NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG đến SỰ RA HOA CỦA CÂY FORGET ME NOT (browallia americana l ) NUÔI CẤY IN VITRO (2)

TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH, SỐ 40, THÁNG 12 NĂM 2020 DOI: 10.35382/18594816.1.40.2020.613 NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ RA HOA CỦA CÂY FORGET-ME-NOT (Browallia americana L.) NUÔI CẤY IN VITRO Lê Thị Thùy Linh1 , Trần Tiểu Linh Thương2 , Lê Đức Hưng3 , Hán Huỳnh Diện4 , Lê Thị Bích Thy5 , Lê Văn Thức6 STUDY ON FACTORS AFFECTING THE FLOWERING OF FORGET-ME-NOT (Browallia americana L.) IN VITRO CULTURE Le Thi Thuy Linh1 , Tran Tieu Linh Thuong2 , Le Duc Hung3 , Han Huynh Dien4 , Le Thi Bich Thy5 , Le Van Thuc6 Tóm tắt – Q trình chuyển đổi từ giai đoạn sinh dưỡng sang giai đoạn sinh sản phụ thuộc vào yếu tố khác Trong nghiên cứu này, khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình hoa in vitro Forget-me-not Kết nghiên cứu cho thấy, chồi 40 ngày tuổi nguồn mẫu phù hợp cho trình tạo hoa in vitro (đạt 90,85% sau 45 ngày ni cấy) Khống dinh dưỡng ảnh hưởng lớn đến khả biệt hóa nụ hoa cây, cao môi trường MS (đạt 87,22% sau 45 ngày ni cấy) Trong đó, hầu hết chất điều hòa sinh trưởng thực vật khảo sát ức chế q trình hình thành hoa Đặc biệt, mơi trường ni cấy sử dụng đường glucose cho hiệu hoa cao môi trường sử dụng đường sucrose, tỉ lệ hoa cao nồng độ glucose 50 mg/L (tỉ lệ nụ hoa đạt 90,52%, với 3,50 nụ hoa/cây sau 30 ngày ni cấy) Bên cạnh đó, ni cấy thống khí sử dụng film nylon gắn màng milipore có tỉ lệ nụ hoa hình thành cao (trung bình 3,58 nụ hoa/cây) Kết tảng quan trọng nghiên cứu chế hoa thực vật nuôi cấy in vitro, mơ hình tốt để phục vụ cơng tác giảng dạy nghiên cứu Từ khóa: Browallia americana L., giai đoạn sinh dưỡng, giai đoạn sinh sản, màng milipore, hoa in vitro Abstract – Vegetative to reproductive transition depends on different factors This study was conducted to examine factors affecting the growth and flowering of Browallia americana L in vitro such as the age of the sample, mineral content, plant growth regulators, concentration and type of sugar, ventilation culture The results showed that 40-day-old shoots 1,3,4,5,6 Viện Nghiên cứu Hạt nhân, Viện Năng lượng Nguyên tử Việt Nam Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Ngày nhận bài: 20/9/2020; Ngày nhận kết bình duyệt: 23/11/2020; Ngày chấp nhận đăng: 25/12/2020 Email: thucbiovhn@gmail.com 1,3,4,5,6 Dalat Nuclear Research Institute, Vietnam Atomic Energy Institute Ho Chi Minh City University of Technology, Viet Nam National University - Ho Chi Minh City Received date: 20th August 2020; Revised date: 23rd November 2020; Accepted date: 25th December 2020 13 TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH, SỐ 40, THÁNG 12 NĂM 2020 PHẦN A: LĨNH VỰC THỰC VẬT – SINH HÓA - Viện Năng lượng Nguyên tử Việt Nam tiến hành nghiên cứu chu kì sống Forget-me-not (Browallia americana L.) điều kiện in vitro, việc gieo hạt, nảy mầm, sinh trưởng, mang hoa, tự thụ phấn tạo theo vòng tròn khép kín ống nghiệm Việc hồn thiện quy trình hoa ống nghiệm Forget-me-not cần thiết Đối tượng mơ hình thu nhỏ tiềm có ý nghĩa nghiên cứu lí thuyết ứng dụng thực tiễn were a suitable source of in vitro flowering (90.85% after 45 days of culture) Mineral content had a great influence on the ability to differentiate flower buds of plants, the highest in Murashige and Skoog medium (87.22% after 45 days of culture) Meanwhile, most of the plant growth regulators which were surveyed in this study inhibited the flowering In particular, culture medium with glucose showed higher flowering efficiency than saccharose, the highest flowering rate was at 50 mg/L glucoses (90.52%, with 3.50 flower buds/explant after 30 days of culture) In addition, ventilation culture, which used plastic wraped with milipore filter had the highest rate of flower bud formation (average 3.58 flower buds/plant) This result is an important foundation for studying the flowering of in vitro plant culture, which will be one of the great paradigm plants for teaching and basic research Keywords: Browallia americana L., vegetative stage, reproductive stage, milipore filter, in vitro flowering II TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU