Sản xuất Biodiesel từ vi tảo: Kỹ thuật nuôi cấy vi tảo thu Lipid

Sản xuất Biodiesel từ vi tảo: Kỹ thuật nuôi cấy vi tảo thu Lipid

i

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC -oOo -

ĐỒ ÁN MÔN HỌC

SẢN XUẤT BIODIESEL TỪ VI TẢO:

KỸ THUẬT NUÔI CẤY VI TẢO THU LIPID

Tp HCM, Tháng 6/2010

ii

được thực hiện từ tháng 2 đến tháng 7/2010 Trong suốt quá trình đó, để hoàn tất tốt các nội dung nghiên cứu, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ nhiệt tình và cởi mở

Em xin được gửi đến:

KS HUỲNH NGUYỄN ANH KHOA, là cán bộ trực tiếp hướng dẫn em làm đồ án

này, lời cảm ơn sâu sắc và chân thành Chính nhờ sự hướng dẫn tận tình về mặt kiến thức và giúp đỡ về mặt tài liệu học thuật của thầy, em đã hoàn thành tốt các nội dung

đề ra

TS NGUYỄN THỊ HUYỀN, là cán bộ làm việc tại phòng 117B2, lòng biết ơn tri

ân Cô đã luôn tạo không khí thoải mái khi em vào phòng trao đổi học tập, điều đó có tác dụng động viên em rất nhiều

Tập thể quý thầy cô thuộc bộ môn Công nghệ sinh học nói riêng và khoa Kỹ thuật hóa học nói chung lòng biết ơn thật nhiều Thầy cô là những người đã cung cấp

các kiến thức cơ sở cũng như chuyên ngành cho em trong suốt quá trình lâu dài làm nền tảng cho những nghiên cứu về sau

iii

chính là mối quan tâm hàng đầu của các quốc gia hiện nay, và biodiesel được xem là một giải pháp khả thi nhằm thay thế cho nguồn nhiên liệu diesel dầu hỏa sử dụng cho các phương tiện giao thông vận tải lẫn trong công nghiệp

Trong khi các nguồn nguyên liệu sản xuất biodiesel thông thường: dầu thực vật,

mỡ động vật và nguồn dầu mỡ phế thải đều tỏ ra không thể đáp ứng nhu cầu biodiesel trên toàn thế giới, vi tảo lại thể hiện là một đối tượng rất tiềm năng cho lĩnh vực này nhờ vào khả năng sản xuất sinh khối lớn và nguồn lipid thu nhận từ các loài vi tảo cũng khá phù hợp để điều chế biodiesel

Tình hình nghiên cứu và áp dụng nuôi cấy vi tảo trên quy mô lớn ngày càng phổ biến trong nhiều lĩnh vực như: sản xuất thực phẩm chức năng và xử lý môi trường, do

đó việc ứng dụng nuôi cấy vi tảo trên các môi trường sửa đổi để nâng cao năng suất lipid phục vụ sản xuất biodiesel là hoàn toàn có khả thi

Nghiên cứu các đặc điểm sinh lý và sinh hóa của loài vi tảo Nannochloropsis oculata có thể dự đoán được đây là một loài vi tảo rất phù hợp với mục tiêu sản xuất

biodiesel: năng suất sinh khối cao trong môi trường quang tự dưỡng, hàm lượng lipid nhiều và thành phần lipid dễ điều chỉnh theo điều kiện nuôi cấy Từ đó đề xuất khảo

sát các yếu tố môi trường nhằm nuôi cấy Nannochloropsis oculata thu lipid với năng

suất cao: môi trường f/2, độ mặn trong khoảng 22-49g NaCl/L, nhiệt độ môi trường 25-270C, chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang ít tỏa nhiệt 400-500µmol/m2s, hạn chế nồng độ nitrogen và phosphorus

Studying in physiological and biochemical characteristics of Nannochloropsis oculata gives suggestion that N oculata should be a suitable source for biodiesel

production: produces high yield of biomass in autotrophic culture, accumulates high lipid content and easily be controlled lipid composition under different conditions

Hence some nutriments factors, temperature and light regimes are proposed to grow N oculata with high lipid productivity: f/2 medium, salinity at 22-49g NaCl/L,

temperature at 25-270C, irradiance at 400-500µmol/m2s with cool white fluorescent tubes, limited nitrogen and phosphorus concentrations

v

LỜI CÁM ƠN ii

TÓM TẮT ĐỒ ÁN iii

MỤC LỤC v

DANH SÁCH BẢNG vii

DANH SÁCH HÌNH ix

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT x

1 TỔNG QUAN VỀ BIODIESEL 1

1.1 Định nghĩa các dạng năng lượng và biodiesel 1

1.1.1 Năng lượng không tái sinh 1

1.1.2 Năng lượng tái sinh 2

1.2 Tầm quan trọng của biodiesel và khả năng thay thế cho nguồn nhiên liệu hóa thạch 4

1.3 Nguyên tắc điều chế và nhu cầu về lipid trong sản xuất biodiesel 7

1.4 Các nguồn nguyên liệu giàu lipid phục vụ cho việc sản xuất biodiesel và tiềm năng của vi tảo 9

2 NĂNG SUẤT LIPID VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG LÊN SỰ TÍCH LŨY LIPID CỦA MỘT SỐ LOÀI VI TẢO 15

2.1 Các loại vi tảo có chứa nhiều lipid 15

2.2 Một số nghiên cứu về ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên sự tích lũy lipid ở vi tảo 16

2.2.1 Yếu tố nhiệt độ 16

2.2.2 Yếu tố thành phần môi trường 19

3 NUÔI VI TẢO NANNOCHLOROPSIS OCULATA THU LIPID NHẰM SẢN XUẤT BIODIESEL 25

3.1 Nannochloropsis oculata 25

3.1.1 Phân loại 25

3.1.2 Đặc điểm hình thái 25

vi

3.2 Đề xuất mô hình thí nghiệm nghiên cứu sự tích lũy lipid theo điều kiện

môi trường ở Nannochloropsis oculata 27

3.2.1 Yếu tố nhiệt độ 27

3.2.2 Yếu tố ánh sáng 32

3.2.3 Yếu tố độ mặn 36

3.2.4 Yếu tố thành phần môi trường 38

4 KẾT LUẬN 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

vii

biodiesel 9 Bảng 1 2: So sánh vi tảo với các nguồn nguyên liệu sản xuất biodiesel 11 Bảng 1 3: So sánh các thuộc tính giữa dầu từ vi tảo, diesel thông thường và tiêu chuẩn ASTM biodiesel [28] 12 Bảng 2 1: Hàm lượng và năng suất lipid của các loài tảo khác nhau 15

Bảng 2 2: Sự sinh trưởng và sản xuất lipid của C vulgaris tại các nhiệt độ khác

Bảng 3 2: Thành phần acid béo (%w/w acid béo tổng) của Nannochloropsis sp

vào ngày thứ 10 tại các nhiệt độ khác nhau 30 Bảng 3 3: Sản lượng sinh khối và thành phần hợp chất hóa sinh của

Nannochloropsis sp vào ngày thứ 10 tại các nhiệt độ khác nhau 31 Bảng 3 4: Sản lượng sinh khối và hàm lượng lipid của Nannochloropsis sp vào

ngày thứ 10 tại các độ mặn khác nhau 36

Bảng 3 5: Thành phần acid béo (%w/w TFA) của Nannochloropsis sp vào ngày

thứ 10 tại các độ mặn khác nhau 37

Bảng 3 6: Năng suất sinh khối và lipid của N oculata trong hệ thống nuôi cấy

bán liên tục với các hàm lượng CO2 khác nhau 41

Bảng 3 7: Tham số sinh trưởng và sự sản xuất lipid của N oculata ở các nồng độ

NaNO3 khác nhau 42 Bảng 3 8: Sản lượng sinh khối và thành phần hợp chất hóa sinh của

