PHÂN lập và TUYỂN CHỌN các CHỦNG VI KHUẨN có HOẠT TÍNH CAO TRONG QUÁ TRÌNH lên MEN CHƢỢP mắm cát hải

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VIỆN CN SINH HỌC & CN THỰC PHẨM NGUYỄN THỊ NGÂN HÀ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH CAO TRONG Q TRÌNH LÊN MEN CHƢỢP MẮM CÁT HẢI LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Hà Nội – Năm 2017 TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VIỆN CN SINH HỌC & CN THỰC PHẨM NGUYỄN THỊ NGÂN HÀ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CĨ HOẠT TÍNH CAO TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN CHƢỢP MẮM CÁT HẢI Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã số: 15BCNTP-06 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC : TS Bùi Thị Thu Hiền PGS TS Khuất Hữu Thanh Hà Nội – Năm 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chƣa đƣợc sử dụng Tôi xin cam đoan, thơng tin đƣợc trích dẫn luận văn đƣợc ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 18 tháng năm 2017 Ngƣời viết báo cáo Nguyễn Thị Ngân Hà I LỜI CẢM ƠN Trong thời gian làm luận văn tốt nghiệp, nỗ lực thân, nhận đƣợc giúp đỡ tận tình gia đình, thầy giáo bạn bè, đồng nghiệp Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Bùi Thị Thu Hiền, Trƣởng phịng Nghiên cứu Cơng nghệ Sau thu hoạch, Viện Nghiên cứu Hải sản PGS.TS Khuất Hữu Thanh, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội truyền cho kiến thức, kinh nghiệm quý báu tận tình hƣớng dẫn tơi suốt q trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn cán phịng Nghiên cứu Cơng nghệ Sau thu hoạch, Viện Nghiên cứu Hải sản giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài Tôi xin dành dòng cuối để cảm ơn bố mẹ, chồng ngƣời thân gia đình dành thời gian cho tơi, thay tơi làm cơng việc gia đình động viên yên tâm học tập, công tác Tôi dành trân trọng với bạn bè, đồng nghiệp bên lúc khó khăn để vƣơn lên học tập, cơng tác tạo điều kiện tốt cho thời gian thực luận văn Hà Nội, ngày 18 tháng năm 2017 Ngƣời viết báo cáo Nguyễn Thị Ngân Hà II MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT VI DANH MỤC CÁC BẢNG VII DANH MỤC HÌNH VIII MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN 1.1 KHÁI QUÁT VỀ NƢỚC MẮM 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Các loại nƣớc mắm 1.1.3 Đặc điểm chung nƣớc mắm 1.2 NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT NƢỚC MẮM 1.2.1 Cá 1.2.2 Nƣớc 12 1.2.3 Muối 12 1.2.4 Enzyme protease 13 1.3 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT NƢỚC MẮM TỪ CÁ Ở CÁT HẢI 16 1.3.1 hái quát công nghệ sản xuất nƣớc mắm Cát Hải 16 1.3.2 Quy trình sản xuất 17 1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ LĨNH VỰC SẢN XUẤT NƢỚC MẮM TỪ CÁ… 22 1.4.1 Nghiên cứu bổ sung protease sản xuất nƣớc mắm 22 1.4.2 Nghiên cứu tạo hƣơng nhờ vi sinh vật sản xuất nƣớc mắm 24 1.5 VAI TRÕ CỦA VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT NƢỚC MẮM 25 1.6 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN CHẤT LƢỢNG NƢỚC MẮM 27 1.6.1 Ảnh hƣởng độ muối .27 1.6.