus PRRS (porcine reproductive

and Respiratory Syndrome virus) thuộc họ Arteviridae, giống Artevirus, đây là

virus ARN sợi đơn,dương có vỏ envelope bao bọc Phân tử virion PRRS có

dạng hình cầu hoặc trứng với đường kính trung bình là 58nm, trong đó có một

số ít phân tử có đường kính lớn hơn 70nm, phân tử virus có bề mặt ngoài trơn

với chỉ một vài điểm lồi ra, cách biệt với vỏ bọc một khoảng 2-3nm bên trong

phân tử virion là một vòng trống với đường kính trung bình khoảng 39nm

Phân tử virion PRRS bao gồm một vỏ bọc lipid có chứa vài envelope protein,

protein GP2, GP5, E và M bao quanh vòng nucleocapsid của PRRSV Protein

N bao bọc RNA genome của virus Protein vỏ chiếm nhiểu nhất là protein nhân

hay là Protein N, protein màng GP5 và M, còn GP2, GP4, E và GP3 là thành

phần phụ

2.2 Cấu trúc genome của PRRSV

Toàn bộ trình tự bộ gene của PRRSV đã được giải mã thành công và được

ghi nhận vào năm 1993, genome của virus dài khoảng 15kb và gồm tám khung

đọc mở ORF ORF 1a và 1b nằm ở đầu 5’ của genome, chiếm hơn hai phần ba

bộ gene và mã hóa cho RNA polymerase của virus được xem là protein chịu

trách nhiệm trong quá trình nhân lên của virus Sáu ORF nhỏ hơn là ORF 2-7,

nằm ở phía sau của ORF 1b, ở đầu 3’ của genome, mã hóa cho các protein cấu

trúc liên quan đến việc hình thành virion

Sản phẩm của các ORF 5,6,7 bao gồm các protein chính của virus Cho đến

nay người ta đã xác định được 3 protein cấu trúc chính của PRRS đó là: Protein

nhân (N-nucleocapsid) trọng lượng phân tử khoảng 15 kDa quy định bởi

ORF7, protein màng (M-membrane) trọng lượng khoảng 19 kDa quy định bởi

ORF6 và protein vỏ glycoprotein (E-envelope, GP5) trọng lượng khoảng 24-25

kDa quy định bởi ORF5 Những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng ORF 2,3 và

4 của Lelystad virus(LV), chủng Châu Âu của PRRS virus có lẽ mã hóa cho 3

membrane-associated glycoprotein khác là: 29-30 kD GP2, , 45-50 kD GP3,

31-35kD GP4(Van Nieuwstadt và cộng sự, 1996)