Nannochloropsis sp vào ngày thứ 10 tại các nồng độ NaNO3 khác nhau 44

viii

Bảng 3 10: Sản lượng sinh khối và thành phần hợp chất hóa sinh của

Nannochloropsis sp vào ngày thứ 10 tại các nồng độ NaH2PO4 khác nhau 46

Bảng 3 11: Thành phần acid béo (%w/w TFA) của Nannochloropsis sp vào

ngày thứ 10 tại các nồng độ NaH2PO4 khác nhau 47

ix

Hình 1 2: Các dạng năng lượng tái sinh 2 Hình 1 3: Bảng thống kê sử dụng các nguồn năng lượng 3 Hình 1 4: Phản ứng chuyển vị ester 7 Hình 2 1: Phần trăm các loại FAME trên tổng lượng FAME (g/100gFAME) của C vulgaris tại các nhiệt độ sinh trưởng khác nhau 17

Hình 2 2: Phần trăm các loại FAME trên tổng lượng FAME (g/100gFAME) của C vulgaris tại các nồng độ NaNO3 khác nhau 23

Hình 3 1: Thành phần acid béo các lipid chính trong Nannochloropsis sp 27

Hình 3 2: Phần trăm các loại acid béo methyl ester trên tổng lượng acid béo methyl ester (g/100gFAME) của N oculata tại các nhiệt độ khác nhau 29

Hình 3 3: Ảnh hưởng của mức độ chiếu sáng trên sự sinh trưởng của tế bào và

hàm lượng chlorophyll a đối với Nannochloropsis sp 33 Hình 3 4: Sự phân phối các acid béo chính trong Nannochloropsis sp được nuôi

cấy theo mẻ dưới ảnh hưởng của mức độ chiếu sáng 33

Hình 3 5: Thành phần acid béo của Nannochloropsis sp khi nuôi cấy trong điều

kiện ổn định liên tục tại ba mức độ chiếu sáng 35 Hình 3 6: Ảnh hưởng nồng độ khí CO2 lên sự sinh trưởng của N oculata 39 Hình 3 7: Sự sinh trưởng của N oculata khi nuôi cấy bán liên tục trong môi

trường sục khí có chứa 2%, 5%, 10%, 15% CO2 40 Hình 3 8: Phần trăm các loại FAME trên tổng lượng FAME (g/100gFAME) của N oculata tại các nồng độ NaNO3 khác nhau 43

x

FAME: fatty acid methyl ester ester của acid béo và methyl

f/2AW: f/2 artificial seawater môi trường f/2 nước biển nhân tạo EPA: eicosapentaenoic acid acid ω3 (C20:5)

PUFA: polyunsatured fatty acid acid béo chưa no mang nhiều nối đôi TFA: total fatty acid hàm lượng acid béo tổng

1

1 TỔNG QUAN VỀ BIODIESEL

1.1 Định nghĩa các dạng năng lượng và biodiesel

1.1.1 Năng lượng không tái sinh

Nguồn năng lượng không tái sinh là những nguồn năng lượng thiên nhiên

mà con người không có khả năng can thiệp vào sự hình thành cũng như quá trình tích lũy Đó là dạng năng lượng không thể phục hồi, không thể tái tạo, hay không thể tái sử dụng Tuy nhiên dạng năng lượng này đang được sử dụng trên phạm vi rộng lớn khắp toàn cầu, và cho thấy rằng không thể đáp ứng được nhu cầu sử dụng của con người trong tương lai

Năng lượng không tái sinh được chia thành hai nhóm: năng lượng hóa thạch

và năng lượng hạt nhân

- Năng lượng hóa thạch: là dạng năng lượng được hình thành dựa trên các quá

trình địa chất dài hàng triệu năm xảy ra đối với xác động thực vật, như một dạng hóa thạch Bao gồm than đá, dầu mỏ và khí thiên nhiên Do quá trình hình thành lâu dài như vậy, nên khi bị con người khai thác hết sẽ không có khả năng phục hồi được

Một trong số các nhiên liệu hóa thạch ngày càng được sử dụng rộng rãi là diesel

Diesel là một loại nhiên liệu lỏng, là sản phẩm thuộc phân đoạn nhẹ của quá trình chưng cất trực tiếp dầu mỏ với khoảng nhiệt độ sôi ở áp suất khí quyển từ

250 đến 3500C (cao hơn dầu hỏa và xăng) bao gồm các hydrocarbon khác nhau

từ C14 đến C20 Nhiên liệu diesel được sử dụng chủ yếu cho động cơ diesel và một phần được sử dụng trong các tuabin cơ khí

Hình 1 1: Sự hình thành các lớp nhiên liệu hóa thạch

2

- Năng lượng hạt nhân: là dạng năng lượng được hình thành do khả năng

phóng xạ của một vài nguyên tố Có hai kiểu phản ứng hình thành nên năng lượng hạt nhân, đó là phản ứng phân hạch và phản ứng nhiệt hạch

1.1.2 Năng lượng tái sinh

Năng lượng tái sinh là dạng năng lượng thu được từ các nguồn mà con người xem là vô hạn Sự vô hạn ở đây ngoài ý nghĩa nhiều đến mức không thể cạn kiệt, nên được hiểu theo nghĩa rộng hơn đó là có khả năng tái tạo trong một thời gian ngắn và liên tục

Dạng năng lượng này bao gồm:

- Năng lượng mặt trời

- Năng lượng gió

- Năng lượng sóng

- Năng lượng thủy triều

- Năng lượng địa nhiệt

- Năng lượng sinh khối

Hình 1 2: Các dạng năng lượng tái sinh

Nguồn năng lượng tái sinh đang được sử dụng nhiều nhất là thủy năng Song, nguồn năng lượng sinh khối cũng là một trong những nguồn được con người khai thác và sử dụng hiệu quả Sinh khối được xem là nguồn năng lượng lớn thứ tư, ước tính chiếm khoảng 14-15% tổng lượng năng lượng tiêu thụ trên

3

thế giới Ở các nước đang phát triển, sinh khối thường là nguồn năng lượng lớn nhất, trung bình đóng góp khoảng 35% trong tổng cung cấp năng lượng Vì vậy, trong chiến lược sử dụng các nguồn năng lượng cách hiệu quả thì năng lượng sinh khối luôn được xem là ưu tiên hàng đầu và mang tính quyết định trong việc đáp ứng nhu cầu năng lượng của thế giới trong tương lai [1]

Hiện nay, theo thuật ngữ về nhiên liệu, thì sinh khối (biomass) được xem là nhiên liệu ở dạng rắn, nhiên liệu sinh học (biofuel) là những nhiên liệu dưới dạng lỏng thu nhận từ sinh khối và cuối cùng khí sinh học (biogas) là sản phẩm của quá trình phân giải yếm khí các chất hữu cơ [1]

Hai dạng nhiên liệu sinh học phổ biến nhất đó là biodiesel và bio-ethanol, là hai dạng nhiên liệu tương ứng có thể thay thế được cho diesel và gasoline mà không cần cải tiến nhiều hoặc không cần cải tiến động cơ các phương tiện giao thông cũng như máy móc sản xuất Chúng được sản xuất chủ yếu từ sinh khối hay các nguồn năng lượng tái sinh khác và góp phần giảm thiểu khí thải từ việc đốt cháy nhiên liệu so với nhiên liệu hóa thạch tính trên cùng một đơn vị hiệu suất [80]

là nguyên nhân gây ra sự nóng dần lên của toàn cầu, vì vậy nguồn năng lượng sạch

và có khả năng tái sinh sản xuất từ sinh khối nhằm thay thế cho nhiên liệu hóa thạch

là rất cấp thiết để giảm thải CO2 Ngoài ra, sự khủng hoảng năng lượng khiến cho giá dầu thô trên thế giới ngày càng tăng, ảnh hưởng đến tình hình năng lượng sử dụng trong gia đình cũng như trong khu vực [67]

Xét trên lĩnh vực môi trường, giao thông vận tải và sản xuất công nghiệp là những nguồn thải chủ yếu của con người Khảo sát tại liên minh Châu Âu, người ta nhận thấy có đến 20% khí thải nhà kính là do giao thông vận tải và 60% khí thải nhà kính xuất phát từ các khu công nghiệp [20] Nông nghiệp là nguồn thải lớn thứ ba, tương ứng khoảng 9% khí thải nhà kính, trong đó quan trọng nhất là các khí nitrous oxide N2O và khí methane CH4 [21] Theo dự đoán, sự phát triển của các nền kinh

tế mới đang tăng trưởng như Ấn Độ và Trung Quốc sẽ làm gia tăng sự tiêu thụ năng lượng trên toàn cầu, dẫn đến thêm nhiều mối nguy hại cho môi trường [35]