Sự hoa trình chuyển tiếp từ giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng sang giai đoạn sinh trưởng sinh sản, điều khiển yếu tố nội sinh ngoại sinh [1], [2] Ra hoa in vitro cung cấp mơ hình lí tưởng để nghiên cứu chế sinh lí nở hoa, ứng dụng cơng tác chọn tạo giống Thêm vào đó, việc điều khiển hoa in vitro góp phần thúc đẩy trình chọn tạo giống hoa làm đa dạng sản phẩm hoa trang trí [3] Một số nhà khoa học giới Việt Nam nghiên cứu chế nở hoa thành công số đối tượng hoa lan [4], hoa hồng [5] - [7], torenia [8], hoa hồng cơm Rosa sericea Lindl [9] Các yếu tố độ tuổi cây, chất điều hòa sinh trưởng, nồng độ đường, ánh sáng, ni cấy thống khí [8], [10] - [12] số chất khác dùng nghiên cứu hoa ống nghiệm nhiều đối tượng [2], [13] Từ luận trên, nghiên cứu thực nhằm xác định ảnh hưởng thời gian cấy chuyền, nồng độ khoáng đa lượng, chất điều hòa sinh trưởng độ thống khí đến q trình hoa I ĐẶT VẤN ĐỀ Nhân giống in vitro khẳng định vai trị khơng thể thay quy trình sản xuất giống đầu dịng bệnh Rất nhiều lồi hoa, ăn trái, công nghiệp, lâm nghiệp, dược liệu cảnh nhân giống in vitro thành cơng Điều góp phần khơng nhỏ việc bảo tồn nguồn gen, cung cấp giống sở để nghiên cứu chuyên sâu công nghệ tế bào thực vật Song song đó, vi nhân giống (micropropagation) cơng cụ hữu hiệu nghiên cứu sinh lí thực vật, đặc biệt giai đoạn hoa Gần đây, Viện Nghiên cứu Hạt nhân 14 TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH, SỐ 40, THÁNG 12 NĂM 2020 giống Browallia americana L., làm sở để hồn thiện quy trình kĩ thuật, chủ động điều khiển hoa in vitro Forgetme-not tạo nguyên liệu đáp ứng cho nghiên cứu sinh lí, di truyền, đột biến phục vụ công tác giảng dạy nghiên cứu liên quan khác III PHẦN A: LĨNH VỰC THỰC VẬT – SINH HÓA 3) Khảo sát ảnh hưởng kết hợp α -naphthaleneacetic acid 6benzylaminopurine lên hình thành hoa Forget-me-not in vitro: Chồi 3,5 cm nuôi cấy môi trường MS bổ sung 30 g/L sucrose, g/L agar, 0,2 mg/L α -naphthaleneacetic acid (NAA) 6benzylaminopurine (BAP) nồng độ 0,0, 0,2, 0,5, 1,0 1,5 mg/L VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 4) Khảo sát ảnh hưởng kết hợp α -naphthaleneacetic acid giberellin lên hình thành hoa Forget-me-not in vitro: Chồi 3,5 cm nuôi cấy môi trường MS bổ sung 30 g/L sucrose, g/L agar, 0,2 mg/L NAA Gibberellin (GA3) nồng độ 0,0, 0,2, 0,5, 1,0 1,5 mg/L) NGHIÊN CỨU A Vật liệu Nguồn mẫu cho thí nghiệm chồi Forget-me-not (Browallia americana L.) ổn định qua ba lần cấy chuyền (20 ngày/lần), sinh trưởng, phát triển tốt theo phương pháp cắt đốt (microcutting) môi trường MS [14], chiều cao khoảng 3,5 cm 5) Khảo sát ảnh hưởng nồng độ đường loại đường lên hình thành hoa Forget-me-not in vitro: Chồi 3,5 cm nuôi cấy mơi trường MS có bổ sung g/L agar đường sucrose glucose nồng độ 0, 20, 30, 40, 50, 60, 70 90 g/L B Phương pháp 1) Khảo sát ảnh hưởng tuổi mẫu lên sinh trưởng hoa Forget-menot in vitro: Chồi Forget-me-not 3,5 cm lấy giai đoạn khác (tuổi chồi: 10, 20, 30 40 ngày) ni cấy mơi trường MS có bổ sung 30 g/L sucrose g/L agar 2) Khảo sát ảnh hưởng nồng độ khống lên hình thành hoa Forget-menot in vitro: Chồi 3,5 cm nuôi cấy môi trường 2MS, 1,5MS, MS, 1 MS, MS, có bổ sung 30 g/L sucrose g/L agar (trong đó: mơi trường 2MS, 1,5MS tăng thành phần đa lượng theo tỉ lệ 1 tương ứng; MS, MS giảm thành phần đa lượng theo tỉ lệ tương ứng) 6) Khảo sát ảnh hưởng thống khí lên hình thành hoa Forget-me-not in vitro: Chồi 3,5 cm cấy môi trường MS bổ sung 30 g/L sucrose g/L agar, nắp đậy bơng gịn khơng thấm film nylon có khơng có màng millipore (đường kính: 1,8 cm, kích thước lỗ màng 0,5 µ m) 7) Khảo sát tổng hợp yếu tố ảnh hưởng lên trình hình thành hoa Forget-me-not in vitro: Sử dụng chồi 3,5 cm thí nghiệm tuổi mẫu tốt kết thí nghiệm đơn lẻ nêu để đánh giá tổng hợp khả sinh trưởng, phát triển hình thành hoa Forget-me-not 15 TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH, SỐ 40, THÁNG 12 NĂM 2020 PHẦN A: LĨNH VỰC THỰC VẬT – SINH HĨA thành nụ hoa óc chó (Juglans regia) phải qua 03 – 06 lần cấy chuyền [16] Trong thí nghiệm Forget-me-not, nhận kết tương tự, tỉ lệ nụ từ lúc vô mẫu thấp không xảy Bên cạnh đó, chồi cấy chuyền 03 lần để mẫu thí nghiệm đồng di truyền Sau cấy chuyền 03 lần, chồi tiến hành thu lấy