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ 28 1.6.3 Ảnh hƣởng pH 28 1.6.4 Ảnh hƣởng nồng độ chất 28 III 1.6.5 Ảnh hƣởng diện tích tiếp xúc 28 1.6.6 Ảnh hƣởng chất hoạt hoá .29 CHƢƠNG - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .30 2.1 NGUYÊN LIỆU 30 2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 30 2.2.1 Hóa chất 30 2.2.2 Thiết bị dùng nghiên cứu 30 2.3 MÔI TRƢỜNG PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY VI SINH VẬT 31 2.4 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.4.1 Định lƣợng phân lập vi khuẩn hiếu khí tổng số .31 2.4.2 Sàng lọc chủng vi khuẩn chịu mặn có hoạt t nh protease định t nh … .32 2.4.3 Sàng lọc chủng vi khuẩn có khả sinh hƣơng định t nh 32 2.4.4 Giải trình tự đoạn ARNr 16S 33 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 SỰ BIẾN ĐỘNG MẬT ĐỘ VI HUẨN Ở CHƢỢP MẮM TRONG CÁC GIAI ĐOẠN LÊN MEN HÁC NHAU .35 3.2 TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI HUẨN CHỊU MẶN CĨ HOẠT TÍNH CAO .39 3.2.1 Sàng lọc chủng vi khuẩn chịu mặn có hoạt t nh protease chƣợp lên men nƣớc mắm 39 3.2.2 Sàng lọc chủng vi khuẩn yếm kh chịu mặm có khả sinh hƣơng chƣợp lên men nƣớc mắm .41 3.2.3 Định tên đến loài chủng vi khuẩn chịu mặn có hoạt t nh cao phân lập đƣợc từ chƣợp lên men nƣớc mắm kỹ thuật phân tử 42 NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA CÁC ĐIỀU IỆN NUÔI CẤY TỚI HẢ NĂNG SINH TRƢỞNG CỦA CÁC CHỦNG VI HUẨN M1, M2, H10 3.3 VÀ H12 49 3.3.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ .49 3.3.2 Ảnh hƣởng pH .50 IV 3.3.3 3.4 Khảo sát đặc tính chịu mặn chủng vi khuẩn 50 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CHẾ PHẨM VI SINH SỬ DỤNG TRONG SẢN XUẤT NƢỚC MẮM TỪ CÁC CHỦNG VI HUẨN M1 VÀ H12 51 3.4.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ sấy chế phẩm 51 3.4.2 Nghiên cứu điều kiện bảo quản chế phẩm 52 KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 V DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT VK Vi khuẩn g/l Gam/lít Naa Nito acid amin Nts Nito tổng số TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam CH Cát Hải Môi trƣờng NA Môi trƣờng Nutrient Agar Môi trƣờng MRS Môi trƣờng De Man, Rogosa and Sharpe CFU/ gram Tổng số khuẩn lạc / gam CT Công thức VI DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Tên loại nƣớc mắm tỷ lệ phối trộn tạo sản phẩm cá nƣớc khác .3 Bảng 1.2: Hàm lƣợng axit amin nƣớc mắm mg ml Bảng 1.3: Thành phần chất bay nƣớc mắm Bảng 1.4: Thành phần hóa học cá 10 Bảng 1.5 Thành phần hóa học cá biển .10 Bảng 1.6: Các acid amin chủ yếu % protein khác 12 Bảng 1.7: Yêu cầu cảm quan nƣớc mắm 20 Bảng 1.8: Các tiêu hóa học nƣớc mắm 21 Bảng 1.9: Chỉ tiêu vi sinh nƣớc mắm 21 Bảng 3.1: Số lƣợng loại khuẩn lạc quan sát môi trƣờng NA NaCl MRS 25% 25% NaCl .39 Bảng 3.2: Một số chủng vi khuẩn có hoạt t nh protease cao 41 Bảng 3.3: Đánh giá cảm quan mẫu nghiên cứu 42 Bảng 3.4: Đánh giá chất lƣợng chế phẩm vi sinh sử dụng sản xuất nƣớc mắm sau bảo quản 53 VII DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Quy trình sản xuất nƣớc mắm Cát Hải – Hải Phịng 19 Hình 3.1: Sự biến động mật độ vi khuẩn hiếu kh mẫu chƣợp giai đoạn lên men khác môi trƣờng NA môi trƣờng NA 25% NaCl 36 Hình 3.2: Sự biến động mật độ vi khuẩn hiếu kh mẫu chƣợp giai đoạn lên men khác môi trƣờng MRS môi trƣờng MRS 25% NaCl 37 Hình 3.3: Hình ảnh số lƣợng loại khuẩn lạc vi khuẩn hiếu kh mọc mơi trƣờng NA 25% NaCl Hình ảnh chụp từ c ng nồng độ pha loãng mẫu chƣợp lên men tháng A chƣợp lên men tháng 12 B 38 Hình 3.4: sinh protease 87 chủng vi khuẩn phân lập từ chƣợp mắm 40 Hình 3.5: sinh protease số chủng vi khuẩn hoạt t nh cao 40 Hình 3.6: Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa 16S rARN từ ADN tổng số 43 Hình 3.7: huẩn lạc tế bào chủng M1 huẩn lạc chụp sau 48 nuôi cấy, tế bào chụp sau 24 nuôi cấy 44 Hình 3.8: huẩn lạc tế bào chủng M2 huẩn lạc chụp sau 48 nuôi cấy, tế bào chụp sau 24 nuôi cấy 45 Hình 3.9: Cây phát sinh