Khí nhà kính không chỉ góp phần gây ra hiện tượng nóng dần lên của trái đất

mà còn gây ra nhiều ảnh hướng khác tới môi trường và đời sống nhân loại Các đại dương hấp thụ khoảng một phần ba lượng CO2 thải ra mỗi năm do các hoạt động của con người Khi nồng độ CO2 tăng lên trong không khí, lượng hòa tan trong nước biển cũng tăng, dẫn đến giảm pH và nước biển có tính acid hơn Sự giảm pH

là một điều kiện bất lợi có thể gây ra những hủy hoại nhanh chóng đối với các rặng san hô cũng như sự đa dạng sinh thái đại dương, vốn có quan hệ to lớn trong đời sống các sinh vật đại dương và trên cạn [55]

Chính sự nóng dần lên của trái đất đã, đang và sẽ tiếp tục ảnh hưởng đến nhiều khía cạnh khác nhau của đời sống nhân loại và môi trường trên toàn cầu, chúng ta cần không phải chỉ riêng lẻ một mà là một loạt các giải pháp để có thể cải thiện và khắc phục vấn đề bức bách này [40]

Xét trên lĩnh vực khủng hoảng năng lượng, sự sụt giảm nguồn nguyên liệu dầu thô dự trữ và những khó khăn trong việc trích ly và tinh luyện chúng dẫn đến sự gia tăng về giá thành [40] Đây thực sự là những trở ngại lớn đối với vấn đề giao thông

Hiện nay, nhiều lựa chọn đang được nghiên cứu và đưa vào thực nghiệm, đã đạt được những mức độ thành công khác nhau trong các giai đoạn nghiên cứu và thực nghiệm khác nhau, bao gồm các nguồn năng lượng như năng lượng mặt trời, bao gồm cả nhiệt năng và quang năng, thủy điện, địa nhiệt, gió, nhiên liệu sinh học,

và sự cô lập carbon, cùng những loại khác [19, 27] Mỗi loại đều có những ưu điểm cũng như những vấn đề vướng mắc, tùy thuộc vào khu vực áp dụng, những điều kiện khác nhau sẽ có mức độ phù hợp tốt hơn đối với từng loại phương pháp Mục tiêu quan trọng đó là giảm thiểu các khí thải từ các phương tiện chuyên chở, như là thay thế dần từng bước một nguồn nguyên liệu hóa thạch bằng những nguồn nguyên liệu tái sinh, trong đó nhiên liệu sinh học được xem là một cộng tác viên thực sự để đạt được những mục tiêu đó, đặc biệt trong tương lai gần [80]

Trái đất nóng dần lên, do sự gia tăng nồng độ của khí nhà kính trong không khí, đã và đang là mối lo ngại quan trọng nhất về môi trường [85] Giảm bớt sự hình thành CO2 trong khí quyển, nhiệm vụ hàng đầu của việc làm giảm hiệu ứng nhà kính, có thể thực hiện bởi ba phương pháp sau [6]:

- Giảm bớt sử dụng nhiên liệu hóa thạch

- Loại bỏ CO2 trong khí quyển

- Thu hồi và cô lập hoặc tận dụng CO2 từ việc đốt nhiên liệu hóa thạch trước khi nó được thải ra môi trường

Sản xuất nhiên liệu sinh học có thể đem lại những cơ hội mới góp phần gia tăng sự đa dạng về các nguồn thu nhập cũng như các nguồn cung cấp năng lượng,

cụ thể là đẩy mạnh việc làm ở các vùng nông thôn, phát triển sự thay thế dài hạn đối với nguồn nhiên liệu hóa thạch, và giảm bớt lượng khí thải nhà kính, đẩy mạnh việc loại bỏ Carbon từ các nhiên liệu vận tải và nâng cao sự an toàn trong việc cung cấp nhiên liệu [80]

6

Tìm kiếm những nguồn nguyên liệu thay thế đang là vấn đề nóng bỏng đối với nhiều nước, đặc biệt là những nước thiếu các nguồn tài nguyên năng lượng thông thường Vào những thập niên 1930 và 1940, dầu thực vật đã được sử dụng như là nhiên liệu diesel trong những trường hợp khẩn cấp Trong những năm gần đây, khi nền công nghiệp hiện đại phát triển ngày một rộng rãi và quy mô, nhu cầu về năng lượng đã gia tăng đột biến, vì vậy những nguồn năng lượng thay thế đang được thăm dò và nghiên cứu ráo riết Trong tổng số các động cơ phương tiện hiện nay, tỷ

lệ phương tiện sử dụng nhiên liệu diesel ngày càng phổ biến và được sử dụng nhiều hơn Thêm vào đó, động cơ diesel cũng được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp [75] Vì vậy, nhiên liệu diesel là nguồn sử dụng lớn nhất trong số các nhiên liệu dầu

mỏ sử dụng cho động cơ, và tỷ lệ này tăng lên liên tục ngày qua ngày [11] Từ đó, nhu cầu đối với biodiesel càng trở nên cấp thiết, và thuật ngữ “biodiesel” xuất hiện một cách thường xuyên trong các bài báo cáo gần đây [24]

Biodiesel được sản xuất từ sinh khối dầu (biomass oils), chủ yếu là từ dầu thực vật Biodiesel trở thành nguồn năng lượng đáng được chú ý vì những lý do như sau

- Thứ nhất, biodiesel là nguồn năng lượng tái sinh có thể đáp ứng cung và cầu Người ta đã ước tính được rằng lượng dầu mỏ dự trữ sẽ hoàn toàn cạn kiệt trong vòng 50 năm trở lại tính theo mức tiêu thụ hiện nay [70]

- Thứ hai, biodiesel cho thấy thân thiện với môi trường hơn các loại nhiên liệu hóa thạch Sử dụng biodiesel không làm gia tăng lượng khí thải carbon dioxide nhưng lại có hàm lượng các khí sulfur thấp hơn hẳn [4, 82] Thành phần khí thải sulfur và carbon monoxide giảm thiểu lần lượt là 30% và 10% khi sử dụng biodiesel Lượng khí tạo thành trong quá trình đốt cháy nhiên liệu

có thể ít lại, và sự giảm bớt carbon monoxide là nhờ vào hàm lượng oxygen cao có trong biodiesel Hơn nữa, biodiesel không chứa các hợp chất dễ bay hơi và các hợp chất hóa học khác gây hại cho môi trường Gần đây, các cuộc điều tra cho thấy rằng sử dụng biodiesel giảm thiểu được 90% chất độc hại trong không khí và 95% các bệnh ung thư khi so sánh với diesel thông thường [69]

- Thứ ba, biodiesel đem lại tiềm năng kinh tế đáng kể bởi vì trong tương lai, các dạng năng lượng không tái sinh như nhiên liệu hóa thạch sẽ ngày một gia tăng giá thành là một điều không thể tránh khỏi [10]

- Cuối cùng, biodiesel tốt hơn diesel thông thường ở nhiệt độ phát cháy và khả năng phân hủy sinh học [45]

7

Nguồn sinh khối không những sẽ trở thành nguồn cung cấp năng lượng bền vững mà còn góp phần vào cuộc sống xã hội trong khu vực nhờ giúp gia tăng các hoạt động thương mại và tạo nhiều cơ hội việc làm cho nông dân

Vi tảo, thu nhận dưới dạng sinh khối, là một nguồn năng lượng tái sinh rất tiềm năng, và chúng có thể được chuyển hóa thành năng lượng dưới dạng nhiên liệu sinh học bao gồm dầu và gas Vì vi tảo có hàm lượng nước nhiều, do đó không phải toàn bộ lượng sinh khối có thể áp dụng thành năng lượng Sử dụng phương pháp nhiệt hóa học có thể sản xuất ra dầu và gas, và bằng các phương pháp hóa sinh để sản xuất ra ethanol và biodiesel Sản phẩm từ vi tảo có các đặc tính tương tự như các sản phẩm từ dầu thực vật và dầu cá, vì vậy, nó có thể thay thế được cho dầu mỏ [67]