2.3 Sự đa dạng trong các chủng virus PRRS lưu hành trên thế giới

PRRS lưu hành trên thế giới với 2 dòng khác nhau: dòng Châu Mỹ (tiêu

biểu là chủng VR-2332) và dòng Châu Âu (tiêu biểu là Lelystad-LV) Những

chủng virus giữa hai dòng Châu Mỹ và Châu Âu khác nhau về đặc tính gây

bệnh và chúng có sự khác nhau về đặc điểm bộ gene và yếu tố kháng nguyên

Các chủng trong cùng một dòng thì có sự tương đồng về cấu trúc kháng

nguyên Tùy theo ORF mà sự tương đồng về gene của hai dòng virus PRRS

Châu Âu và Châu Mỹ dao động từ 52 đến 81% Việc giải mã trình tự

nucleotide của từng ORF là cơ sở dữ liệu phân tử quan trọng cho phép xác định

và sử dụng trình tự nào trong việc so sánh, chẩn đoán phân biệt các dòng

PRRSV cũng như xác định sự tiến hóa của chúng Ví dụ qua phân tích gene và

theo dõi sự thay đổi trình tự nucleotide của các dòng PRRSV người ta đã xác

định được rằng ở PRRSV dòng Châu Mỹ, các ORF 6 và 7 có tính ổn định rất

cao, chúng gần như không thay đổi trong suốt quá trình tiến hóa của dòng virus

này Tuy nhiên sự khác biệt giữa dòng virus PRRS Châu Âu và Châu Mỹ ở hai

khung đọc mở này là rất rõ, chẳng hạn sự tương đồng về trình tự acid amin của

ORF7 giữa hai dòng virus này chỉ vào khoảng 57-59% và của ORF6 là

70-81% Trong khi đó khung đọc mở ORF5 lại biến đổi nhiều giữa các chủng

trong cùng một dòng Châu Mỹ (giống nhau chỉ từ 88-97%) và chỉ tương đồng

với dòng Châu Âu khoảng từ 51-59% Các epitope trung hòa chính nằm trên

protein quy định bởi ORF5, tuy có sự biến động lớn trong vùng ORF5 giữa các

chủng virus PRRS nhưng các epitope trung hòa thường có sự bảo tồn tốt giữa

các dòng PRRS khác nhau Các epitope trung hòa khác nằm ở trên GP3, GP4

và protein M Sự tương đồng về trình tự acid amin quy định do các khung đọc

mở ORF 2, 3, và 4 giữa các dòng Châu Âu và Châu Mỹ chỉ ở mức độ từ 63, 58,

và 68% Sự khác biệt kiểu gene đương nhiên đưa đến sự khác biệt về kiểu hình

và như vậy có thể dựa vào đặc điêm gene để chẩn đoán dòng virus và ngược

lại Đây chính là cơ sở cho việc sử dụng kỹ thuật RT-PCR, RFLP… để chẩn

đoán PRRSV và phân biệt dòng PRRSV Châu Âu và Châu Mỹ.(Nguyễn Ngọc

Hải-công nghệ sinh học trong thú y, nhà xuất bản Nông Nghiệp, 2007)

Gần đây tại Trung Quốc đã xuất hiện dòng mới là biến chủng của dòng Châu

Mỹ, chủng này có độc lực cao hơn, nguyên nhân được đưa ra là do sự mất

30acid amin của protein Nsp2, gây bệnh không chỉ cho heo con mà còn cho cả

heo trưởng thành, gây ra tỉ lệ chết cao hơn (khoảng 20%), biến chủng này khó

chẩn đoán và hiện chưa có vaccine đặc hiệu, đây là thách thức mới cho các nhà

quản lý dịch bệnh cũng như cho các nhà sản xuất vaccine

3 Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở heo

PRRSV gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn Trước kia

PRRSV chủ yếu gây bệnh trên heo con và gây tỉ lệ tử vong khá thấp (Ở Châu

Âu là khoảng 1%) nhưng gần đây biến chủng mới tại Trung Quốc gây bệnh

trên cả heo con và heo trưởng thành , ngoài ra nó cũng gây tỉ lệ tử vong cao

hơn trong đàn heo bị nhiễm virus (khoảng 20%) Cũng như các virus khác,

virus PRRS cũng tạo điều kiện cho các vi khuẩn khác cư trú trong cơ thể như

liên cầu khuẩn tăng độc lực và gây bệnh

3.1 Triệu chứng lâm sàng

Căn cứ vào sự biểu hiện các triệu chứng của bệnh, người ta có thể chia thành hai loại triệu chứng: biểu hiện của các triệu chứng rối loạn sinh sản ở heo

nái và biểu hiện của các triệu chứng hô hấp Các triệu chứng sinh sản bao gồm:

heo nái bị sốt 39-40°, bỏ ăn,mệt mỏi, giảm tỉ lệ thụ thai và số con đẻ ra, sảy

thai (tỷ lệ này có thể đến 50% trong các đàn mới bị nhiễm virus), giảm tiết sữa

hoặc mất sữa hoàn toàn, thai gỗ, chết thai, đẻ non, chậm động dục hoặc không

động dục trở lại, rối loạn sinh sản có thể kéo dài đến vài tháng Biểu hiện các

triệu chứng hô hấp bao gồm: loạn hô hấp, lợn biểu hiện đau khi thở, hắt hơi,

tăng tần số hô hấp, thở khó, thở đứt quãng Khi bị nhiễm virus PRRS heo con

có tỉ lệ chết trước cai sữa cao, gầy yếu, bỏ ăn phù mắt,các nốt phồng rộp trên

da, ỉa chảy, đi không vững và run, đứng choãi chân Heo lớn có biểu hiện sốt

nhẹ, bỏ ăn Các triệu chứng khác nhẹ hơn Heo đực giống có các biểu hiện

giảm hưng phấn, giảm thể tích và chất lượng tinh dịch (hình thái, hoạt lực và

nồng độ tinh trùng)