chồi vào mốc thời gian khác (10 ngày, 20 ngày, 30 ngày 40 ngày sau cấy chuyền) để khảo sát ảnh hưởng tuổi mẫu đến hoa Kết Bảng cho thấy, đạt chiều cao cao (12,58 cm) nghiệm thức (1-4), sử dụng mẫu cấy 40 ngày tuổi thấp (8,95 cm) giai đoạn 10 ngày tuổi (nghiệm thức 1-1) Nhìn chung, hình thái thân, khơng có khác biệt lớn nghiệm thức Điều cho thấy, tuổi khơng gây ảnh hưởng lớn đến q trình sinh trưởng, sinh dưỡng Forget-me-not Tỉ lệ nụ tăng dần theo thời gian, hiệu cao vào giai đoạn 40 ngày tuổi (95,83%) thấp vào giai đoạn 10 ngày tuổi (64,58%) sau 45 ngày nuôi cấy Nguyên nhân tượng độ tuổi thấp non, chưa đáp ứng kích thích hoa Hầu hết phải hội đủ yếu tố cần thiết hình thành hoa hay nói cách khác, thực vật phải trải qua giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng, đạt đến giai đoạn trưởng thành định hoa Đối với Forget-me-not tương tự, vịng đời ngồi tự nhiên từ 45 đến 60 ngày kể từ lúc hình thành đến hoa, quả, hạt chết Do đó, mẫu cấy thu vào giai đoạn 10, 20 ngày tuổi non, chưa đáp ứng kích thích hoa Có thể khẳng định rằng, mẫu cấy giai đoạn C Điều kiện thí nghiệm tiêu theo dõi Điều kiện thí nghiệm: Mẫu cấy vào bình thủy tinh 500 mL, chứa 60 mL môi trường Mỗi nghiệm thức 15 mẫu (03 mẫu/bình) lặp lại 05 lần Các thí nghiệm giữ nhiệt độ 25 ± 2o C, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày với cường độ 45 µ mol.m−2 s−1 ẩm độ trung bình 75 – 80% Các tiêu theo dõi: Chiều cao (cm), tỉ lệ (%) thời gian hình thành nụ hoa (ngày), số nụ hoa/chồi, hình thái hoa tình trạng mẫu cấy Kết thí nghiệm thu thập sau 15, 30, 45 60 ngày nuôi cấy Số liệu xử lí phần mềm SPSS 16.0 (SPSS Inc Headquarters, United States) với phép thử Duncan mức xác suất có ý nghĩa P = 0,05 [15] IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN A Ảnh hưởng tuổi mẫu lên hình thành hoa Forget-me-not in vitro Một yếu tố quan tâm xác định độ tuổi nguồn mẫu ban đầu để làm vật liệu cho nghiên cứu hoa in vitro Một số nhà nghiên cứu cho kĩ thuật nuôi cấy in vitro cơng cụ rút ngắn thời gian phát triển sinh dưỡng thực vật [17] Ngồi ra, việc già hóa mẫu thực cách cấy chuyền mẫu nhiều lần hay gia tăng khoảng thời gian qua lần cấy chuyền Wang et al (2002) tiến hành nghiên cứu thời gian cấy chuyền hoa hồng, kết tốt vào giai đoạn 45 ngày, sớm (25 ngày) hay muộn (60 ngày) không tốt [7] Christian Breton (2004) ghi nhận, hình 16 TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH, SỐ 40, THÁNG 12 NĂM 2020 PHẦN A: LĨNH VỰC THỰC VẬT – SINH HÓA Bảng 1: Ảnh hưởng tuổi mẫu lên hình thành hoa Forget-me-not in vitro sau 45 ngày ni cấy (Ghi chú: Trong cột, giá trị trung bình có kí tự theo sau giống khơng có khác biệt mặt thống kê với độ tin cậy P = 0,05 (Ducan’t test).) lượng (chủ yếu N, P, K) Kết từ Bảng cho thấy, tỉ lệ hình thành nụ hoa Forget-me-not điều kiện in vitro phụ thuộc lớn vào hàm lượng chất dinh dưỡng có mơi trường ni cấy Tỉ lệ nụ đạt kết cao (87,22%) môi trường MS sau 45 ngày nuôi cấy Tuy nhiên, môi trường này, chiều cao lại thấp (8,74 cm), mơi trường 1,5MS, chiều cao lên tới 12,69 cm Điều giải thích, mơi trường MS nguyên tố đa lượng diện với nồng độ thấp, hàm lượng nitơ (cung cấp dạng NH4 NO3 ) giảm, đó, lượng cacbon (đường) khơng đổi dẫn đến tỉ lệ C/N tăng, lí kích thích hoa Ngược lại, tăng hàm lượng khống đa lượng mơi trường 1,5MS, tỉ lệ C/N giảm dẫn đến phát triển dinh dưỡng chiếm ưu thế, làm chậm hoa Kết tương tự Brassica napus hàm lượng nitơ cao làm chậm hoa Trong nghiên cứu Franklin et al (2000) phương pháp hoa in vitro đậu xanh (Pisum sativum), hàm lượng nitơ thấp làm tăng hiệu việc cảm ứng 40 ngày tuổi lựa chọn tốt cho trình hoa in vitro Forget-me-not, trình cấy chuyền, mẫu cấy giai đoạn 50 ngày 60 ngày tuổi phát triển lên đến nắp bình ni cấy làm cho chồi đỉnh bị dị dạng, nhỏ có tượng úa vàng nguồn dinh dưỡng cạn kiệt Để giải thích cho giai đoạn cịn non thực vật, nhà khoa học thực nhiều nghiên cứu đến câu hỏi lớn Nguyễn Hồng Vũ cộng (2006) nghiên cứu hoa hoa hồng (Hybrid tea) cv “First Prize”, thời gian cấy chuyền tối ưu để cảm ứng hoa in vitro 90 ngày [6] Trong đó, kết nghiên cứu thực chồi Torenia (Torenia fournieri L.) cho thấy, chồi già cho tỉ lệ hình thành hoa cao Các chồi 60 ngày tuổi cho tỉ lệ hoa cao sau 30 ngày nuôi cấy [6], [8] B Ảnh hưởng