1.3 Nguyên tắc điều chế và nhu cầu về lipid trong sản xuất biodiesel

Biodiesel là hỗn hợp các ester giữa acid béo và alkyl thu được thông qua quá trình chuyển vị ester của dầu thực vật hay mỡ động vật Nguồn nguyên liệu lipid dầu thực vật hay mỡ động vật bao gồm 90-98% khối lượng là các triglyceride và một lượng nhỏ các mono và diglyceride, acid béo tự do chiếm khoảng 1-5%, phần còn lại là các phospholipid, phosphatide, carotene, tocopherol, hợp chất sulphur, và một ít nước [7]

Chuyển vị ester là một phản ứng phức tạp, bao gồm ba bước chuyển đổi liên tiếp: triglyceride được chuyển hóa thành diglyceride, sau diglyceride chuyển hóa thành monoglyceride,và monoglyceride sẽ chuyển hóa thành các ester (biodiesel) và glycerol (phụ phẩm) Phản ứng chuyển vị ester tổng quát được mô tả trong hình sau, trong đó R1, R2, R3 tượng trưng cho các hydrocarbon mạch dài, chính là các acid béo [80]

Hình 1 4: Phản ứng chuyển vị ester

8

Trong phản ứng chuyển vị ester, tác nhân phản ứng là dầu hay mỡ cùng các alcohol có mạch carbon ngắn (thường là methanol), có sự hiện diện của chất xúc tác (thường là NaOH) Mặc dù tỷ lệ phân tử gam giữa alcohol : dầu theo lý thuyết là 3:1 nhưng thông thường người ta áp dụng theo tỷ lệ 6:1 để phản ứng xảy ra hoàn toàn Mối quan hệ giữa nguyên liệu đầu vào và sản phẩm biodiesel đầu ra đạt tỷ lệ khoảng 1:1, nghĩa là theo lý thuyết, 1kg dầu sẽ tạo ra được 1 kg biodiesel [80]

Có thể sử dụng chất xúc tác đồng thể hay dị thể, acid, base hoặc enzyme lipase

để tăng mức độ phản ứng chuyển vị ester, mặc dù đối với vài quá trình sử dụng các chất lỏng siêu tới hạn (methanol hoặc ethanol) có thể không cần dùng đến các chất xúc tác [84] Trong công nghiệp, thường sử dụng nhất là các chất xúc tác đồng thể

có tính kiềm (ví dụ như NaOH hay KOH) trong các bình phản ứng có khuấy đảo, thực hiện theo mẻ [80] Các phản ứng chuyển vị ester được xúc tác bởi các chất có tính kiềm có tốc độ phản ứng nhanh hơn 4000 lần so với xúc tác bởi acid [25] Trong phân tử triglyceride, khối lượng glycerol là khoảng 41 g/mol, trong khi khối lượng các gốc acid béo dao động từ 650-790 g/mol Chính thành phần các gốc acid béo tạo ra các nhóm hoạt động trong phân tử glyceride, và chúng có tầm ảnh hưởng đáng kể đến tính chất của dầu thực vật và mỡ động vật [11]

Trong quá trình sản xuất biodiesel, người ta có thể sử dụng nguồn lipid từ dầu thực vật, mỡ động vật hoặc các loại dầu thải Tuy nhiên, để sản xuất biodiesel đạt chuẩn nhiên liệu, tính chất của nguồn nguyên liệu rất quan trọng, ngay từ quá trình nghiên cứu ban đầu cho tới giai đoạn sản xuất, vì chất lượng của biodiesel phụ thuộc vào chất lượng nguồn nguyên liệu [11]

Những nguồn nguyên liệu giàu các acid béo chưa bão hòa chứa nhiều nối đôi (polyunsaturated) thì dễ mắc phải quá trình oxy hóa hơn các nguồn lipid có nhiều acid béo bão hòa hay chỉ có một nối đôi trong mạch (monounsaturated) [11]

Tuy nhiên, biodiesel từ nguồn nguyên liệu chứa một lượng lớn các acid béo bão hòa sẽ có nhiệt độ điểm sương (nhiệt độ biodiesel bắt đầu xuất hiện tinh thể) và nhiệt độ dòng chảy (nhiệt độ thấp nhất mà biodiesel vẫn có thể bơm và chảy được trong ống dẫn) cao Thực tế cho thấy, biodiesel từ dầu thực vật có nhiệt độ điểm sương và nhiệt độ dòng chảy thấp hơn biodiesel từ mỡ động vật [11]

Nếu nguồn nguyên liệu lipid chứa một lượng lớn các acid béo tự do và nước thì quá trình chuyển vị ester sẽ gặp nhiều khó khăn vì chúng không thể chuyển hóa được thành biodiesel thông qua phản ứng xúc tác với kiềm Đây là vấn đề vướng

9

mắc khi sử dụng dầu đã qua chế biến, dầu thải nhà hàng, dầu cặn, mỡ động vật làm nguồn nguyên liệu sản xuất biodiesel dù đây là những nguồn nguyên liệu có giá thành rẻ [11]

Thành phần ester phổ biến nhất trong biodiesel là ester của các acid palmitic, acid stearic, acid oleic, acid linoleic và acid linolenic Các loại nguyên liệu như đậu nành, hoa hướng dương, hạt cải dầu (canola), cọ và lạc có thành phần lipid khá phù hợp như trên [26] Trong số đó, methyl oleate được xem là thành phần chính lý tưởng để sản xuất biodiesel Một số ester khác như methyl palmitoleic cũng có những ưu điểm, khi so với methyl oleate thì trội hơn về nhiệt độ đông đặc thấp [26]

Bảng 1 1: Các acid béo thường có trong các nguồn nguyên liệu dùng sản

xuất biodiesel [26]

1.4 Các nguồn nguyên liệu giàu lipid phục vụ cho việc sản xuất biodiesel

và tiềm năng của vi tảo

Thông thường, biodiesel chủ yếu được sản xuất từ dầu của đậu nành và các loại rau quả [9], cọ [2], hoa hướng dương [4], hạt cây cải dầu [58] cũng như dầu phế thải từ các nhà hàng [8] Số lượng nguyên tử carbon trong chuỗi mạch carbon của phân tử dầu diesel vào khoảng 15C, và điều này gần như tương ứng với dầu thực vật với chuỗi carbon vào khoảng 14-18C Các đặc điểm về cấu trúc của biodiesel cho thấy rằng biodiesel có thể ứng dụng để thay thế được cho năng lượng thông thường Hiện tại, giá thành của biodiesel thì cao gấp 2 lần so với diesel thường Chi phí sản xuất biodiesel bao gồm 2 phần chính, đó là chi phí cho nguồn nguyên liệu thô (dầu thực vật và mỡ động vật) và chi phí quá trình Chi phí cho nguồn nguyên liệu thô chiếm khoảng 60-75% tổng chi phí nhiên liệu biodiesel [39] Dù vậy, vẫn

có thể tìm được một lượng lớn dầu mỡ giá thành thấp từ các chế phẩm phế thải nhà

10

hàng và từ động vật [30], vấn đề chính khi sử dụng những nguồn dầu mỡ này đó là chúng thường chứa nhiều acid béo tự do gây khó khăn cho quá trình sản xuất biodiesel thông qua quá trình chuyển vị ester [17] Nguồn nguyên liệu thô có tỷ lệ triglyceride cao thì phù hợp hơn Ví dụ như dầu thực vật là loại nguyên liệu có tỷ lệ triglyceride rất cao, do đó nó đươc sử dụng để sản xuất biodiesel trong vài năm qua [18]

Tuy nhiên, dầu thực vật còn là nguồn tiêu thụ của con người Vì vậy sử dụng dầu thực vật sản xuất biodiesel có thể làm cho giá thành dầu thực vật dùng trong thực phẩm tăng cao, từ đó dẫn đến giá thành biodiesel cao và người tiêu dùng hạn chế sử dụng dù rằng biodiesel có nhiều ưu điểm hơn so với diesel [80]