chủng loại chủng M1 M2 loài vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus amyloliquefaciens xây dựng dựa đoạn gene 16S rRNA 46 Hình 3.10: huẩn lạc tế bào chủng H12 47 Hình 3.11: Cây phát sinh chủng loại chủng H12 với lồi có quan hệ họ hàng gần chi Lysinibacillus dựa vào trình tự gen rRNA 16S…………… …… 48 Hình 3.12: Ảnh hƣởng pH đến sinh trƣởng chủng vi khuẩn 50 Hình 3.13: chịu mặn chủng vi khuẩn 51 Hình 3.14: Ảnh hƣởng nhiệt độ sấy đến khả sống sót tế bào chế phẩm sau sấy .52 VIII nƣớc mắm theo cấp để lựa chọn chủng vi khuẩn có khả sinh hƣơng số phiếu đánh giá 10 ết nghiên cứu sàng lọc chủng vi khuẩn có khả sinh hƣơng trình lên men chƣợp mắm đƣợc trình bày Bảng 3.3 ảng Đánh giá cảm quan mẫu nghiên cứu Mẫu M i Điểm đánh giá sản phẩm Đối No1 Sản phẩm có chứng Trung No2 No3 No4 No5 No6 No7 bình 0 0 0 2 2 2,14 3 3 3 3,0 3 3 3,4 m i hôi thối (H0) M i thơm nhẹ H5 nƣớc mắm, có m i lạ M i thơm nhẹ H10 nƣớc mắm M i thơm nhẹ H12 nƣớc mắm Từ kết nghiên cứu thu đƣợc, lựa chọn chủng vi khuẩn có khả tạo hƣơng cho nƣớc mắm chủng H10 chủng H12 cho nghiên cứu 3.2.3 Định tên đến loài chủng vi khuẩn chịu mặn có hoạt tính cao phân lập đƣợc t chƣợp lên men nƣớc mắm ng k thuật phân t Định tên đến loài chủng vi sinh vật để lựa chọn đƣợc chủng vi khuẩn có hoạt tính cao, an tồn với ngƣời động vật Từ đó, lựa chọn chủng vi khuẩn chịu mặn có hoạt t nh enzyme protease cao, khả tạo hƣơng tốt, góp phần rút ngắn thời gian sản xuất nƣớc mắm, nâng cao m i hƣơng đặc trƣng chất lƣợng nƣớc mắm 42 Căn vào kết định tên đến loài để loại bỏ đƣợc chủng vi khuẩn có hoạt tính enzyme cao thuộc nhóm vi sinh vật có hại, khơng đƣợc phép sử dụng nuôi trồng thủy sản Trên cở sở phân loại sơ hình thái khuẩn lạc, đặc điểm sinh hóa với kít API 20E, API 50CHB Các chủng vi khuẩn probiotic lựa chọn đƣợc tiếp tục định tên đến loài kỹ thuật phân tử Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu, nhân đƣợc đoạn 16S rARN chủng vi khuẩn tuyển chọn Phân tích trình tự gen 16S rARN chủng vi khuẩn nghiên cứu, so với trình tự đoạn 16S rARN GenBank, chƣơng trình BLAST NCBI cho thấy chủng vi khuẩn nghiên cứu có độ tƣơng đồng cao đoạn 16S rARN nhiều loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus chi Lactobacillus Hình 3.6 Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa 16S rARN từ ADN tổng số Trình tự đoạn gen 6S rARN chủng M - Chủng M1 tƣơng đồng 99% với chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens subsp amyloliquefaciens MN 01 - Chủng M2 tƣơng đồng 99% với chủng vi khuẩn Bacillus subtilis strain DSM 10 (NR 027552.1) - Chủng H10 tƣơng đồng 98% với Lysinibacillus paraplantarum - Chủng H12 tƣơng đồng 99% với Lysinibacillus pakistanensis MN 21 43 a) Chủng vi khuẩn M1 Hình thái + Khuẩn lạc: Sau ngày nuôi cấy môi trƣờng NA 0,5% NaCl, khuẩn lạc có hình dạng khơng xác định, dẹt, màu trắng đục, bề mặt không nhẵn khơng bóng, mép khuẩn lạc dạng tua, k ch thƣớc 1,5 – mm + Tế bào: Sau ngày nuôi cấy môi trƣờng NA 0,5% NaCl, tế bào có dạng hình que, tồn đơn lẻ, k ch thƣớc (0,5-0,6) x (2-2,5) µm Đặc điểm sinh hóa: Chủng M1 có khả đồng hóa tốt 17 loại đƣờng glycerol, D - glucose, D - fructose, inositol, D - mannitol, D - sorbitol, N acetylglucosamine, amygdalin, arbutin, esculin, salicin, D - cellobiose, D - maltose, sucrose, D - trehalose, amidon (tinh bột), glycogen gentiobiose; L - arabinose, D - ribose, D – xylose D - lactose; lên men 21 loại đƣờng tổng số 49 loại đƣờng thử nghiệm để tạo thành axit glycerol, L - arabinose, D - ribose, D xylose, D - glucose, D - fructose, inositol, D - mannitol, D - sorbitol, N acetylglucosamine, amygdalin, arbutin, esculin, salicin, D - cellobiose, D - maltose, D - lactose, sucrose, D - trehalose, D -raffinose, amidon (tinh bột), glycogen gentiobiose Chủng M1 sinh trƣởng tốt giải nhiệt độ 25oC - 50oC với khoảng nhiệt độ tối ƣu 35oC - 45oC; pH 5,0 - 9,0 với pH tối ƣu 7,0; nồng độ NaCl 1,0 12,0% Trên thử API ZYM, chủng M1 có khả sinh esterase C , esterase lipase C , lipase C 14 , acid phosphatase α - glucosidase Hình 3.7 Khuẩn lạc tế bào chủng M1 Khuẩn lạc chụp sau 48 nuôi c y, tế bào chụp sau 24 ni c y 44 b) Chủng vi khuẩn M2 Hình thái + Khuẩn lạc: Sau ngày nuôi cấy mơi trƣờng NA 0,5% NaCl, khuẩn lạc có hình dạng không xác định, dẹt, màu trắng đục, bề mặt xù xì, mép khuẩn lạc xẻ thùy lớn, k ch thƣớc 1,5 – 2,5 mm + Tế bào: Sau ngày nuôi cấy môi trƣờng NA 0,5% NaCl, tế bào có dạng hình que, đơn lẻ, k ch thƣớc (0,7-1) x (2-2,8) µm Đặc điểm sinh hóa: Chủng M2 có khả đồng hóa tốt 19 loại đƣờng glycerol, D - glucose, D - fructose, inositol, D - mannitol, D - sorbitol, methyl - αD glucopyranoside, N - acetylglucosamine, amygdalin, arbutin, esculin, salicin, D cellobiose, D - maltose, sucrose, D - trehalose, amidon (tinh bột), glycogen gentiobiose; đồng hóa yếu L - arabinose, D - ribose, D - xylose, D - lactose potassium - ketogluconate; lên men 24 loại đƣờng tổng số 49 loại đƣờng thử nghiệm để tạo thành axit glycerol, L - arabinose, D - ribose, D - xylose, D glucose, D - fructose, inositol, D - mannitol, D - sorbitol, methyl - αD glucopyranoside, N - acetylglucosamine, amygdalin, arbutin, esculin, salicin, D cellobiose, D - maltose, D - lactose, sucrose, D - trehalose, D -raffinose, amidon (tinh bột), glycogen gentiobiose Chủng M2 sinh trƣởng tốt giải nhiệt độ 20oC - 55oC với khoảng nhiệt độ tối ƣu 35oC - 45oC; pH 5,0 - 8,0 với pH tối ƣu 6,0; nồng độ NaCl 1,0 7,0% Trên thử API ZYM, chủng M2 có khả sinh esterase C4 , esterase lipase (C8), lipase (C14), acid phosphatase, naphthol-AS-BI-phosphohydrolase α - glucosidase Hình 3.8 Khuẩn lạc tế bào chủng M2 Khuẩn lạc chụp sau 48 nuôi c y, tế bào chụp sau 24 nuôi c y 45 Hai chủng vi khuẩn M1 M2 đƣợc phân loại dựa phƣơng phƣơng pháp sinh học phân tử Kết đọc trình tự, phân tích dựng phát sinh chủng loại dựa trình tự đoạn gen ARNr 16S cho thấy chủng M1 tƣơng đồng 99,5% với B.amyloliquefaciens subsp plantarum Tikusei-14-1 đoạn gen ARNr 16S; chủng M2 tƣơng đồng 99,8% với Bacillus amyloliquefaciens subsp B subtilis subsp subtilis NRRL NRS-744 0.05 92 B subtilis subsp inaquosorum NRRL B-23052 B subtilis subsp spizizenii NRRL B-23049 100 B tequilensis NRRL B-41771 93 B vallismortis NRRL B-14890 100 B mojavensis NRRL B-14698 B atrophaeus NRRL NRS-213 100 B amyloliquefaciens subsp plantarum NRRL B-23189 B amyloliquefaciens subsp plantarum NRRL B-23190 55 B amyloliquefaciens subsp plantarum NRRL BD-621 82 B amyloliquefaciens subsp plantarum FZB42 60 B amyloliquefaciens subsp plantarum Mito-5-13 100 100 100 B amyloliquefaciens subsp plantarum Mito-7-4 B amyloliquefaciens subsp plantarum Tikusei-14-1 M1 B amyloliquefaciens subsp plantarum Hitachioomiya-8-2 B amyloliquefaciens subsp plantarum NRRL BD-557 B amyloliquefaciens subsp plantarum NRRL BD-545 100 100 B amyloliquefaciens subsp plantarum NRRL B-41580 B amyloliquefaciens subsp plantarum strain NRRL B-4257 B amyloliquefaciens subsp plantarum NRRL BD-569 B amyloliquefaciens subsp plantarum NRRL BD-568 B amyloliquefaciens