3.2 Bệnh tích

Đối với heo nái, ngoài các triệu chứng sảy thai, tăng tỉ lệ thai chết, heo mắc bệnh thường không có các bệnh tích đặc thù

Đối với heo con thường mang các bệnh tích rõ hơn heo trưởng thành và heo nái, bao gồm: dịch thẩm thấu trong đường tiêu hóa và đường hô hấp đặc

biệt trong các phế quản, phù, thanh dịch trong xoang phúc mạc, xoang ngực,

xoang phế mạc và tung các mạc, sưng hạch bạch huyết, da nhiều vùng có màu

xanh tím

3.3 Phương thức truyền lây

Virus thường xâm nhiễm heo thông qua đường hô hấp và xâm nhập vào

tế bào đại thực bào của phế nang phổi rồi nhân lên ở đó, chúng kích thích tạo

đáp ứng interferon rất ít trước khi phát tán bên trong vật chủ Virus PRRS thích

hợp với một loại tế bào chuyên biệt với các đại thực bào đã biệt hóa như là đại

thực bào túi phổi heo (PAM) Tuy nhiên, cơ chế chính xác của tế bào đích và

thông tin của thụ thể chuyên biệt cho virus PRRS cho đến nay vẫn chưa được

hiểu tường tận Một số thụ thể tế bào tiếp nhận PRRS đã được báo cáo, trong

đó bao gồm thụ thể CD163 có nhiểu trên các đại thực bào như là PAM

Trong suốt quá trình xâm nhiễm, PRRS tạo hội chứng bệnh rối loạn sinh

sản và hô hấp Virus cũng có thể truyền qua tinh dịch và đường từ mẹ sang con

và có thể gây tử vong với tỉ lệ khá cao PRRSV có thể tồn tại trong cơ thể heo,

heo bị xâm nhiễm có thể phục hồi khỏi bệnh nhưng vẫn chứa virus trong thời

gian dài và lây bệnh cho các heo chưa bị nhiễm khác qua tiếp xúc trực tiếp

hoặc gián tiếp

Tiếp xúc giữa heo ốm và heo khỏe là đường truyền lây chính của bệnh

nên bệnh có thể lây giữa các cá thể trong một đàn hay từ đàn này sang đàn khác

(nếu heo bị bệnh được chuyển đàn, chuyển trại )

Heo mang virus có thể giải phóng virus trong thời gian 3-4 tháng gây

khó khăn cho công tác theo dõi và phát hiện và khống chế bệnh

Tinh dịch lợn mang trùng cũng có khả năng nhiễm virus vì vậy bệnh có

thể truyền qua đường sinh dục

Vi rút PRRS có trong dịch mũi, nước bọt, tinh dịch, phân và nước tiểu

của lợn bị bệnh, vi rút có thể phát tán theo gió, không khí (xa trên 3km), nước,

hoặc dụng cụ bảo hộ lao động, dụng cụ chăn nuôi và chim hoang truyền dẫn

Virus có mặt trong hạch lâm ba, phổi với số lượng lớn hơn nhiều trong

thịt và có khả năng giữa được độc lực trong điều kiện lạnh (khi giữa thức ăn)