Dầu thực vật được sử dụng trong nhiều mục đích thương mại và khả năng cung ứng dầu thực vật cho việc sản xuất biodiesel thì không thể đáp ứng nổi tiềm năng thương mại của biodiesel trên một khu vực Một ví dụ cụ thể đó là để đáp ứng được 10% chỉ tiêu tại EU từ việc sản xuất quy mô hộ gia đình, thì nguồn nguyên liệu thực sự cung cấp không đủ cho nhu cầu hiện tại, và sự đòi hỏi về diện tích canh tác thì vượt xa tiềm năng phát triển đất trồng đối với các loại cây trồng sản xuất năng lượng sinh học [68] Mở rộng trồng trọt, áp lực trong sự thay đổi sử dụng đất trồng và sự gia tăng các cánh đồng canh tác có thể dẫn tới cạnh tranh đất đai và làm mất đi sự đa dạng sinh học do sự lấn chiếm rừng và các vùng sinh thái quan trọng [64] Biodiesel sẽ không còn được xem là một giải pháp ưu việt khi nó chiếm dụng nguồn cây trồng phục vụ cho những lợi ích khác của con người hay nguồn nguyên liệu của nó xâm lấn vào diện tích rừng và các môi trường trọng yếu khác có liên quan mật thiết đến sự đa dạng sinh học [80]

Giá thành và những khó khăn trong việc thu nhận và tinh chế các nhiên liệu hóa thạch cùng những chính sách ở cấp độ khu vực cho tới quốc gia sẽ ngày càng thúc đẩy gia tăng sản xuất biodiesel hoặc các loại nhiên liệu tái sinh khác Và để biodiesel có thể trở thành quen thuộc đối với người tiêu dùng thì giá cả của nó phải cạnh tranh được với diesel thông thường Do đó mục tiêu đặt ra là phải giảm bớt được chi phí cho nguồn nguyên liệu thô vốn chiếm 60-70% tổng chi phí nhiên liệu biodiesel [11]

Để không phải cạnh tranh với nguồn dầu thực phẩm, biodiesel nên được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu giá thành rẻ như là các nguồn dầu phi thực phẩm, sử dụng dầu rán, mỡ động vật, dầu cặn, và dầu nhờn Tuy nhiên, khối lượng dầu thải

và mỡ động vật sẵn có thì không đủ để đáp ứng nhu cầu biodiesel hiện nay Vì vậy,

11

công nghệ sản xuất biodiesel chuyển tiếp qua một thế hệ mới, thế hệ thứ hai, lấy nguồn nguyên liệu là sinh khối vi tảo, có thể góp phần giảm bớt được những đòi hỏi bức thiết về mặt bằng nhờ có hiệu suất năng lượng cao hơn trên mỗi đơn vị diện tích đất cũng như không cạnh tranh ảnh hưởng tới đất nông nghiệp Hơn nữa, biodiesel cần phải có mức tác động môi trường thấp hơn và bảo đảm có cùng chất lượng so với các nguồn nhiên liệu hiện nay [61]

Thực tế, vi tảo có hiệu suất dầu cao nhất trong số các cây trồng lấy dầu đa dạng khác Có thể so sánh hiệu suất nuôi trồng vi tảo với việc khai thác các nguồn sinh khối khác qua bảng số liệu sau:

Bảng 1 2: So sánh vi tảo với các nguồn nguyên liệu sản xuất biodiesel khác [80]

Nguồn

Hàm lượng dầu (% khối lượng sinh khối)

Năng suất lipid (L dầu/ha.năm)

Đất sử dụng (m 2 năm/kg biodiesel)

Năng suất biodiesel (kg biodiesel/

ha.năm)

Bắp/Ngô (Zea mays L.) 44 172 66 152

Gai dầu (Cannabis

Vi tảo (lượng dầu thấp) 30 58700 0.2 51927

Vi tảo (lượng dầu

Vi tảo (lượng dầu cao) 70 136900 0.1 121104

12

Để giải quyết vấn đề thiếu hụt năng lượng toàn cầu, tìm kiếm các nguồn

nguyên liệu sinh học giàu lipid để sản xuất biodiesel đạt hiệu quả cao đang thu hút

rất nhiều sự quan tâm Các vi sinh vật có chất dầu được kỳ vọng nhờ có chu kỳ sinh

trưởng ngắn, hàm lượng lipid cao và dễ dàng được cải tạo giống bởi các phương

tiện công nghệ sinh học Vài loài vi tảo được liệt vào nhóm vi sinh vật giàu chất dầu

phù hợp với nhu cầu sản xuất lipid [15] Vi tảo được xem là đối tượng tiềm năng để

sản xuất nhiên liệu bởi rất nhiều ưu điểm như là hiệu suất quang hợp cao, sinh khối

lớn và mức độ sinh trưởng cao hơn khi so sánh với các loại cây trồng sản xuất năng

lượng [50]

Trong số các nguồn sinh khối, vi tảo được xem là một nguồn sinh khối hiện

đại và có nhiều tiềm năng nhất hiện nay bởi vì vi tảo có khả năng quang hợp hiệu

quả hơn bất kỳ loại sinh khối thực vật nào khác, mà theo Hall in Ref, quá trình

quang hợp của vi sinh vật là quá trình tái sinh sử dụng năng lượng mặt trời để

chuyển hóa thành một dạng năng lượng dự trữ mới dưới dạng các liên kết hóa học,

ngoài ra con người hoàn toàn có thể chủ động sản xuất sinh khối vi tảo với số lượng

lớn Vì vậy nếu có thể thu hồi năng lượng với năng suất cao từ chúng thì sinh khối

vi tảo được xem là một nguồn tài nguyên đầy hứa hẹn để sản xuất nhiên liệu [67],

và vi tảo có thể được xem như một nguồn năng lượng thay thế cho nguồn năng

lượng hóa thạch đang cạn kiệt dần [48] Hơn nữa, theo tiêu chuẩn biodiesel của

American Society for Testing Materials (ASTM), biodiesel từ dầu vi tảo có các

thuộc tính tương tự với biodiesel tiêu chuẩn, và nó cũng an toàn hơn vì có nhiệt độ

phát cháy cao

Bảng 1 3: So sánh các thuộc tính giữa dầu từ vi tảo, diesel thông thường và

tiêu chuẩn ASTM biodiesel [28]

Khối lượng riêng

13

Những ưu điểm khi nuôi cấy vi tảo như nguồn tài nguyên sinh khối:

- Tảo được xem là các cơ thể sống có khả năng thu nhận năng lượng mặt trời

để tạo ra các hợp chất hữu cơ rất hiệu quả [83]

- Tảo được xếp vào loài thực vật không có hệ mạch dẫn, đa phần đều thiếu cơ quan sinh sản phức tạp [83]

- Vi tảo dễ dàng nuôi cấy để sản xuất một số hợp chất đặc thù chọn lọc, có giá trị kinh tế với nồng độ cao như protein, carbohydrate, lipid và các sắc tố dựa vào các điều kiện sinh trưởng đa dạng [83] Từ đó có thể tối ưu hóa môi trường để thu được sinh khối với hàm lượng lipid cao

- Vi tảo thuộc vào nhóm vi sinh vật sinh sản theo chu kỳ phân đôi tế bào [83]

- Vi tảo có thể sống được ở môi trường nước biển, nước lợ hoặc nước ngọt Mặc dù vi tảo sống trong môi trường nước, nhưng không đòi hỏi cần nhiều nước như các loại cây trồng khác [43] Mặt khác, vi tảo cũng có thể thích nghi với môi trường nước thải, do đó không cần thiết phải tốn chi phí sử dụng nước sạch [80]

- Hệ thống sản xuất sinh khối tảo dễ dàng thích nghi ở các quy mô và kỹ thuật khác nhau [83]

- Việc nuôi thu sinh khối vi tảo không đòi hỏi nhiều diện tích như khi trồng các loại cây lấy dầu khác [15], và năng suất sinh khối vi tảo cũng không phụ thuộc vào thời tiết hay ảnh hưởng của môi trường [43] Biodiesel sản xuất từ

vi tảo không làm ảnh hưởng đến việc sản xuất thực phẩm và các sản phẩm khác từ thực vật [28]

- Vi tảo có mức độ sinh trưởng rất nhanh, chu kỳ sinh trưởng hoàn tất chỉ trong vài ngày [71], và có rất nhiều loài tảo chứa nhiều dầu [28], năng suất dầu trên mỗi đơn vị nuôi cấy vi tảo có thể cao vượt trội hơn so với năng suất dầu của cây có hạt chứa hàm lượng dầu nhiều nhất [43] Thông thường các loài vi tảo

có hàm lượng dầu vào khoảng 20-50% [15]