subsp amyloliquefaciens NRRL BD-601 100 100 M2 B amyloliquefaciens subsp amyloliquefaciens NRRL B-14393 B licheniformis DSM 13 B sonorensis NRRL B-23154 B pumilus NRRL NRS-272 B cereus ATCC 14579 Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loại chủng M1 M2 lồi vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus amyloliquefaciens xây dựng dựa đoạn gene 16S rRNA (Roney, 2009; Kubo, 2011) 46 c) Chủng vi khuẩn H12 - Mô tả đặc điểm sinh lý, sinh hoá: + Khuẩn lạc: Khuẩn lạc có k ch thƣớc - mm, màu trắng ngà non đến vàng nhạt già, khơng có hình dạng xác định, mép cƣa nhỏ, khuẩn lạc dẹt, bề mặt nhẵn đến gợn hạt, bóng ni cấy mơi trƣờng NA 28oC + Tế bào: Tế bào dạng que, hiếu kh , di động, gram dƣơng, k ch thƣớc (0,1-0,2) x (2-4) µm, tồn riêng lẻ đám Tế bào phát triển dải nhiệt 10-45ºC (nhiệt độ tối ƣu 28ºC , pH 6.09.0 (pH tối ƣu 7.0 tồn mơi trƣờng chứa 0-6% NaCl Phản ứng catalase dƣơng t nh, có khả đồng hố nitrat, phản ứng oxidase âm tính, khơng sinh acid Hình 3.10 Khuẩn lạc tế bào chủng H12 47 Lysinibacillus tabacifolii K3514 (JQ754706) 99 0.01 82 99 Lysinibacillus varians GY32 (JN860068) Lysinibacillus sphaericus KCTC 3346 (AUOZ01000024) Lysinibacillus mangiferihumi M-GX18 (JF731238) 58 Lysinibacillus fusiformis NBRC 15717 (AB271743) Lysinibacillus contaminans FSt3A (KC254732) 94 Lysinibacillus parviboronicapiens BAM-582 (AB300598) Lysinibacillus xylanilyticus XDB9 (FJ477040) 100 H12 96 Lysinibacillus pakistanensis NCCP-54 (AB558495) 79 Lysinibacillus macroides LMG 18474 (AJ628749) 81 Lysinibacillus boronitolerans T-10a (AB199591) Lysinibacillus odysseyi 34hs-1 (AF526913) Bacillus cecembensis PN5 (AM773821) Lysinibacillus alkaliphilus OMN17 (KF771256) 99 Lysinibacillus composti NCCP-36 (AB547124) Lysinibacillus sinduriensis BLB-1 (FJ169465) 99 85 68 Lysinibacillus chungkukjangi 2RL3-2 (JX217747) Lysinibacillus halotolerans LAM612 (KF443809) 77 Lysinibacillus massiliensis 4400831 (AY677116) 98 81 Lysinibacillus manganicus Mn1-7 (JX993821) Lysinibacillus acetophenoni JC23 (FN179488) Lysinibacillus meyeri WS 4626 (HE577173) Bacillus subtilis IAM 12118 (AB 042061) Hình 3.11 Cây phát sinh chủng loại chủng H12 với lồi có quan hệ họ hàng g n chi Lysinibacillus dựa vào trình tự gen rRNA 16S 48 3.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy tới khả trƣởng chủng vi khuẩn M1, M2, H10 H12 Mục đ ch nghiên cứu tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn có hoạt t nh protease cao, nhằm ứng dụng rút ngắn thời gian sản xuất nuớc mắm Mặt khác tìm kiếm chủng vi khuẩn có khả sinh hƣơng tốt, làm tăng chất lƣợng nƣớc mắm Chúng tiến hành nghiên cứu điều kiện sinh trƣởng thích hợp, để thu sinh khối với khối lƣợng cao nhất, nhằm tạo đƣợc chế phẩm vi sinh vật ứng dụng hiệu sản xuất nƣớc mắm 3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ Nhiệt độ yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến phát triển thời gian thu sinh khối vi khuẩn Ở nhiệt độ thấp kéo dài thời gian sinh trƣởng kéo dài thời gian thu sinh khối Cịn nhiệt độ cao chủng bị ức chế Với mục đ ch thu sinh khối lớn thời gian ngắn ta cần tìm nhiệt độ tối thích cho chủng phát triển Các chủng vi khuẩn nghiên cứu với dải nhiệt độ đƣợc khảo sát là: 20; 30; 40; 50 550C Hai chủng M1 M2 đƣợc lên men môi trƣờng NA 25% NaCl; Hai chủng H10 H12 lên men với môi trƣờng MRS + 25% NaCl Khả sinh trƣởng chủng vi khuẩn đƣợc kiểm tra 32 giờ, phƣơng pháp đo mật độ quang OD 620nm Cứ lấy mẫu đo lần Kết đƣợc thể hình 3.11 Hình 3.11 