nồng độ khống lên hình thành hoa Forget-me-not in vitro Quá trình hình thành nụ hoa Forget-me-not điều kiện in vitro chịu ảnh hưởng mạnh nguyên tố đa 17 TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH, SỐ 40, THÁNG 12 NĂM 2020 PHẦN A: LĨNH VỰC THỰC VẬT – SINH HÓA Bảng 2: Ảnh hưởng nồng độ khống lên hình thành hoa Forget-me-not in vitro sau 45 ngày nuôi cấy (Ghi chú: Trong cột, giá trị trung bình có kí tự theo sau giống khơng có khác biệt mặt thống kê với độ tin cậy P = 0,05 (Ducan’t test).) hoa [18] Như vậy, hình thành nụ hoa chịu ảnh hưởng mạnh thành phần dinh dưỡng đa lượng mơi trường MS mơi trường hình thành nụ hoa cao so với môi trường khác loài Forget-me-not C Ảnh hưởng α -naphthaleneacetic kết acid hợp số chồi lớn (9,83 chồi/cây) thu nghiệm thức có 0,2 mg/L NAA 1,5 mg/L BA (nghiệm thức 4-5) Tuy nhiên, môi trường này, chiều cao lại thấp (6,51 cm) Trong đó, mơi trường khác, chiều cao lên tới 13,65 cm (nghiệm thức 3-2) Đồng thời, quan sát hình thái chúng tơi nhận thấy, thí nghiệm có kết hợp cytokinin auxin tỉ lệ : (nghiệm thức 3-2) có tượng đa thân, xanh, cao, rễ chùm trắng, phát triển mạnh; thí nghiệm có nồng độ BA cao NAA, có tượng nhỏ, thấp, không rễ, phát sinh số lượng lớn chồi bất định, hình thái chồi bị biến dạng 6- benzylaminopurine lên hình thành hoa Forget-me-not in vitro Sự kết hợp cytokinin auxin nồng độ thích hợp quan trọng trình cảm ứng hoa nhiều lồi thực vật [19] Trong thí nghiệm này, chúng tơi tiến hành khảo sát ảnh hưởng kết hợp auxin (NAA) cytokinin (BA) lên hình thành hoa Forget-me-not in vitro cách cố định nồng độ NAA (0,2 mg/L) tăng dần nồng độ BA (từ 0,2 đến 1,5 mg/L) môi trường Sự cân cytokinin auxin yếu tố kiểm soát phát triển Forgetme-not, số lượng chồi tăng đáng kể bổ sung NAA 0,2 mg/L tăng dần nồng độ BA từ 0,2 đến 1,5 mg/L vào môi trường, Tỉ lệ tạo nụ hoa giảm dần bổ sung auxin cytokinin vào môi trường nuôi cấy Tỉ lệ nụ đạt cao (58,33%) nghiệm thức không bổ sung phytohormone giảm dần 0% bổ sung NAA 0,2 mg/L tăng dần hàm lượng BA từ 0,2 đến 1,5 mg/L vào mơi trường Điều giải thích, nhu cầu hàm lượng phytohormone ngoại sinh lồi Forget-me-not khơng cao, sinh tổng hợp cytokinin auxin giai đoạn phận khác 18 TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH, SỐ 40, THÁNG 12 NĂM 2020 PHẦN A: LĨNH VỰC THỰC VẬT – SINH HÓA Bảng 3: Ảnh hưởng kết hợp NAA BA đến sinh trưởng hình thành hoa Forget-me-not in vitro sau 45 ngày nuôi cấy (Ghi chú: Trong cột, giá trị trung bình có kí tự theo sau giống khơng có khác biệt mặt thống kê với độ tin cậy P = 0,05 (Ducan’t test).) chuyển đến nụ Kết tương tự với kết nghiên cứu diện nhóm cytokinin BA, Zeatin, iPA ức chế hình thành hoa Brassica napus [20] Tóm lại, bổ sung auxin cytokinin vào mơi trường biệt hóa chồi hoa Forget-me-not, chúng tơi nhận thấy có giảm tỉ lệ nụ Điều cho thấy rằng, điều kiện in vitro, việc xử lí kết hợp auxin cytokinin thúc đẩy hoa loài lại ức chế hoa loài khác Trong số trường hợp, diện BAP lại kích thích trình tạo hoa, điển hình bổ sung vào môi trường 1,0 mg/L BAP Ocimum basilicum cho tỉ lệ tạo hoa cao đối chứng [21] Trong đó, lồi Forget-menot dường khơng cần có mặt phytohormone sung NAA 0,2 mg/L tăng dần nồng độ GA3 từ 0,2 đến 1,5 mg/L, tỉ lệ hình thành nụ giảm rõ rệt so với mơi trường không bổ sung phytohormone (nghiệm thức 4-1) Điều toàn chồi in vitro tiếp tục tăng trưởng trạng thái sinh dưỡng mà chưa có dấu hiệu biệt hóa chồi hoa Sự kết hợp auxin giberellin với tỉ lệ : (nghiệm thức 4-2), hình thành chồi nhiều (5,17 chồi/cây), đạt chiều cao cao (14,31 cm) sinh trưởng mạnh Có thể thấy, việc bổ sung auxin giberellin vào môi trường nuôi cấy thúc đẩy trình sinh trưởng sinh dưỡng mà hạn chế chuyển tiếp hoa giống Forget-me-not Như vậy, vai trị gibberellin hay kết hợp với auxin hoa thực vật tùy thuộc vào lồi mà nhân tố kích thích hay ức chế Franklin et al (2000) nuôi cấy chồi đậu xanh (Pisum sativum) mơi trường có bổ sung 1,0 mg/L GA3 0,5 mg/L IBA cho tỉ lệ hoa cao [18], số lượng nụ hoa cao quan sát thấy bổ sung 0,75 mg/L GA3 [22] Dường trình hình thành hoa Forget-me-not, D Ảnh hưởng kết hợp NAA giberellin lên hình thành hoa Forgetme-not in vitro Mối tương quan kết hợp NAA GA3 đến tỉ lệ hình thành nụ hoa in vitro Ở ngày thứ 45, mơi trường bổ 19 TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH, SỐ 40, THÁNG 12 NĂM 2020 PHẦN A: LĨNH VỰC THỰC VẬT – SINH HÓA Bảng 4: Ảnh hưởng ảnh hưởng kết hợp NAA GA3 đến sinh trưởng hình thành hoa Forget-me-not in vitro sau 45 ngày nuôi cấy (Ghi chú: Trong cột, giá trị trung bình có kí tự theo sau giống khơng có khác biệt mặt thống kê với độ tin cậy P = 0,05 (Ducan’t test).) đâu nguồn carbon hiệu gây cảm ứng hoa in vitro giống hoa Số liệu sau 30 ngày nuôi cấy thể khác biệt sử dụng hai loại đường khác nồng độ khác Các thí nghiệm sử dụng đường sucrose có chiều cao tương đối đồng đều, đạt chiều cao cao 14,64 cm nồng độ 40 g/L (nghiệm thức 5-3) thấp 10,43 cm nồng độ 20 g/L (nghiệm thức 5-1) Trong đó, thí nghiệm sử dụng đường glucose lại thấp hẳn; đồng thời, có chênh lệch lớn chiều cao mơi trường có nồng độ glucose khác Nghiệm thức sử dụng glucose nồng độ 50 g/L cho chiều cao cao đạt 12,31 cm thấp 4,07 cm nồng độ 70 g/L Điều cho thấy, sinh trưởng Forget-me-not chịu tác động lớn từ nồng độ nguồn carbon sử dụng Ở đây, thấy, đường sucrose có ảnh hưởng tích cực đến q trình phát triển sinh dưỡng Forget-me-not đường glucose, lí sucrose sử dụng rộng rãi ni cấy in vitro Tuy nhiên, mục tiêu mà thí nghiệm hướng đến ảnh hưởng chúng việc bổ sung gibberellin auxin nhân tố hạn chế Kết thu nghiên cứu Dương Tấn Nhựt cộng (2013) Torenia (Torenia fournieri L.), nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Torenia môi trường không bổ sung phytohormone, trình hình thành hoa in vitro cảm ứng giai đoạn sinh lí mẫu cấy [8] E Ảnh hưởng nồng độ đường lên hình thành hoa Forget-me-not in vitro Đường thành phần cần thiết cho trình cảm ứng phát triển hoa Hai dạng đường thường gặp nuôi cấy mô sucrose glucose Khi khử trùng, đường sucrose bị thuỷ phân phần tạo glucose fructose Vì vậy, hẳn có khác biệt khả hấp thụ carbonhydrat thực vật từ đường sucrose từ đường glucose bổ sung trực tiếp vào môi trường Do đó, chúng tơi tiến hành thí nghiệm nhằm khảo sát ảnh hưởng nồng độ đường sucrose glucose lên hình thành hoa Forgetme-not in vitro Đồng thời, chúng tơi tìm 20 TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH, SỐ 40, THÁNG 12 NĂM 2020 PHẦN A: LĨNH VỰC THỰC VẬT – SINH HÓA Bảng 5: Ảnh hưởng nồng độ đường đến sinh trưởng hình thành hoa Forget-me-not in vitro sau 30 ngày nuôi cấy (Ghi chú: Trong cột, giá trị trung bình có kí tự theo sau giống khơng có khác biệt mặt thống kê với độ tin cậy P = 0,05 (Ducan’t test).) hơn, đặc biệt hai mức nồng độ 70 90 g/L glucose cho thời gian hoa sớm (ngày thứ 7) Tuy nhiên, hai mức nồng độ xuất chết mẫu Điều phù hợp với nhận định Beverley (2007), thực vật đáp ứng biến động dinh dưỡng từ môi trường (các stress) cách khởi động chương trình hoa sớm nhằm đảm bảo thời gian hoa, kết tạo hạt trước chết [5] Việc tăng hàm lượng đường mơi trường gây stress cho khiến rút ngắn thời gian sinh trưởng sinh dưỡng, nhanh chóng bước vài giai đoạn sinh sản chết Mặt khác, tượng xảy yêu cầu chất lượng dinh dưỡng loài thực vật khác nhau, loài có giới hạn chất dinh dưỡng thích hợp cho trình sinh trưởng, phát triển đặc lên trình hình thành hoa Forget-menot in vitro Do đó, quan tâm đến kết số nụ, số hoa, tỉ lệ nụ hoa Kết thu sau 15 ngày nuôi cấy cho thấy, hoa Forget-me-not phụ thuộc lớn vào nồng độ đường mơi trường Cả hai thí nghiệm hình thành hoa tăng nồng độ đường Điều liên quan đến tỉ lệ C/N môi trường, tăng nồng độ đường lượng C tăng cao Do đó, tỉ lệ C/N cao, kích thích cảm ứng hoa Kết trùng với nghiên cứu vai trò đường hoa in vitro nhiều trồng long đởm [23] tre [24] Kết Bảng Hình 1a cho thấy, tăng nồng độ đường môi trường, rút ngắn thời gian sinh trưởng sinh dưỡng bước vào giai đoạn sinh sản sớm 21 TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH, SỐ 40, THÁNG 12 NĂM 2020 PHẦN A: LĨNH VỰC THỰC VẬT – SINH HÓA nguồn carbon hiệu gây cảm ứng hoa in vitro giống Tuy nhiên, chưa thể kết luận nghiệm thức cho 100% tỉ lệ hoa (70 g/L) mức nồng độ tốt cho hoa Forget-me-not Ở thí nghiệm với glucose, số lượng hoa cao (3,50 hoa/cây) đạt sử dụng nồng độ 50 g/L 70 g/L (1,33 hoa/cây) (Bảng 5) Bên cạnh đó, chiều cao giảm rõ rệt, cao nồng độ 50 g/L (12,31 cm) thấp nồng độ 70 g/L (4,07 cm) (Bảng 5) Kết cho thấy, diện carbon với nồng độ cao phần ức chế trình sinh trưởng