Ví dụ như loài tảo Chlorella protothecoides khi nuôi theo phương thức dị

dưỡng có thể tích lũy lipid đạt 55% khối lượng khô của tế bào sau 144h nuôi cấy trong môi trường có bổ sung bột cao ngô trong fermenter [87]

- Sản xuất sinh khối vi tảo có thể được xem là một phương pháp cố định trực tiếp khí thải CO2 vì vi tảo sử dụng CO2 như nguồn Carbon nhờ khả năng quang hợp (1kg sinh khối khô đòi hỏi cần có 1.8kg CO2) [43]

- Nuôi cấy vi tảo không cần dùng các loại thuốc xịt cỏ hay thuốc trừ sâu [43]

14

- Các phần sinh khối vi tảo còn dư lại sau quá trình trích ly dầu có thể được dùng như nguồn thức ăn cho gia súc, hoặc làm phân bón, hoặc qua quá trình lên men tạo các sản phẩm ethanol hay methane [43]

- Toàn bộ quá trình từ việc nuôi thu sinh khối có hàm lượng lipid cao đến sản xuất biodiesel từ dầu vi tảo đều đã được nghiên cứu

Ở điều kiện phòng thí nghiệm, hàm lượng lipid lý tưởng có thể đạt tới 60% trên tổng sinh khối khô nhờ vào kỹ thuật di truyền hoặc kỹ thuật nuôi dị dưỡng Những tiến bộ kỹ thuật cho thấy rằng trong tương lai việc sản xuất biodiesel từ vi tảo có thể được thực hiện trên quy mô công nghiệp [28]

56-15

2 NĂNG SUẤT LIPID VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG

LÊN SỰ TÍCH LŨY LIPID CỦA MỘT SỐ LOÀI VI TẢO

2.1 Các loại vi tảo có chứa nhiều lipid

Một số loài vi tảo có thể tích lũy lipid đạt đến 75% (w/w) sinh khối khô nhưng

năng suất thấp, như là Botryococcus braunii Một số loài vi tảo khác rất phổ biến

cho việc sản xuất lipid đó là Chlorella, Crypthecodinium, Cylindrotheca,

Dunaliella, Isochrysis, Nannnochloris, Nannochloropsis, Neochloris, Nitzschia,

Phaeodactylum, Porphyridum, Schizochytrium, Tetraselmis vì có năng suất sinh

khối cao nên năng suất lipid cao hơn nhiều mặc dù hàm lượng lipid chỉ đạt từ

20-50% sinh khối khô [80]

Ngoài ra, thành phần lipid trong tế bào vi tảo cũng khác nhau tùy theo chủng

loại Đây thực sự cũng là một điểm đáng lưu ý khi lựa chọn các loài vi tảo vì sẽ ảnh

hưởng đáng kể đến đặc tính của biodiesel được sản xuất từ lipid của chúng Thành

phần lipid trong vi tảo gồm có các acid béo bão hòa và chưa bão hòa, chứa 12-22

nguyên tử carbon, và một số thuộc họ ω3 và ω6 [80]

Bảng 2 1: Hàm lượng và năng suất lipid của các loài tảo khác nhau [80]

Các loài vi tảo nước

mặn và nước ngọt (% sinh khối khô) Hàm lượng lipid Sinh khối khô (g/L/ngày) Năng suất lipid (mg/L/ngày)

16

Theo số liệu trên, ta thấy trong số các loài vi tảo có hàm lượng lipid cao,

Nannochloropsis oculata là một tiềm năng sáng giá Mặc dù hàm lượng lipid tính

theo phần trăm sinh khối khô chỉ trong khoảng 22.7-29.7%, thấp hơn một số loài

như Chlorella emersonii, Chlorella sp., Nannochloris sp., Neochloris oleoabundans…, nhưng do Nannochloropsis oculata nuôi theo phương pháp tự

dưỡng có sức sinh sản cao, lượng sinh khối trong ngày lớn, năng suất lipid của loài

này có giá trị cao đáng kể Vì vậy có thể xem Nannochloropsis oculata là một loài

vi tảo rất có tiềm năng trong việc sản xuất biodiesel

2.2 Một số nghiên cứu về ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên sự tích lũy lipid ở vi tảo

Năng suất dầu của vi tảo là khối lượng dầu được sản xuất trên mỗi đơn vị thể tích canh trường vi tảo mỗi ngày, phụ thuộc vào mức độ sinh trưởng của tảo và hàm lượng lipid có trong sinh khối Xem xét qua một vài kết quả nghiên cứu, ta có thể thấy rằng hàm lượng và đặc tính của lipid trong tế bào vi tảo rất đa dạng, tùy thuộc vào sự thay đổi của điều kiện sinh trưởng (như nhiệt độ và cường độ chiếu sáng) hay thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy (như nồng độ nitrogen, phosphate và sắt) [34, 44]

2.2.1 Yếu tố nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sự sinh trưởng và sự tích lũy các thành phần hóa sinh trong tế bào vi tảo, đặc biệt là sự tích lũy lipid và sự thay đổi thành phần lipid nội bào

Một ví dụ cụ thể đó là Chlorella vulgaris trong thí nghiệm của Attilio và các cộng sự: loài vi tảo này được nuôi trong môi trường cơ bản Bold, sử dụng

CO2 có sẵn trong không khí (khoảng 300ppm) và NaNO3 là những nguồn cung cấp carbon và nitrogen duy nhất trong suốt quá trình thí nghiệm, nuôi cấy theo phương thức quang tự dưỡng trong 14 ngày dưới ánh sáng liên tục có cường độ 70µE/m2s, ở các nhiệt độ 25, 30, 35 và 380C [5]

Sự sinh trưởng của C vulgaris bị ảnh hưởng mạnh mẽ khi nhiệt độ trên

300C Ở 350C, loài vi tảo này bắt đầu bị ức chế, cụ thể là mức độ sinh trưởng đặc trưng đã giảm 17% so với ở 300C Khi tăng nhiệt độ lên cao hơn nữa (380C), sự

sinh trưởng của C vulgaris bị ngừng đột ngột, sau đó các tế bào vi tảo bị chết

Điều này rất dễ nhận biết vì các tế bào sẽ thay đổi màu sắc, chuyển từ màu xanh sang màu nâu, và mức độ sinh trưởng của tế bào vi tảo có kết quả là số âm [5]

17

Khi nhiệt độ sinh trưởng giảm từ 30 C xuống còn 25 C thì hàm lượng lipid

trong tế bào C vulgaris tăng, từ 5.9 lên 14.7%, trong khi đó mức độ sinh trưởng

vẫn duy trì không đổi Kết quả năng suất lipid đã tăng từ 8 lên đến 20mg/L.ngày [5]

Bảng 2 2: Sự sinh trưởng và sản xuất lipid của C vulgaris tại các nhiệt độ

Hình 2 1: Phần trăm các loại FAME trên tổng lượng FAME (g/100g FAME )

của C vulgaris tại các nhiệt độ sinh trưởng khác nhau [A4]

(FAME: fatty acid methyl ester)

Sau quá trình chuyển vị ester, phân tích các FAME thì thấy lượng acid

palmitic (C16:0) trong C vulgaris chiếm 60% (mol/mol) trên tổng lượng lipid

vi tảo Mỗi loài vi tảo thích ứng với một ngưỡng nhiệt độ nhất định và ở các nhiệt

độ khác nhau thì thành phần hóa sinh trong tế bào là khác nhau

18

Như trong thí nghiệm của Susan M Renaud và các cộng sự, bốn loài vi tảo

nhiệt đới Australian bao gồm tảo cát Chaetoceros (CS256), 2 loài cryptomonad: Rhodomonas (NT15) và Crytomonas (CRF101) và 1 loài prymnesiophyte không

xác định (NT19) được nuôi ở 5 nhiệt độ khác nhau Thí nghiệm được thiết kế theo môi trường f/2 ở nhiệt độ 25, 27, 30, 33 và 350C (nồng độ muối 25 ‰, pH 8.3, mật độ photon 80 μmol/m2.s; chu kỳ sáng : tối là 12 : 12 h) [62]