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng chủng vi khuẩn 49 Từ hình 3.11 cho thấy, nhiệt độ ảnh hƣởng không nhiều đến trình sinh trƣởng hai chủng M1 M2 Nhiệt độ tối ƣu cho phát triển M1 M2 khoảng 40 - 400C Chủng H10 có nhiệt độ tối ƣu 300C., Chủng H12 tối ƣu nhiệt độ 400C Sau nhiệt độ thích hợp cho chủng phát triển Từ kết nghiên cứu cho thấy chủng vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn ƣa ấm 3.3.2 Ảnh hưởng p Nghiên cứu ảnh hƣởng pH đến phát triển chủng M1, M2, H10 H12 nhiệt độ 400C Hai chủng M1 M2 đƣợc lên men môi trƣờng NA 25% NaCl; Hai chủng H10 H12 lên men với môi trƣờng MRS + 25% NaCl Dải pH đƣợc khảo sát từ – 8, 32 nuôi cấy Cứ lấy mẫu đo OD lần Kết nghiên cứu thu đƣợc hình 3.12 Hình 3.12 Ảnh hưởng p đến sinh trưởng chủng vi khuẩn Số liệu hình 3.12 cho thấy, pH ảnh hƣởng lớn đến trình sinh trƣởng chủng M1, M2, H10 H12 Chủng M1 M2 phát triển tốt pH 7,5 Ở pH, 6,0 pH > 8,0 hai chủng M1 M2 sinh trƣởng Ngƣợc lại, chủng H10 H11 thích hợp với khoảng pH = 5,0 – 6,0 Ở pH 6,0 hai chủng H10 H12 phát triển 3.3.3 Khảo sát đặc tính chịu mặn chủng vi khuẩn Để nghiên cứu tạo đƣợc chế phẩm vi sinh vật ứng dụng sản xuất nƣớc mắm, nghiên cứu khả chịu mặn chủng vi khuẩn đóng vai trị 50 quan trọng Chúng tơi nghiên cứu nghiên cứu khả chịu mặn chủng vi khuẩn M1, M2, H10 H12 nhiệt độ 400C Hai chủng M1 M2 đƣợc lên men môi trƣờng NA + 25% NaCl; pH =7,5; Hai chủng H10 H12 lên men với môi trƣờng MRS + 25% NaCl; pH =6,0 Kết thu đƣợc đƣợc thể hình 3.13 Hình 3.13 Khả chịu mặn chủng vi khuẩn Từ kết nghiên cứu hình 3.13 cho thấy khả sinh trƣởng chủng chịu ảnh hƣởng lớn độ mặn Các chủng vi khuẩn M1, M2, H10 H12 có khả sinh trƣởng tốt độ mặn môi trƣờng 5-20% NaCl Ở độ mặn 25% NaCl chủng phát triển tƣơng đối tốt Sự phát triển chủng giảm độ mặn môi trƣờng 30% NaCl 3.4 Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh s dụng sản xuất nƣớc mắm t chủng vi khuẩn M1 H12 Từ kết nghiên cứu thu đƣợc lựa chọn chủng M1 chủng H12 để thử nghiệm tạo chế phẩm vi sinh sản xuất nƣớc mắm, nhằm rút ngắn thời gian sản xuất, tăng m i hƣơng đặc trƣng chất lƣợng nƣớc mắm 3.4.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ sấy chế phẩm Chủng M1 (Bacillus amyloliquefaciens subsp amyloliquefaciens MN 01) đƣợc lên men môi trƣờng NA + 25% NaCl; pH =7,5 Chủng H12 (Lysinibacillus pakistanensis MN 21 đƣợc lên men môi trƣờng MRS + 25% 51 NaCl; pH = 6,0 Sau 32h mi cấy, ly tâm tốc độ 4.000 vịng phút 10 phút, thu sinh khối Trộn sinh khối với loại chất mang gồm 50% bột ngô, 50% cám) Tỷ lệ phối trộn sinh khối: chất mang; Tạo độ ẩm 60%, ủ 24h, thu đƣợc chế phẩm thô M1 H12 Trộn sinh khối M1 sinh khối H12 theo tỷ lệ 1: 1, sau đem sấy chế phẩm mức nhiệt độ khác nhau: 30oC, 36oC, 41oC 50oC máy sấy bơm nhiệt, thời gian sấy chế phẩm 3,0 h Hình 3.14 Ảnh hưởng nhiệt độ s đến khả sống sót tế bào chế phẩm sau s y Số liệu thu đƣợc bảng 3.14, cho thấy chế phẩm sấy nhiệt độ 30oC có tỷ lệ tế bào sống sót sau sấy đạt cao 52,3% , nhƣng chế phẩm sau sấy chƣa đảm bảo độ khô cần thiết (sau sấy độ ẩm chế phẩm mức 11.2%) Ở nhiệt độ sấy 50oC, chế phẩm có tỷ lệ tế bào sống sót đạt thấp (28,5%), nhiệt độ sấy 36oC 41oC cho tỷ lệ tế bào sống sót đạt 49,5% 48,4% xấp xỉ (hình 3.14) Chúng lựa chọn nhiệt độ sấy chế phẩm 41oC 3.4.2 Nghiên cứu điều kiện ảo quản chế phẩm Chế phẩm vi sinh sử dụng sản xuất nƣớc mắm từ chủng vi khuẩn M1 H12 đƣợc kiểm tra tỷ lệ tế bào sống sót sau 3, tháng với điều kiện bảo quản khác nhau: bảo quản chỗ râm mát không bị chiếu sáng