PHÂN lập và TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LAM có KHẢ NĂNG cố ĐỊNH đạm và THỬ NGHIỆM TRÊN cây lúa GIAI đoạn mạ NON

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LAM CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM VÀ THỬ NGHIỆM TRÊN CÂY LÚA GIAI ĐOẠN MẠ NON Sinh viên thực hiện : Nguyễn Tấn Thiên Long Mã số sinh viên : 1712020 Giáo viên hướng dẫn : PGS TS Nguyễn Thúy Hương TPHCM tháng 06 năm 2022 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LAM CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM VÀ THỬ NGHIỆM TRÊN CÂY LÚA GIAI ĐOẠN MẠ NON Sinh viên thực hiện : Nguyễn Tấn Thiên Long Mã số sinh viên : 1712020 Giáo viên hướng dẫn : PGS TS Nguyễn Thúy Hương TPHCM tháng 06 năm 2022 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập – Tự – Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Khoa: Kỹ thuật hóa học Bộ môn: Công nghệ sinh học Họ tên sinh viên: Nguyễn Tấn Thiên Long MSSV: 1712020 Ngày tháng năm sinh: 09/03/1999 Nơi sinh: Lâm Đồng Chuyên ngành: Công nghệ sinh học TÊN ĐỀ TÀI I Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lam có khả cố định đạm thử nghiệm lúa giai đoạn mạ non NHIỆM VỤ LUẬN VĂN II - Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn lam tạo thư viện vi khuẩn lam có khả cố định đạm - Đánh giá phát triển lúa giai đoạn mạ non cố định đạm vi khuẩn lam III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 01/2022 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 06/2022 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS Nguyễn Thúy Hương Nội dung yêu cầu luận văn tốt nghiệp thông qua môn CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN PGS TS Nguyễn Thúy Hương PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên i LỜI CẢM ƠN Lời em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Thúy Hương, người trực tiếp hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em suốt q trình học tập hồn thành luận văn Cô không người truyền đạt cho em kiến thức mà hỗ trợ em nhiều q trình hồn thiện luận văn Em xin gửi lời tri ân sâu sắc đến toàn thầy cô trường Đại học Bách Khoa đặc biệt thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học thuộc khoa Kỹ thuật Hóa Học giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn anh chị, bạn em Phịng thí nghiệm thuộc khoa Hóa ln đồng hành, quan tâm giúp đỡ thời gian tham gia nghiên cứu Sự quan tâm, chia sẻ bạn em động lực lớn lao với lúc mệt mỏi khó khăn Tơi không quên thời gian làm việc đầy nhiệt huyết bạn trường Đại học Bách Khoa TPHCM Cuối xin gửi lời cảm ơn sâu sắc lớn lao đến gia đình con, người hy sinh vật chất tinh thần, yêu thương, ủng hộ, động viên tôn trọng định Luận văn tốt nghiệp khơng tránh khỏi sai sót kiến thức cịn hạn chế, em mong nhận ý kiến đóng góp, nhận xét dẫn từ quý Thầy để em bổ sung hồn thiện luận văn này! Em xin chân thành cảm ơn! TPHCM, năm 2022 Nguyễn Tấn Thiên Long ii TÓM TẮT LUẬN VĂN Vi khuẩn lam thành phần cố định đạm sinh học ruộng lúa Do đặc tính cố định đạm quan trọng