hình thành hoa Forget-menot Nguyên nhân tượng đường nguồn carbonhydrat quan trọng, tác nhân gây nên áp suất thẩm thấu, tăng hàm lượng glucose môi trường Điều đồng nghĩa với việc tăng áp suất thẩm thấu Mơi trường có áp suất thẩm thấu cao vượt ngưỡng khiến tế bào nước, gia tăng hàm lượng acid abscisic, giảm hơ hấp Chính thế, mơi trường có hàm lượng đường cao tăng trưởng chậm, lượng chồi hoa thấp hẳn môi trường khác; đồng thời, tồn chồi hoa có tỉ lệ hoa đạt 100% Điều thể rõ qua nghiên cứu hoa khổ qua (Momordica charantia L.) [17], Kinnow mandarin [4] Nhìn chung, đường có vai trị quan trọng nghiên cứu hoa Forget-me-not in vitro, môi trường nuôi cấy giàu đường glucose cho hiệu hoa cao môi trường sử dụng đường sucrose nồng độ tương ứng Hay nói cách khác, glucose nguồn carbon cho chọn lựa trình gây cảm ứng hoa in vitro đối tượng Bên cạnh đó, thực vật có trưng Đối với Forget-me-not, mẫu chồi ni mơi trường có nồng độ glucose 90 g/L, mẫu bị chết sau vài ngày ni cấy Vì vậy, nói giới hạn Kết Hình 1: Ảnh hưởng nồng độ đường loại đường lên tỉ lệ hoa Forget-me-not in vitro sau 30 ngày nuôi cấy từ Bảng Hình ta thấy, tỉ lệ hoa sử dụng glucose cao hẳn sucrose mức nồng độ tương ứng Tỉ lệ hoa cao sử dụng glucose với nồng độ 70 g/L (100%) sucrose nồng độ 90 g/L (52,46%) Điều giải thích, sucrose disaccharide, glucose monosaccharide, bổ sung trực tiếp vào môi trường dễ dàng hấp thụ carbohydrate từ glucose Do đó, làm tăng nhanh hàm lượng carbon tế bào, dẫn đến tỉ lệ C/N tăng lên kích thích q trình tạo hoa cao Điều cho thấy, đường glucose không cho biểu tốt phát triển sinh dưỡng sucrose lại tác nhân có tác động mạnh mẽ lên q trình sinh sản Có thể thấy, glucose 22 TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH, SỐ 40, THÁNG 12 NĂM 2020 PHẦN A: LĨNH VỰC THỰC VẬT – SINH HĨA bên bình bên ngồi bình ni cấy làm cho hàm lượng CO2 tăng lên giúp cho quang hợp tốt hơn, to xanh Như vậy, vai trị ni cấy thống khí nghiên cứu hoa in vitro quan trọng, Forget-me-not, nghiệm thức film nylon có gắn lớp màng Milipore tốt Kết tương tự nghiên cứu Goncalves et al (2007), Herreria salsaparilha nuôi cấy bình thống khí có chiều cao thấp hơn, đốt hơn, trọng lượng tươi thấp trọng lượng khô cao so với nuôi cấy bình khơng thống khí [2], torenia tương tự [8] giới hạn nhu cầu đường riêng cho trình hình thành hoa, Forgetme-not, nồng độ đường glucose 50 g/L cho kết tốt F Ảnh hưởng độ thống khí lên hình thành hoa Forget-me-not in vitro Một vài nghiên cứu gần cho thấy, độ thống khí mơi trường ảnh hưởng mạnh mẽ đến sinh trưởng trình hình thành hoa thực vật [8], [25] Đồng thời, qua q trình cấy chuyền Forget-me-not, chúng tơi nhận thấy có khác biệt rõ rệt khả hình thành nụ hoa sử dụng nút bơng gịn khơng thấm so với film nylon Trong thí nghiệm này, sử dụng ba loại nút đậy khác (film nylon, bơng gịn khơng thấm, film nylon có gắn màng Milipore lớp hai lớp) nhằm khảo sát ảnh hưởng độ thống khí lên hình thành hoa Forget-me-not in vitro Kết Bảng cho thấy, khác biệt rõ mặt thống kê tiêu chiều cao cây, số lượng nụ hoa/cây tỉ lệ hoa Nghiệm thức 6-3 (sử dụng film nylon gắn hai lớp màng Milipore) có chiều cao cao (đạt 13,13 cm) thấp nghiệm thức 64 (đạt 9,88 cm), nhiên, nghiệm thức 6-4 (sử dụng film nylon gắn lớp màng Milipore) cho số nụ hoa/cây cao (3,58 nụ/cây) tỉ lệ hoa đạt 89,72% Đồng thời, qua trình theo dõi thí nghiệm, nghiệm thức sử dụng nắp đậy film nylon có tượng sắc tố, nhỏ, dị dạng Trong đó, thí nghiệm với nút bơng gịn, màng Milipore hai lớp lớp có kích thước tăng dần đậm màu hơn, mặt phiến có lơng tơ Điều phụ thuộc vào trao đổi thống khí G Tổng hợp yếu tố ảnh hưởng lên trình hình thành hoa Forget-me-not in vitro Qua kết từ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng đơn lẻ yếu tố tuổi mẫu, mơi trường khống, phytohormone, đường độ thống khí, nghiệm thức có tỉ lệ hoa khác Tuy nhiên, vấn đề hiệu hoa ta kết hợp yếu tố lên cách đồng thời câu hỏi Để giải vấn đề này, chúng tơi tiến hành thí nghiệm so sánh tổng hợp mơi trường tốt thí nghiệm (sử dụng chồi đỉnh Forget-me-not 40 ngày tuổi nuôi cấy mơi trường MS có bổ sung 50 g/L glucose sử dụng nắp đậy giấy lọc lớp) để đánh giá ảnh hưởng đồng thời yếu tố lên trình hình thành hoa in vitro đối tượng nghiên cứu Kết thu Bảng Hình 2c sau 30 ngày