Ba loài Cryptomonas sp., Rhodomonas sp., và prymnesiophyte (NT19) đạt

mức sinh trưởng tối ưu vào khoảng nhiệt độ từ 250C đến 300C, mức sinh trưởng

sẽ chậm hơn và số lượng tế bào giảm khi nhiệt độ vượt trên 300C Điều này thì

tương đồng với các nghiên cứu trước đây trên các loài tảo khác như Isochrysis sp., Nitzshia closterium, N paleacea [63], Ochoromas danica, Chaetocerso gracilis, Porphyridium cruentum, Chlorella sp., và Nannochloropsis sp [62] Cụ

thể là nhiệt độ tối ưu vào khoảng 25-270C đối với loài Rhodomonas sp (mức độ

sinh trưởng đặc trưng, μ=0.27/ngày) và 27-300C đối với prymnesiophyte NT19,

Cryptomonas sp., Chaetoceros sp., và Isochrysis sp (μ=0.56, 0.33, 0.87 và

0.97/ngày) Khi nhiệt độ vượt quá 300C hoặc 330C thì tương ứng Cryptomonas

sp và Rhodomonas sp sẽ rơi vào phase suy vong, các quá trình chuyển hóa trong

tế bào bị ngừng đột ngột và tế bào vi tảo sẽ chết Chỉ có Chaetoceros sp có khả

năng chịu được nhiệt độ cao, vẫn duy trì mức độ sinh trưởng bình thường ở 33 và

350C (μ>0.78/ngày) Tại 300C Chaetoceros sp có mật độ tế bào cao nhất, do đó

lượng sinh khối cũng đạt cao nhất (0.17g/L) [62]

Khi tăng nhiệt độ môi trường nuôi cấy, sự tổng hợp lipid của ba loài

Chaetoceros sp., Rhodomonas sp., và prymnesiophyte NT19 có xu hướng giảm,

lượng lipid giảm tuy nhỏ, nhưng xét trên tỷ lệ thì lại rất đáng kể Kết quả này

tương tự đối với Chaetoceros calcitrans, C simplex [81] và Nitzschia sp [63]

Tuy nhiên cũng có những kết quả phản ánh ngược lại: đối với một số loài vi tảo khác sự tổng hợp lipid sẽ tăng khi ở nhiệt độ cao [81, 54]

Chaetoceros sp có tỷ lệ về lipid cao nhất (16% DW; P<0.01) khi nuôi cấy

ở 25˚C, trong khi Rhodomonas sp., Cryptomonas sp., NT19 và Isochrysis sp có

hàm lượng lipid cao đáng kể ở nhiệt độ trong khoảng 27-300C (lần lượt là 15.5, 12.7, 21.4 và 21.7% DW, P<0.05) [62]

Từ đó thấy rằng việc lựa chọn nhiệt độ phù hợp cho sự sinh trưởng và tích lũy lipid khi nuôi cấy vi tảo nhẳm sản xuất biodiesel là rất quan trọng

19

2.2.2 Yếu tố thành phần môi trường

Hàm lượng lipid trong vi tảo có thể tăng lên dưới các điều kiện nuôi cấy khác nhau như sự thiếu hụt nitrogen [34, 79, 42], cường độ chiếu sáng mạnh [37], nhiệt độ thấp [62], nồng độ muối cao [78], và nồng độ sắt cao [44] Dưới các điều kiện kích thích, nhiều loài vi tảo có thể đáp ứng bằng cách gia tăng hàm lượng lipid, thông thường từ 30% tới 60% (w/w) tế bào khô [14]

2.2.2.1 Thành phần Carbon

Cả hai loại nguồn carbon phi hữu cơ (CO2) lẫn carbon hữu cơ (glucose, acetate…) đều được vi tảo sử dụng để sản xuất lipid Do vi tảo có khả năng sử dụng CO2 như nguồn carbon chính trong thành phần dinh dưỡng nhờ vào khả năng quang hợp, con người hướng đến việc cô lập CO2 từ các nguồn khí thải

để tận dụng cho quá trình quang hợp của vi tảo, một mặt giảm được chi phí trong quá trình nuôi cấy vi tảo, mặt khác là giảm thiểu CO2 trong không khí, đáp ứng nhiệm vụ cải thiện môi trường và khắc phục hiện tượng nóng dần lên của trái đất do các loại khí nhà kính [12] Theo ước tính, để sản xuất được 100 tấn sinh khối vi tảo thì có khoảng 180 tấn CO2 được sử dụng trong quá trình quang hợp dưới điều kiện ánh sáng tự nhiên hoặc nhân tạo [5]

Để việc sản xuất biodiesel và làm giảm CO2 trong không khí đạt hiệu quả, các loài vi tảo phải được chọn lựa thỏa mãn các yêu cầu: sinh trưởng mạnh, hàm lượng lipid nhiều và có khả năng thích nghi tốt khi mức độ CO2cao [12] Khi khảo sát yếu tố nồng độ CO2 đối với mức độ sinh trưởng và sự tích lũy lipid trên một số loài tảo được lựa chọn nhằm sản xuất lipid, Chan Yoo và các cộng sự đã đạt được một số kết luận như sau [12]:

Ba loài tảo Scenedesmus sp., Chlorella sp., và Botryococcus braunii

được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 25 ± 10C, chiếu sáng liên tục 150µmol/m2s trong 2 tuần Để rút ngắn thời gian phase lag, vi tảo trước đó được nuôi trong môi trường sục không khí có 2% CO2 trong 1 tuần trước khi cấy mẫu Môi trường nuôi cấy thực sự thì sử dụng không khí chứa 10% CO2 hoặc khí thải từ ống khói với vận tốc 0.3v/v/m, nồng độ CO2 là 5.5%

- Đối với mức độ sinh trưởng của tế bào khi nồng độ CO 2 là 10%

Trong ba loài được khảo sát thì Scenedesmus sp là loài đạt năng suất

sinh khối cao nhất Sinh khối tối đa đạt được là 3.13g/L vào ngày thứ 14, năng suất sinh khối đạt 217.50 ± 11.24 mg sinh khối khô/L.ngày Trong một nghiên

tới 18%, và năng suất sinh khối cao nhất của loài Scenedesmus obliquus là

140mg sinh khối khô/L trong một ngày với nồng độ CO2 là 12% [50] Qua đó thấy rằng, khi nuôi ở 10% CO2, năng suất sinh khối của Scenedesmus sp cao

gấp 2-3 lần so với các nghiên cứu ở nồng độ khác, và cả ba loài tảo được khảo sát ở nồng độ CO2 này đều không gặp phải bất kỳ ảnh hưởng xấu nào Tuy

nhiên, B braunii lại có mức độ thích nghi chậm với nồng độ CO2 10%, do đó mức sinh trưởng của loài này thấp hơn Sục khí ở nồng độ cao hoặc sục khí liên tục CO2 2% sẽ làm giảm đáng kể pH của môi trường [60] Lee và các cộng sự [41] đã đề xuất rằng khi tăng mật độ tế bào ban đầu thì sẽ tăng được sức chịu dựng của vi tảo đối với nồng độ CO2 cao và giảm được thời gian

thích nghi Như vậy, nếu B braunii được cho thích nghi với nồng độ CO2 thấp trước đó, thì mức độ sinh trưởng và sản lượng sinh khối sẽ có thể gia tăng mà không cần qua trải qua thời kỳ thích nghi [12]

- Đối với lipid và acid béo khi nồng độ CO 2 là 10%

Hàm lượng lipid tổng trong vi tảo theo nghiên cứu của Chan Yoo và các cộng sự đạt từ 6.25% tới 25.79% khối lượng khô Từ ngày thứ 7 đến ngày thứ

14, các giá trị có xu hướng giảm Hàm lượng lipid trong Scenedesmus sp thì thấp hơn so với B braunii, nhưng do Scenedesmus sp có năng suất sinh khối

cao nên có năng suất lipid tổng cao nhất trong ba loài khảo sát

Bảng 2 3: Năng suất sinh khối và năng suất lipid của Botryococcus braunii,

của B braunii trong phase cân bằng sớm thì cao hơn trong phase sinh trưởng

theo hàm số mũ (phase log) Mặc dù hàm lượng lipid của cả ba loài tảo được Chan Yoo khảo sát với nồng độ 10% CO2 có thấp hơn một chút so với kết quả nghiên cứu trong các bản báo cáo khác, nhưng chỉ xét trên phase cân bằng thì hàm lượng này lại cao hơn [12]

Bảng 2 4: Thành phần các acid béo của Botryococcus braunii, Chlorella

Loài (% w/w acid C16:0

béo)