này, vi khuẩn lam có tiềm sử dụng phân bón sinh học nông nghiệp Nghiên cứu đề tài tập trung vào việc phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn lam có khả cố định đạm ruộng lúa Bốn chủng cố định đạm phân lập từ mẫu đất nước ruộng lúa xã Ea Bung Ea Lê thuộc huyện Ea Súp Kết phân loại dựa hình thái chọn chủng khác cho chủng tiềm Khảo sát tăng trưởng chủng vi khuẩn lam môi trường BG11 không đạm 30 ngày cho kết sau: Có chủng EB1, EB2 EL2 đạt mật số cao gấp 3,5 – 5.8 lần so với lượng chủng vi khuẩn ban đầu Cả chủng vi khuẩn chọn để khảo sát ảnh hưởng đến sinh trưởng lúa có tác động tích cực giúp tăng tiêu: Chiều cao cây, chiều dài rễ, khối lượng cây, khối lượng rễ Khi so sánh chiều cao với nghiệm thức đối chứng âm cho kết cao gấp từ 1,2- 1,5 lần, so với nghiệm thức nước cất cho kết cao gấp từ 1,6 – lần, chiều dài rễ cho kết tương tự Khi so sánh khối lượng với nghiệm thức đối chứng âm cho kết cao gấp từ 1,7- 2,2 lần, với nghiệm thức nước cất cao gấp từ 2,2- 2,9 lần, khối lượng rễ cho kết tương tự Căn trình tự gen 16S rRNA, chủng vi khuẩn EB1 có độ tương đồng 99,86% với loài Anabaena sp chủng PCC 7120 iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT LUẬN VĂN iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC BẢNG ix LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuẩn lam 1.1.1 Đặc điểm hình thái sinh lí vi khuẩn lam 1.1.2 Phân loại vi khuẩn lam 1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển vi khuẩn lam 1.2.1 Các nhân tố môi trường 1.2.2 Các yếu tố sinh học 1.2.3 Tác động hóa chất nơng nghiệp 1.3 Các vi khuẩn lam có khả cố định đạm 10 1.3.1 Đặc điểm vi khuẩn lam cố định đạm 10 1.3.2 Một số vi khuẩn lam cố định đạm 15 1.4 Sơ lược lúa 19 1.4.1 Nguồn gốc, đặc điểm yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng lúa 19 1.4.2 Sự phân bố trình cố định đạm vi khuẩn lam đất ruộng lúa 22 1.5 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn lam cố định đạm 23 1.5.1 Các nghiên cứu vi khuẩn lam cố định đạm giới 23 1.5.2 Các nghiên cứu vi khuẩn lam cố định đạm Việt Nam 24 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Phương tiện nghiên cứu 26 2.2 Phương pháp nghiên cứu 29 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quan 29 2.2.2 Thu thập mẫu 30 2.2.3 Phân lập vi khuẩn lam cố định đạm 30 2.2.4 Quan sát đặc điểm hình thái phân loại vi khuẩn lam cố định đạm 31 2.2.5 Khảo sát khả tăng trưởng chủng vi khuẩn lam môi trường không đạm 32 2.2.6 Khảo sát ảnh hưởng chủng vi khuẩn lam cố định đạm lên tăng trưởng lúa 34 2.2.7 Định danh vi khuẩn lam cố định đạm kỹ thuật sinh học phân tử 35 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 36 3.1 Kết phân lập các chủng vi khuẩn lam cố định đạm 36 3.2 Kết quan sát đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn lam phân lập 38 3.3 Kết khảo sát khả tăng trưởng các chủng vi khuẩn lam môi trường không đạm 43 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng các chủng vi khuẩn lam cố định đạm lên sự tăng trưởng lúa giai đoạn mạ non 