nuôi cấy cho thấy, nghiệm thức tổng hợp yếu tố khảo sát cho thấy có 23 TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH, SỐ 40, THÁNG 12 NĂM 2020 PHẦN A: LĨNH VỰC THỰC VẬT – SINH HĨA Bảng 6: Ảnh hưởng độ thống khí lên hình thành hoa Forget-me-not in vitro sau 45 ngày nuôi cấy (Ghi chú: Trong cột, giá trị trung bình có kí tự theo sau giống khơng có khác biệt mặt thống kê với độ tin cậy P = 0,05 (Ducan’t test).) Bảng 7: Ảnh hưởng mơi trường tổng hợp hình thành hoa Forget-me-not in vitro sau 30 ngày nuôi cấy (Ghi chú: Trong cột, giá trị trung bình có kí tự theo sau giống khơng có khác biệt mặt thống kê với độ tin cậy P = 0,05 (Ducan’t test).) khác biệt lớn so với đối chứng, tỉ lệ nụ đạt 100%, số nụ hoa/cây đạt 3,17 nụ tỉ lệ nụ nở hoa đạt 97,22% Kết lần khẳng định, vai trị yếu tố dinh dưỡng khống, nồng độ đường loại nút đậy tác động đến trình hoa in vitro đối tượng Foget-me-not Bên cạnh đó, chúng tơi nhận thấy rằng, hoa nở kéo dài thời gian lưu hoa vịng 07 ngày (Hình 2d, e) hoa Forget-me-not tự thụ phấn, hình thành hạt sau 45 ngày ni cấy (Hình 2f, g) Hạt hình thành sau gieo ống nghiệm cho tỉ lệ nảy mầm đạt 95% Như vậy, vịng đời hoa Forget-me-not hồn tồn thực ống nghiệm nên xem đối tượng lí tưởng để nghiên cứu chuyên sâu sinh lí thực vật, dinh dưỡng chế sinh lí tác động đến q trình hoa in vitro hay nghiên cứu đột biến chọn tạo giống, nghiên cứu liên quan khác V KẾT LUẬN Các yếu tố tuổi mẫu, dinh dưỡng khống, chất điều hịa sinh trưởng thực vật, nồng độ đường sucrose glucose, độ thống khí ảnh hưởng khác đến trình sinh trưởng phát triển hoa in vitro Forget-me-not Chồi 40 ngày tuổi nguồn mẫu phù hợp cho trình hoa (đạt 90,85%) Mơi trường khống đa lượng ảnh hưởng lớn đến khả biệt hóa chồi hoa, tốt môi trường MS (đạt 87,22% sau 45 ngày 24 TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH, SỐ 40, THÁNG 12 NĂM 2020 PHẦN A: LĨNH VỰC THỰC VẬT – SINH HÓA TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Kantamaht K, Patthara S, Kamnoon K In vitro flowering of shoots regenerated from culture nodal explant of Rosa hybrida cv ‘Heirloom’ Science Asia 2010; 36:161– 164 [2] Dương Tấn Nhựt Công nghệ sinh học thực vật: Nghiên cứu ứng dụng (Plant Biotechnology: Basic Research and Appica- Hình 2: Ảnh hưởng số yếu tố lên tion), tập TP Hồ Chí Minh: Nhà Xuất q trình hoa in vitro Foget-me- Nơng nghiệp; 2011 [3] not a: nồng độ đường glucose khác Wang G.Y, Yuan M.F, Hong Y In vitro flowering induction in rose In Vitro Cellu- (từ trái sang phải tương ứng với nồng lar and Development Biology – Plant 2002; độ 20, 30, 40, 50, 60, 70, 90 mg/L); b, c: 38(5):513–518 nghiệm thức tổng hợp yếu tố khảo sát [4] lên trình hình thành hoa in vitro (b- Te-chato S, Nujeen P, Muangsorn S Paclobutrazol enhance budbreak and flower- sau 15 ngày nuôi cấy, c- sau 30 ngày nuôi ing of Friederick’ s Dendrobium orchid in cấy); d: giai đoạn hoa nở ống vitro Journal of Agricultural Technology 2009; 5(1):157–165 nghiệm (2, ngày); e: đường kính hoa [5] ống nghiệm; f: bao phấn nhụy Kantamaht K, Patthara S, Kamnoon K In vitro flowering of shoots regenerated from hoa ống nghiệm; g: hạt hình thành culture nodal explant of Rosa hybrida cv ống nghiệm ‘Heirloom’ Science Asia 2010; 36:161– 164 [6] nuôi cấy); môi trường nuôi cấy giàu đường glucose cho hiệu hoa cao đường sucrose, đạt hiệu suất cao môi trường bổ sung 50 mg/L glucose (tỉ lệ nụ 90,52%, với 3,50 hoa/cây sau 30 ngày nuôi cấy) Hầu hết phytohormone khảo sát ức chế trình hình thành hoa Đặc biệt, việc ni cấy thống khí sử dụng film nylon có gắn lớp màng Milipore cho tỉ lệ chồi hoa cao (3,58 nụ/cây) Thí nghiệm tổng hợp yếu tố khảo sát tỉ lệ hoa đạt 97,22% Vu N.H, Anh P.H, Nhut D.T, The role of sucrose and different cytokinins in the in vitro floral morphogenesis of Rose (hybrid tea) cv “First Prize”, Plant Cell Tiss Org Cult 2006; 87:315–320 [7] Wang G.Y, Yuan M.F, Hong Y In vitro flowering induction in rose In Vitro Cellular and Development Biology – Plant 2002; 38(5):513–518 25 TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH, SỐ 40, THÁNG 12 NĂM 2020 [8] [14] Dương Tấn Nhựt, Lê Văn Thức, Trần Trọng for rapid growth and bio assays with to- Chiến, Nguyễn Phúc Huy, Nguyễn Bá Nam, bacco tissue cultures Physiologia plan- Vũ Quốc