trực tiếp (nhiệt độ phòng), bảo quản tủ lạnh 40C bảo quản chỗ bị chiếu ánh nắng 52 Bảng Đánh giá ch t lượng chế phẩm vi sinh s dụng sản u t nước mắm sau ảo quản Mật độ tế Phƣơng pháp ảo quản Mật độ tế bào sống sót (CFU/g) an đầu sau thời gian bảo quản (CFU/g) Bảo quản chỗ râm 2,2 x 109 mát, nhiệt độ phòng (100%) Bảo quản chỗ bị 2,2 x 109 chiếu nắng (100%) Bảo quản tủ lạnh 2,2 x 109 40 C (100%) tháng tháng Mật độ % Mật độ 1,7 x 109 77,27 1,3 x 109 59,10 1,3 x 109 59,10 0,9 x 109 40,90 2,0 x 109 90,10 1,8 x 109 81,18 % Số liệu nghiên cứu thu đƣợc trình bày bảng 3.4 cho thấy thời gian bảo quản dài, tỷ lệ sống tế bào vi khuẩn chế phẩm giảm Chế phẩm vi sinh sử dụng sản xuất nƣớc mắm bảo quản tủ lạnh 40C, sau tháng tháng giữ đƣợc chất lƣợng tốt Bảo quản chế phẩm chỗ râm mát, nhiệt độ phòng sau tháng giữ đƣợc mật độ tế bào sống tƣơng đối cao (59,10%) Bảo quản chế phẩm chỗ bị chiếu sáng trực tiếp, mật độ tế bào chế phẩm giảm nhanh: sau tháng 40,90 % Bảo quản chế phẩm trong tủ lạnh 40C có chất lƣợng tốt Tuy nhiên, hình thức bảo quản khơng thích hợp thực ti n sản xuất, tiêu tốn điện chi phí kho lạnh Chúng lựa chọn phƣơng pháp bảo quản chỗ râm mát (nhiệt độ phòng) tránh ánh sáng mặt trời, phƣơng pháp bảo quản phù hợp thực ti n sản xuất 53 KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ Trong trình lên men, chƣợp mắm mật độ vi khuẩn biến động theo thời gian Mật độ vi khuẩn cao tháng thứ đạt 4,3 x 10 ; chƣợp mắm tháng thứ 11 12 có mật độ vi khuẩn thấp khoảng 2,5 x 10 Ở tháng 2, 3, 4, 5, 7, 10 mật độ vi khuẩn khoảng 104 CFU gram chƣợp Từ giai đoạn khác phân lập đƣợc 60 chủng vi khuẩn hiếu kh , 27 chủng vi khuẩn yếm kh Có 7/87 chủng có khả sinh protease cao (8,05%); 44/87 chủng sinh protease yếu (50,57%); 6/87 chủng khơng có hoạt tính protease chiếm 6,89% Đã tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn có hoạt t nh protease cao M1 M2, 02 chủng vi khuẩn có khả làm tăng m i hƣơng đặc trƣng nƣớc mắm k hiệu H10 H12 Đã định danh đến loài kỹ thuật phân tử 04 chủng vi khuẩn đƣợc lựa chọn: + Chủng M1 tƣơng đồng 99% với chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens subsp amyloliquefaciens MN 01 + Chủng M2 tƣơng đồng 99% với chủng vi khuẩn Bacillus subtilis strain DSM 10 (NR 027552.1); + Chủng H10 tƣơng đồng 98% với Rummeliibacillus stabekissi MN 15 + Chủng H12 tƣơng đồng 99% với Lysinibacillus pakistanensis MN 21 Đã khảo sát số yếu tố ảnh hƣởng ch nh đến sinh trƣởng chủng: nhiệt độ, độ pH khả chịu độ mặn Đã thử nghiệm tạo chế phẩm điều kiện bảo quản chế phẩm vi sinh sử dụng sản xuất nƣớc mắm từ chủng vi khuẩn M1 H12 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Vũ Ngọc Bội (2004), Nghiên cứu trình thủy phân protein cá enzym protease từ Bac.subtilis 5S, Luận án tiến sĩ sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Tp Hồ Chí Minh Nguy n Văn Canh 1980 , Chế biến nước mắm, Nxb Khoa học kỹ thuật Nguy n Trọng Cẩn, Đỗ Minh Phụng (1990), Công nghệ chế biến thực phẩm thủy sản, Tập I, Nxb Nơng nghiệp, Tp Hồ Chí Minh Nguy n Trọng Cẩn, Đỗ Minh Phụng (1990), Công nghệ chế biến thực phẩm thủy sản, Tập II, Nxb Nơng nghiệp, Tp Hồ Chí Minh Phạm Thị Trân Châu, Nguy n Lân Dũng 1993 , Những hiểu biết enzyme, Nxb Khoa học Kỹ thuật Lƣơng Hữu Đồng (1981), Một số sản phẩm chế biến từ cá hải sản khác, Nxb Nông nghiệp Nguy n Lân Dũng cs (1964), Nghiên cứu ứng dụng Protease từ nấm mốc A Oryzae để rút ngắn thời gian sản xuất nước mắm Báo cáo tổng kết đề tài Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội Đặng Văn Hợp cs (2000), Luận án Tiến sỹ “Nghiên cứu hồn thiện cơng nghệ chiết xuất proteaza từ Asp.oryzae ứng dụng vào sản xuất nước mắm” Đại học Thủy Sản Nha Trang Nguy n Văn Lệ cs (1975), Nghiên cứu bổ sung Protease ngồi bào Bacillus pumillus vào q trình sản xuất nước mắm Viện nghiên cứu Hải sản 10 Lê Văn Việt Mẫn, Trần Quốc Hiền 2006 , “Nghiên cứu đặc tính enzym protease từ Asp.oryzae ứng dụng vào q trình lên men nƣớc mắm”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, ĐHQG TPHCM 11 Phạm Thị Thanh Quế 2005 , Giáo trình chế biến thủy sản, ĐH Cần Thơ, Tiêu chuẩn chất lƣợng nƣớc mắm TCVN 5107:2003 12 Đỗ Thị Bích Thuỷ, Trần Thị Xơ (2004), “Nghiên cứu ảnh hƣởng số yếu tố lên khả sinh protease Bacilius subtilis”, Nông nghiệp phát triển nông thôn, 12: 1667-68 55 13 Lê Hƣơng Thủy (2013), Báo cáo tổng kết đề tài “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme để sản xuất bột đạm thủy phân giàu axit amin từ moi cá nục ứng dụng sản xuất nước mắm công nghiệp” Viện Nghiên cứu Hải sản 14 Lê Ngọc Tú (chủ biên , La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguy n Thị Thịnh, B i Đức Hợi, Lƣu Duẩn, Lê Doãn Diên (1997), Hóa sinh cơng nghiệp, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Tài liệu tiếng Anh C Ash, J.A.E Farow, S Wallbanks & M.D Collins, Phylogenetic heterogeneity of the genus Bacillus revealed by comparative analysis of small-subunit-ribosomal RNA sequences Letters in Applied Microbiology 13(1991) pp 202-206 Bajaj BK, Sharma P, 2011, “An alkali-thermotolerant extracellular protease from a newly isolated Streptomyces sp DP2”, N Biotechnol.;28(6):32 Bressollier P., Letourneau F., Urdaci M., and Verneuil B., 1999 “Purification and characterization of a keratinolytic serine proteinase from Streptomyces albidoflavus”, AEM, p pp 2570–2576 Crisan, E V and Sands, A (1975) Microflora of four fermented fish sauces Appl Environ Microbiol., 29, pp 106‒ 108 Fukami, K., Funatsu, Y., Kawasaki, K., and Watabe, S (2004) Improvement of fishsauce odor by treatment with bacteria isolated from the fish-sauce mush (Moromi) made from frigate mackerel J Food Sci., 69, pp 45‒ 49 Ivanova, E P., Vysotskii, M V., Svetashev, V I., Nedashkovskaya, O I., Gorshkova, N M., Mikhailov, V V., Yumoto, N., Shigeri, Y., Taguchi, T., and Yoshikawa, S (1999) Characterization of Bacillus strains of marine origin Int Microbiol., 2, pp 267‒ 271 F.G Priest, M Goodfellow, L.A Shute & R.C.W Berkeley, Bacillus amyloliquefaciens sp nov norn rev Int J Syst Bacteriol 37(1987) pp 69-71 A.P Rooney, N.P Price, C Ehrhardt, J.L Swezey & J.D Bannan, Phylogeny and molecular taxonomy of the Bacillus subtilis species complex and description of Bacillus subtilis subsp inaquosorum subsp nov Int J Syst Evol Microbiol 59(2009) pp 2429-2436 56 ... 3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn chịu mặn có hoạt tính cao 3.2.1 Sàng lọc chủng vi khuẩn chịu mặn có hoạt tính protease chƣợp lên men nƣớc mắm Từ 87 chủng vi khuẩn phân lập từ tháng khác chƣợp mắm. .. ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VI? ??N CN SINH HỌC & CN THỰC PHẨM NGUYỄN THỊ NGÂN HÀ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH CAO TRONG Q TRÌNH LÊN MEN CHƢỢP MẮM CÁT HẢI Chuyên ngành: CÔNG... tiến hành đề tài : ? ?Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính cao q trình lên men chượp mắm Cát Hải? ?? CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN Khái quát nuớc mắm 1.1 1.1.1 Khái niệm Nƣớc mắm dung dịch bao gồm