44 3.5 Kết định danh vi khuẩn lam kỹ thuật sinh học phân tử 52 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC 61 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT IRRI International Rice Research Institute ĐC- Đối chứng âm ĐC+ Đối chứng dương N Nitơ NC Nước cất vi DANH MỤC HÌNH Hình 1 Chi vi khuẩn lam dạng sợi dạng đơn bào Hình Hai kiểu phân nhánh vi khuẩn lam dạng sợi Hình Vi khuẩn lam dạng sợi có dị bào bì bào tử quan sát kính hiển vi Hình Cấu trúc nitrogenase tạo PyMol 10 Hình Cấu trúc nitrogenase 11 Hình Các thành phần tương tác liên quan đến phản ứng thiếu nitơ kết hợp vi khuẩn lam 13 Hình Một số vi khuẩn lam cố định đạm 17 Hình Sơ đồ nghiên cứu tổng quan vi khuẩn lam cố định đạm lúa 29 Hình 2 Buồng đếm hồng cầu hãng Neubauer 33 Hình Kích thước ô buồng đếm 34 Hình Sinh khối vi khuẩn lam phát triển ruộng lúa điểm lấy mẫu 36 Hình Sự phát triển vi khuẩn lam đơn bào môi trường thạch 38 Hình 3 Sự phát triển vi khuẩn lam dạng sợi môi trường lỏng 39 Hình Mẫu vi khuẩn lam độ phóng đại 100 lần 41 Hình Sự tăng sinh khối chủng vi khuẩn lam EB1, EL1, EB2, EL2 sau 10, 20 30 ngày nuôi cấy 44 Hình Ảnh hưởng vi khuẩn lam lên chiều cao lúa giai đoạn mạ non 45 Hình Ảnh hưởng vi khuẩn lam lên chiều dài rễ lúa giai đoạn mạ non 46 Hình Ảnh hưởng vi khuẩn lam lên khối lượng lúa giai đoạn mạ non 47 Hình Ảnh hưởng vi khuẩn lam lên khối lượng rễ lúa giai đoạn mạ non 48 Hình 10 Cây lúa sau 10 ngày nghiệm thức 49 Hình 11 Cây lúa sau 10 ngày nghiệm thức EB1 50 Hình 12 Cây lúa sau 10 ngày nghiệm thức EL1 50 Hình 13 Cây lúa sau 10 ngày nghiệm thức EB2 51 vii Hình 14 Cây lúa sau 10 ngày nghiệm thức EL2 51 Hình 15 Trình tự vùng gene 16S rRNA chủng EB1 52 viii [60] “Giáo trình lúa – Nguyễn Ngọc Đệ - CẩmNangNôngNghiệp.com.” https://sites.google.com/a/st.hcmuaf.edu.vn/camnangnongnghiep-com/thu-vien-tailieu/khct/giao-trinh-cay-lua-nguyen-ngoc-de [61] Phát N V., “Đặc điểm thời kỳ sinh trưởng lúa, Nông Việt Phát,” Nông Việt Phát http://nongvietphat.com/huong-dan-ky-thuat-1/dac-diem-cac-thoi-ky-sinhtruong-cua-cay-lua-185.html [74] “Hemocytometer square size • Hemocytometer,” Hemocytometer, Apr 11, 2013 https://www.hemocytometer.org/hemocytometer-square-size [75] “Figure 13.26 Transplanting rice seedlings into paddies containing the ,” ResearchGate https://www.researchgate.net/figure/Transplanting-rice-seedlings-intopaddies-containing-the-floating-water-fern-Anabaena_fig14_299156145 [77] “IRMNG - Họ vi khuẩn lam J Komárek, J Kaštovský, J Mareš & JR Johansen, 2014.” https://www.irmng.org/aphia.php?p=taxdetails&id=119692 (accessed May 12, 2022) 60 PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: Hình ảnh thí nghiệm Hình Các mẫu đất thu thập từ ruộng lúa huyện Ea Súp Hình Vi khuẩn lam phát triển ống nghiệm sau tuần 61 Hình Dịng vi khuẩn lam dạng sợi EB1 nuôi môi trường không đạm BG11 từ trái qua mẫu lấy vào ngày 10, 20, 30 Hình Lọc sinh khối vi khuẩn lam dạng sợi chủng EB1 qua mốc 10, 20 30 ngày ni cấy 62 Hình Hạt lúa nảy mầm sau 48h ủ Hình Hạt lúa