C16:1 (% w/w acid béo)

C18:0 (% w/w acid béo)

C18:1 (% w/w acid béo)

C18:2 (% w/w acid béo)

lipid tổng trong B braunii [12] Tỷ lệ này là rất cao khi so sánh với tỷ lệ acid

oleic đạt được là 28% trong bản báo cáo của Ranga Rao và các cộng sự [60]

Vì vậy, có thể kết luận rằng, nồng độ CO2 10% là một nồng độ khá tối ưu

để nuôi cấy vi tảo thu lipid nhằm mục đích sản xuất biodiesel Để khắc phục nhược điểm hàm lượng lipid tổng hơi thấp, ta có thể sử dụng nồng độ 10%

CO2 kết hợp với một số yếu tố dinh dưỡng tối ưu khác, vấn đề chính là ở nồng

độ này có thể thu được thành phần lipid phù hợp cho yêu cầu sản xuất biodiesel chất lượng cao, nhất là trên một số chủng cụ thể được lựa chọn Vấn

đề sinh trưởng chậm của một số loài như B braunii, ta có thể áp dụng một số

biện pháp cải thiện như tiền thích nghi giống với nồng độ CO2 thấp để rút ngắn thời gian thích nghi khi nuôi cấy ở nồng độ CO2 cao

22

- Khi nuôi bằng khí thải từ ống khói, nồng độ CO 2 5.5%

Hai trong ba loài tảo nêu trên, B braunii và Scenedesmus sp được nuôi

ở hai chế độ để so sánh, đó là sục không khí và dùng khí thải từ ống khói có nồng độ CO2 là 5.5% Năng suất sinh khối của B braunii và Scenedesmus sp

với khí thải từ nhà máy lần lượt là 77 và 203mg/L.ngày Năng suất lipid của

B braunii và Scenedesmus sp đạt 21 và 39mg/L.ngày, tương đương với hàm lượng lipid là 24 và 18% [12] Qua đó chứng tỏ rằng B braunii vẫn giữ được

hàm lượng lipid cao khi nuôi bằng khí thải như khi nuôi bằng khí chứa 10%

CO2 Sinh khối và hàm lượng lipid trong các chủng Scenedesmus sp thì tương

đương khi nuôi ở 5% CO2 [66]

Thành phần acid béo của B braunii và Scenedesmus sp khi nuôi sục

không khí và khí thải ống khói thì gần như không thay đổi, đặc trưng cho mỗi

loài Tỷ lệ acid oleic trong B braunii lần lượt là 56 và 59% lượng acid béo

tổng khi nuôi bằng không khí và khí thải Vì vậy kết luận rằng có thể sử dụng

khí thải từ ống khói để nuôi B.braunii nhằm sản xuất biodiesel vì có hàm

lượng lipid nhiều và trong đó thành phần acid oleic chiếm tỷ lệ rất cao [12]

2.2.2.2 Thành phần Nitrogen

Nitrogen là một yếu tố ảnh hưởng sâu sắc đến sự chuyển hóa và tích lũy lipid trong nhiều loài vi tảo Thêm vào đó, điều khiển nồng độ nitrogen khá dễ dàng và đây là một yếu tố có chi phí thấp khi so sánh với các yếu tố khác [14]

Vì vậy, thành phần và hàm lượng nitrogen bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi tảo để tăng năng suất lipid đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu

Như đối tượng Chlorella vulgaris, khi được nuôi trong môi trường cơ

bản Bold, sử dụng CO2 có trong không khí (khoảng 300ppm) và NaNO3 là những nguồn cung cấp carbon và nitrogen duy nhất trong suốt quá trình thí nghiệm [5], nuôi cấy theo phương thức quang tự dưỡng trong 14 ngày dưới ánh sáng liên tục có cường độ 70µE/m2s, ở nhiệt độ 300C Nồng độ nitrogen

trung bình trong môi trường nuôi cấy Chlorella vulgaris theo Guillard là

1.50g/L, do đó khi khảo sát sự giảm nồng độ nitrogen để kích thích sự tích lũy lipid, Attilio và các cộng sự đã nghiên cứu ở 2 nồng độ khác là 0.750 và 0.375g/L để so sánh với nồng độ trung bình [5] Điều kiện hàm lượng nitrogen thấp trong môi trường nuôi cấy thực sự làm gia tăng đáng kể sự tích lũy lipid trong vi tảo [34] Vì vậy hàm lượng nitrate lần lượt được giảm đi còn ½ và ¼

23

so với nồng độ tiêu chuẩn trong khi cường độ chiếu sáng và tốc độ sục khí vẫn

giữ nguyên trong suốt các thí nghiệm Ảnh hưởng của việc giảm thiểu nồng độ

NaNO3 trên sự sinh trưởng của C vulgaris được tóm tắt trong bảng sau:

Bảng 2 5: Tham số sinh trưởng và sự sản xuất lipid của C vulgaris ở các

nồng độ NaNO 3 khác nhau [5]

NaNO 3 (g/L) µ-Tốc độ sinh trưởng đặc trưng (1/ngày) (g Sản lượng lipid

lipid /100g sinh khối khô ) Năng suất lipid (mg lipid /L.ngày) 1.500 0.14±0.00 5.90±0.42 8.16±0.65

0.750 0.14±0.01 14.37±0.64 20.44±0.75

0.375 0.14±0.00 15.31±0.51 20.30±0.40

Qua đó ta thấy, trong khi tốc độ sinh trưởng riêng của C vulgaris thay

đổi không đáng kể thì hàm lượng lipid tăng gấp 3 lần khi giảm nồng độ nitrate

từ 1.500g/L còn 0.375g/L

Khi thay đổi nồng độ NaNO3, hàm lượng acid palmitic không thay đổi đáng kể [5] Tuy nhiên, hàm lượng acid linolenic acid (C18:3) trong

C vulgaris thì phù hợp với tiêu chuẩn biodiesel sử dụng cho các phương tiện

vận chuyển ở Châu Âu (12%, mol/mol) [38]

Hình 2 2: Phần trăm các loại FAME trên tổng lượng FAME (g/100g FAME )

của C vulgaris tại các nồng độ NaNO3 khác nhau [A4]

(FAME: fatty acid methyl ester)

Tuy nhiên trong kỹ thuật nuôi cấy vi tảo, nguồn nitrogen có thể được sử dụng dưới nhiều dạng khác nhau, như là ammonia, nitrate, nitrite và urea Tùy

24

thuộc vào đặc tính loài, việc sử dụng các nguồn nitrogen khác nhau đem đến

những hiệu quả khác nhau Như đối với Ellipsoidion sp, sử dụng ammonium

làm nguồn cung cấp nitrogen sẽ đem lại mức độ sinh trưởng và hàm lượng

lipid cao hơn khi sử dụng urea và nitrate [88] Neochloris oleoabundans khi

nuôi bằng nitrate sẽ sinh trưởng nhanh hơn và tích lũy lipid nhiều hơn khi nuôi với urea [42], nhưng tế bào lại sinh trưởng yếu trong môi trường sử dụng nguồn nitrogen là ammonium Thêm vào đó, nhiều nghiên cứu cho thấy rằng

cả ba loại nguồn nitrogen là nitrate, ammonium và urea đều có thể đáp ứng tốt

đối với Spirulina platensis [16, 74] Trong số các nguồn nitrogen hữu cơ,

urea đóng một vai trò quan trọng và thường được sử dụng trong nuôi cấy vi tảo trên quy mô lớn bởi vì giá thành của urea thì thấp hơn nhiều khi so với các nguồn nitrogen khác [14]

Ngoài ra, chế độ nuôi cấy ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và thành phần hóa sinh trong tế bào vi tảo Sử dụng phương pháp nuôi cấy fed-batch để điều chỉnh mức độ bổ sung môi trường nhằm gia tăng năng suất [14] Cải thiện năng suất lipid có thể thực hiện bằng biện pháp nuôi cấy fed-batch bổ sung gián đoạn nguồn nitrogen [79] Thêm vào đó, trong phương pháp nuôi cấy bán liên tục, nồng độ chất dinh dưỡng ban đầu và mức độ khôi phục cũng được

sử dụng để biến đổi các thành phần hóa sinh trong tế bào vi tảo [56, 22]