Luận Nghiên cứu số yếu tố tarum 1962; 15(3):473–497 [15] Torenia (Torenia fournieri L.) Tạp chí [16] 702 Eric Germain and Christian Jay-Allemand Somatic embryogenesis, micropropagation cộng Ảnh hưởng than hoạt tính and plant regeneration of “Early Mature” ni cấy thống khí lên khả sinh walnut trees (Juglans regia) that flower in trưởng phát triển hoa đồng tiền vitro Tree Physiology 2004; 24:425–435 (Gerbera jamesonii) in vitro ex vitro [17] Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 2013; mature root callus of ginseng (Panax gin- Tran Trong Tuan, Doan Do Tuong Han, seng) Nature 1980; 284:341–342 Nguyen Huu Ho, Duong Tan Nhut The [18] endogenous responses during the flower- Franklin G, Pius P.K, Ignacimuthu S Fac- ing stage of Torenia fournieri L under tors affecting in vitro flowering and fruiting LED light Journal of Biotechnology 2018; of green pea (Pisum sativum L.) Euphytica 16(4):659–667 2000; 115(1):65–74 [19] Trần Trọng Tuấn, Nguyễn Hữu Hổ, Dương Nguyễn Đức Lượng Sinh học thực vật, sinh Tấn Nhựt Ảnh hưởng gibberrellic acid, học động vật hệ sinh thái, tập - Sinh học proline spermidine lên hình thành hoa đại cương TP Hồ Chí Minh: Nhà Xuất Torenia (Torenia fournieri L.) Tạp Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh; chí Cơng nghệ Sinh học 2015; 13(1):123– 2014 130 [20] Koh W.L, Loh C.S Direct somatic em- Trần Trọng Tuấn, Đỗ Đức Thăng, Nguyễn bryogenesis, plant regeneration and in vitro Hữu Hổ, Dương Tấn Nhựt Ảnh hưởng flowering in rapid-cycling Brassica napus ánh sáng đường lên trình hoa Plant Cell Reports 2000; 19 (12):1177 hoa mõm chó (Torenia fournieri L.) ni [21] cấy in vitro Tạp chí Cơng nghệ Sinh học Aziemah Abdul Manan, Rosna Mat Taha, Elnaiem Elaagib Mubarak & Hashimah 2015; 13(4A):1303–1311 [13] Wei - Chin Chang and Yue – Ie Hsing In vitro flowering of embryoids derived from 51(4):435–446 [12] Christian Breton, Daniel Cornu, Dominique Chriqui, Annie Sauvanet, Pierrette Capelli, Nguyễn Thị Kim Yến, Nguyễn Phúc Huy, Hoàng Văn Cương, Nguyễn Thị Nhật Linh [11] Duncan D.B Multiple range and multiple F test Biometrics 1995; 11: - 42 Khoa học Công nghệ 2013; 51(6):689– [10] Murashige T, Skoog F A revised medium Tuấn, Trương Thị Diệu Hiền, Hồng Xn ảnh hưởng đến hình thành hoa in vitro [9] PHẦN A: LĨNH VỰC THỰC VẬT – SINH HÓA Elias In vitro flowering, glandular tri- Dương Tấn Nhựt Công nghệ sinh học thực chomes ultrastructure, and essential oil ac- vật, tập TP Hồ Chí Minh: Nhà Xuất cumulation in micropropagated Ocimum Nông nghiệp; 2013 basilicum L In Vitro Cellular & Devel- 26 TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH, SỐ 40, THÁNG 12 NĂM 2020 opmental Biology - Plant Springer 2016; 52:303–314 [22] Carla F C, Wolffe F.S, Claudinei S S, Marcelo D M, Ilio F.C, Diego I.R, Maurecilne L.S In vitro regeneration and flowering of Portulaca grandiflora Hook Ornamental Horticulture 2020; 25(4):443–449 DOI: 10.1590/2447-536x.v25i4.2077 [23] Zang Z, Leung D.W.M A comparison of in vitro with in vivo flowering in Gentian Plant cell, tissue and organ culture 2000; 63:223–226 [24] Chung-Chih Lin, Chuoun-Sea Lin, WeiChin Chang In vitro flowering of Bambusa edulis and subsequent plantlet survival Plant Cell, Tissue and Organ Culture 2002; 72:71–78 [25] Singh B, Sharma S, Rani G, Hallan V, Zaidi A.A, Nagpal A, Virk G.S In vitro micrografting for production of Indian Citrus Ringspot Virus (ICRSV) free plants of Kinnow mandarin (Citrus nobilis Lour × C deliciosa Tenora) Plant Biotechnology Reports 2008; 2:137–143 27 PHẦN A: LĨNH VỰC THỰC VẬT – SINH HÓA ... filter, in vitro flowering II TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU Sự hoa trình chuyển tiếp từ giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng sang giai đoạn sinh trưởng sinh sản, điều khiển yếu tố nội sinh ngoại sinh [1], [2] Ra. .. comparison of in vitro with in vivo flowering in Gentian Plant cell, tissue and organ culture 2000; 63:223–226 [24] Chung-Chih Lin, Chuoun-Sea Lin, WeiChin Chang In vitro flowering of Bambusa... khống lên hình thành hoa Forget-me-not in vitro Q trình hình thành nụ hoa Forget-me-not điều kiện in vitro chịu ảnh hưởng mạnh nguyên tố đa 17 TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH, SỐ 40, THÁNG