ngâm dịch vi khuẩn lam 63 Hình Hạt lúa cấy vào ống nghiệm (A), sau 10 ngày (B) cấy bình thủy canh (C) 64 PHỤ LỤC B: Số liệu thí nghiệm * Trích hệ thống khóa phân loại Desikachary cộng sửa đổi năm 2014 [77] Hình - Sơ đồ bậc họ vi khuẩn lam Đây ký tự phân loại quan trọng sử dụng để phân biệt chúng Sự phân tách đơn vị phân loại cao dựa kết sơ phân tích phát sinh lồi mơ hình siêu cấu trúc thylakoid 65 Hình Sơ đồ họ vi khuẩn lam dị bào (Nostocales) cấp bậc họ, đặc điểm quan trọng để xác định chúng 66 * Đặc điểm giống lúa IR64 Nguồn gốc: Giống lúa IR64 giống chọn lọc từ tập đoàn giống nhập nội Viện lúa Quốc tế (IRRI), lai tạo từ tổ hợp lai IR 5657-33/IR 2061-465 Được Bộ Nông nghiệp PTNT cơng nhận giống thức Quyết định số 402 QĐ/BNNKHCN, ngày 27/11/1986 Giống IR64 đưa vào thử nghiệm vùng lòng chảo Điện Biên từ năm 1986, mở rộng phát triển mạnh từ năm 1988 Đặc điểm sinh học hình thái giống lúa IR64: Thời gian sinh trưởng giống lúa IR64 từ 105-110 ngày (tính cho trà vụ mùa tỉnh phía Nam); Là giống gieo cấy trà Đông xuân sớm, vụ Hè thu miền Nam, vụ Xuân muộn vụ Mùa sớm Miền Bắc, vụ Hè thu miền Trung Là giống kháng cao với bệnh Đạo ôn, kháng với bệnh Bạc Nhiễm nhẹ với Rầy nâu Nhiễm vừa đến nặng với bệnh Khô vằn Chiều cao lúa: 95-105 cm Khả chống đổ trung bình, chịu phèn Đặc điểm chất lượng hạt thóc: Hình dáng hạt thóc: Hạt thon dài, màu vàng sáng, chiều dài hạt trung bình 7,19 mm Tỷ lệ chiều dài/chiều rộng hạt là: 3,34; trọng lượng 1000 hạt: 26-27 gram Chất lượng hạt gạo: Gạo trắng, không bạc bụng, cơm dẻo, ngon Hàm lượng amylose trung bình: 24,4% Năng suất trung bình: 45 - 50 tạ/ha Năng suất cao đạt: 60 – 65 tạ/ha 67 * Kết trình tự vùng gene 16S rRNA chủng EB1: Hình 10 Phiếu trả lời kết từ cơng ty Nam Khoa 68 Hình 11 Trình tự vùng gene 16S rRNA chủng EB1 69 Bảng Sinh khối trung bình chủng vi khuẩn lam dạng sợi sau 10, 20 30 ngày nuôi cấy Chủng STT vi khuẩn Sinh khối khô (g/100mL) lam Ngày 10 Ngày 20 Ngày 30 EB1 0,30 0,53 0,58 EL1 0,27 0,43 0,38 EB2 0,39 0,51 0,55 EL2 0,23 0,31 0,35 Các giá trị bảng trung bình lần lặp lại Bảng Số liệu sinh khối chủng vi khuẩn lam dạng sợi môi trường BG11 không đạm sau 10 ngày nuôi cấy Ngày 10 STT Chủng vi khuẩn Sinh khối khô (g/100 mL) lam Ban đầu Lần Lần Lần TB EB1 0,10 0,30 0,32 0,28 0,30 EL1 0,10 0,28 0,24 0,30 0,27 EB2 0,10 0,34 0,38 0,44 0,39 EL2 0,10 0,26 0,22 0,22 0,23 Bảng Số liệu sinh khối chủng vi khuẩn lam dạng sợi môi trường BG11 không đạm sau 20 ngày nuôi cấy Ngày 20 STT Chủng vi khuẩn Sinh khối khô (g/100 mL) lam Ban đầu Lần Lần Lần TB EB1 0,10 0,50 0,54 0,54 0,53 EL1 0,10 0,42 0,44 0,42 0,43 EB2 0,10 0,48 0,52 0,52 0,51 70 EL2 0,10 0,34 0,32 0,28 0,31 Bảng Số liệu sinh khối chủng vi khuẩn lam dạng sợi môi trường BG11 không đạm sau 30 ngày nuôi cấy Ngày 30 STT Chủng vi khuẩn Sinh khối khô (g/100 mL) lam Ban đầu Lần Lần Lần TB EB1 0,10 0,58 0,58 0,58 0,58 EL1 0,10 0,38 0,36 0,40 0,38 EB2 0,10 0,52 0,58 0,54 0,55 EL2 0,10 0,30 0,36 0,38 0,35 Bảng Ảnh hưởng chủng vi khuẩn lam dạng sợi lên chiều cao