Tuy vậy, khả năng truyền bệnh do cho ăn các phụ phẩm trong quá trình giết mổ

các gia súc bênh chưa được xác định Tuy nhiên, tốt hơn hết nên cách ly toàn

bộ đàn lợn có nguy cơ với mọi loại nguồn bệnh và không cho ăn các nội tạng từ

lợn nghi mắc bệnh

B Tổng quan về protein tái tổ hợp dựa trên ORF7 và ứng dụng trong chẩn đoán

1 Giới thiệu

Trong 3 protein cấu trúc chính của PRRSV thì người ta nhận thấy rằng

N protein quy định bởi ORF 7 hiện diện với số lượng lớn nhất trong phân tử

virion của PRRS và huyết của heo bị xâm nhiễm bởi PRRS phản ứng mạnh với

N protein, hầu hết kháng thể đơn dòng thu được từ chuột bị cho nhiễm PRRS

bán tinh sạch nhận biết đặc hiệu với N-protein Ngoài ra qua nghiên cứu ORF 7

mã hóa cho Protien N có cấu trúc ổn định và được bảo tồn cao Chính vì thế

nên N protein được xem là ứng viên sáng giá trong việc phát hiện chẩn đoán

heo bị nhiễm PRRS Hiện nay người ta đã phát triển các kit thương mại chẩn

đoán PRRS dựa trên ORF7 ELISA là phương pháp thông dụng và tin cậy

trong phát hiện chẩn đoán PRRS hiện nay, người ta thường dùng ELISA để

phát hiện kháng thể PRRS kháng protein N sản phẩm của ORF7 chính vì thế

cần một lượng lớn kháng nguyên là protein N dùng trong các kit chẩn đoán

này Nhưng hiện tại có một hạn chế là PRRSV thường khó nuôi trên môi

trường tế bào Chúng chỉ phát triển tốt trên môi trường đại thực bào túi phổi

heo (PAM) và một số dòng tế bào thận khỉ Châu Phi, tuy nhiên, hiện tại người

ta chưa thành công trong việc tuyển lựa các dòng tế bào này trong nuôi cấy

nhân tạo Các dòng tế bào thận khỉ thường không nhạy cảm cho tất cả các

chủng virus PRRS Chính vì thế phương pháp sản xuất protein tái tổ hợp cho

PRRSV là hướng đi đúng và mang lại nhiều ưu điểm, đặc biệt sản xuất protein

tái tổ hợp N mã hóa bởi ORF7 mang tính ứng dụng cao trong các thử nghiệm

như dùng làm vật liệu trong các kit chẩn đoán ELISA Sản xuất protein N tái tổ

hợp mở ra khả năng tạo số lượng lớn kháng nguyên dùng làm vật liệu trong

chẩn đoán nhất là khi dịch bệnh bùng phát Sản xuất protein tái tổ hợp cũng

góp phần khắc phục được nhược điểm hiện tại là khó nuôi cấy PRRSV trên môi

trường tế bào như đã nêu ở trên

2 Cấu trúc phân tử của Protein N

Protein N gồm năm vùng cấu trúc chính và có cấu hình xoắn α-helix

Vùng I: nằm ở vị trí của vùng amino-terminal giữa amino acid thứ 18 và

52 Bao gồm vùng quan trọng quyết định yếu tố kháng nguyên nằm giữa amino

acid thứ 30 và 52 Vùng này được nhận diện đặc hiệu bởi kháng thể đơn dòng

SDOW17 và SDOW17 là kháng thể đơn dòng duy nhất để phát hiện, nhận diện

một epitope chung cho hầu hết các chủng virus PRRS Châu Âu và Bắc Mỹ,

epitope này nằm ở vị trí bên trong vùng bảo tồn của N protein, cấu hình của

vùng này ở dạng cấu hình xoắn helical, kị nước

Vùng II: từ amino acid 37 đến 52, bao gồm các epitope tuyến tính

Vùng III, từ amino acid 52 đến 69, nằm trong vùng bảo tồn cao của N

protein Nhóm amino acid này là thành phần của immunodominant epitope, vì

70% các kháng thể đơn dòng nhận diện cấu hình protein hiện diện trong N-52

nhưng không nhận diện được đột biến loại N-69 Các amino acid từ 40 đến 66

nằm trong vùng ưa nước của N-protein, và nằm ở vùng dễ phát hiện trên bề

mặt ngoài của capsid

Vùng IV, trải dài từ amino acid thứ 69 tới 112, được phát hiện bởi sự

gắn kết đặc hiệu của kháng thể đơn dòng SR30

Vùng V từ amino acid 112 đến amino acid đóng vai trò quan trọng

trong việc duy trì cấu hình chung của protein

3 Sản xuất protein N tái tổ hợp

3.1 giới thiệu

Trong phần trình bày này người ta sản xuất protein N tái tổ hợp bằng

cách chèn gene ORF7 mã hóa cho protein nucleocapsid N của Lelystad virus

(LV) vào sau promoter P10 của baculor virus Autographa califonia nuclear

polyhedrosis Kết quả tạo ra baculovirus tái tổ hợp là bac-ORF7, biểu hiện

protein 15kDa trong tế bào côn trùng Protein này có kích thước tương tự với

kích thước protein N biểu hiện bởi LV trong tế bào CL2621và vẫn giữ được