lúa chiều dài rễ lúa giai đoạn mạ non STT Chủng vi Chiều cao Chiều dài rễ khuẩn lam Lần Lần Lần TB Lần Lần Lần TB EB1 11,1 10,5 11,3 11,0 2,3 2,5 2,2 2,3 EB2 10,3 9,1 9,6 9,7 3,5 3,4 3,3 EL1 8,8 8,5 8,5 8,6 1,6 1,8 1,8 EL2 9,2 8,6 9,2 9,0 2,5 1,7 1,8 Bảng Ảnh hưởng chủng vi khuẩn lam dạng sợi lên khối lượng lúa khối lượng rễ lúa giai đoạn mạ non Chủng vi Khối lượng khuẩn lam Lần Lần Lần TB Lần Lần Lần TB EB1 75 73 79 75,7 15 19 21 18,3 EB2 63 63 73 66,3 18 15 19 17,3 STT Khối lượng rễ 71 EL1 66 67 64 65,7 17 17 16 16,7 EL2 58 60 55 57,7 16 15 13 14,7 PHỤ LỤC C: Kết phân tích thống kê Summary Statistics for Khoi luong 10 Bảng Thống kê tóm tắt mật số tế bào chủng vi khuẩn lam dạng sợi sau 10 ngày nuôi cấy Chủng vi khuẩn Count Average lam Standard Minimum Maximum Range deviation EB1 0,15 0,01 0,14 0,16 0,02 EB2 0,14 0,025166115 0,17 0,22 0,05 EL1 0,19 0,015275252 0,12 0,15 0,03 EL2 0,12 0,011547005 0,11 0,13 0,02 Bảng Phân tích ANOVA mật số tế bào chủng vi khuẩn lam dạng sợi sau 10 ngày nuôi cấy Source of Variation Between Groups Within Groups Total Sum of Squares df 0,00181 0,05547 0,05729 Mean Square F 0,00090 0,14736 0,00616 P-value 0,86502 11 Bảng Thống kê tóm tắt mật số tế bào chủng vi khuẩn lam dạng sợi sau 20 ngày nuôi cấy Chủng vi khuẩn Count lam Average Standard deviation 72 Minimum Maximum Range EB1 0,26 0,011547005 0,25 0,27 0,02 EB2 0,25 0,011547005 0,24 0,26 0,02 EL1 0,21 0,005773503 0,21 0,22 0,01 EL2 0,16 0,015275252 0,14 0,17 0,03 Bảng 10 Phân tích ANOVA mật số tế bào chủng vi khuẩn lam dạng sợi sau 20 ngày nuôi cấy Source of Variation Between Groups Within Groups Sum of Squares df 6,66667E-05 0,0477 Total 0,047766667 Mean Square F P-value 3,33333E-05 0,006289308 0,993734792 0,0053 11 Bảng 11 Thống kê tóm tắt mật số tế bào chủng vi khuẩn lam dạng sợi sau 20 ngày nuôi cấy Chủng vi khuẩn Count Average lam Standard Minimum Maximum Range deviation EB1 0,29 0,29 0,29 EL1 0,19 0,01 0,18 0,2 0,02 EB2 0,27 0,015275252 0,26 0,29 0,03 EL2 0,17 0,02081666 0,19 0,04 0,15 Bảng 12 Phân tích ANOVA mật số tế bào chủng vi khuẩn lam dạng sợi sau 30 ngày nuôi cấy Source of Variation Between Groups Within Groups Sum of Squares df 0,000116667 0,149775 Total 0,149891667 Mean Square F P-value 5,83333E-05 0,003505258 0,996502238 0,016641667 11 73 74 ... I Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lam có khả cố định đạm thử nghiệm lúa giai đoạn mạ non NHIỆM VỤ LUẬN VĂN II - Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn lam tạo thư vi? ??n vi khuẩn lam có khả cố định đạm. .. lam có khả cố định đạm thử nghiệm lúa giai đoạn mạ non? ?? thực để tìm chủng vi khuẩn lam có khả cố định đạm cao Với nội dung gồm: ➢ Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn lam có khả cố định đạm ➢ Bước... NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LAM CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM VÀ THỬ NGHIỆM TRÊN CÂY LÚA GIAI ĐOẠN MẠ NON Sinh vi? ?n thực hiện : Nguyễn Tấn Thiên Long Mã số sinh vi? ?n : 1712020 Giáo vi? ?n