Các kỹ thuật Trong nghiên cứu & phân tích Protein

Các kỹ thuật Trong nghiên cứu & phân tích Protein Tổng Quan Proteomics Trong proteome xác định thành phần protein bổ sung chuyên biệt mặt thời gian tế bào hệ gen (genome) Nó bao gồm tịan protein biểu tế bào theo thời gian bao gồm khía cạnh hình thái thay đổi sau trình dịch mã từ mRNA Bộ gene sinh vật thường ổn định theo thời gian thường đại diện cho tất tế bào SV vật thường ổn định lịai Ngược lại, hệ Protein sinh vật thường có thay đổi lớn theo thời gian đáp ứng nhanh với nhân tố từ bên ngòai đặc biệt khác nhóm tế bào Tổng Quan Proteomics Proteomics trình nghiên cứu tịan protein hay hệ protein có từ mơ hay dịng tế bào Ngày người ta phân chia proteomics thành classical proteomics functional proteomics Classical proteomics tập trung nghiên cứu tòan protein hòan chỉnh thường từ hai dòng tế bào xử lý khác nhau; functional proteomics nghiên cứu protein mức độ giới hạn Ba câu hỏi cho q trình nghiên cứu proteomic: 1) Protein diện? 2) Có protein đặc biệt tương tác với protein khác hay với tòan hệ protein (networks)? 3) Protein đặc biệt (structure)? Tổng Quan Proteomics Thuật ngữ Proteomics bao gồm khỏang rộng nguyên lý mà mục đích hướng đến việc hiểu rõ nghiên cứu, giám sát protein Việc gồm công việc liên quan trình tự di truyền với cấu trúc khơng gian chiều protein cấu trúc không gian ba chiều với chức protein, phát triển phương pháp phân tách protein kỹ thuật nhằm hồ sơ hóa protein nghiên cứu mối tương tác proteinprotein Proteomics hứa hẹn nhiều khám phá tác nhân nghiên cứu phát triển dược liệu thông qua việc xác định chức hàng ngàn protein chưa xác định mà người ta mong đợi phát gene người Proteomics cung cấp liệu thực nghiệm giúp cho việc cải tiến chương trình phần mềm để tiên đóan cấu trúc protein từ trình tự DNA, giúp nghiên cứu để giải thích thơng tin có gene Phải Chăng hệ gene cung cấp cho ta điều diệu kỳ??? Chỉ có khoảng 30,000 genes cấu trúc gene người , có 100,000 proteins giải mã từ gene hệ proteome người Genomics cung cấp cho ta lượng thông tin lớn hầu hết để lại cho nhiều điều chưa giải thích với mức độ nghiên cứu Hay nói cách khác, genomics để lại cho ta nhiều câu hỏi câu trả lời Các lãnh vực đột phá Proteomics hứa hẹn giải đáp câu hỏi thơng qua việc nghiên cứu cách có hệ thống protein đựơc dịch mã từ hệ gene Phải Chăng hệ gene cung cấp cho ta điều diệu kỳ??? The central dogma: parents DNA (genes) mRNA proteins Proteomics Nghiên cứu tòan protein đựơc biểu genomes Systematic, parallel protein analysis Commercial Relevance of Proteomics “The Proteome” ~750,000 Proteins Markers disease relevant proteins Targets 8-10K proteins Diagnostics Therapeutics + Drugs One Genome Different Proteomes Life is based on proteins and their interactions Proteomics – Các hứơng nghiên cứu • Protein nào? Khi nào? đâu đối tượng nào? Thành phần protein: Xác định thành phần phức hợp đại phân tử, tổ chức, tế bào hay quan Protein profiling: So sánh thay đổi mặt số lượng protein hay nhiều đối tượng Vị trí hay chất tiết nội bào – phân lập thành phần tế bào cách sử dụng Ab hay fusion protein Tương tác protein: xác dịnh mối tương tác protein Các yếu tố chủ yếu đưa đến việc nghiên cứu Protein Nghiên cứu (gần) hịan tất gen Cơng cụ nghiên cứu khối phổ Sinh tin học – Phần mềm, phần cứng Các cải tiến kỹ thuật tách chiết protein Tự động hóa Các tiến kỹ thuật Ab array Các phương pháp nghiên cứu Proteomics Kỹ thuật điện di hai chiều (2DE) kỹ thuật tối ưu số kỹ thuật truyền thống cho phép phân tách hàng ngàn protein gel Kỹ thuật xác định protein khối phổ (mass spectrometry) trở nên kỹ thuật tiến phân tích protein cơng cụ yếu nghiên cứu Proteomics Protein microarrays cho phép nghiên cứu theo thời điểm lượng lớn protein theo tương tác phân tử Nhiều thí nghiệm microarray thường thực với khối phổ Các phương pháp khác: X-ray crystallography, NMR, Edman degradation, etc 2D-electrophoresis Proteins phân tách phương pháp theo điểm đẳng điện trọng lượng phân tử chúng Trong phương pháp này, bước quan trọng bước chuẩn bị mẫu; protein tế bào hay mô cần nghiên cứu phải đưa dạng tan, đồng thời DNA tạp chất khác phải lọai bỏ Sau protein phân tách theo điện tích isoelectric focusing Bước thường thực cách điện di strip làm sẵn cố định theo gradient pH Điện di theo chiều thứ hai đơn giản điện di SDS-PAGE thông thường, với mẫu điện di cácc strip điện di theo chiều thứ Sau điện di chiều thứ 2, protein phát với thuốc nhuộm thông thường Coomassie hay nhuộm bạc 2D-electrophoresis Các cơng cụ kỹ thuật nghiên cứu Protein • Chuẩn bị mẫu • Điện di chiều • Nhuộm/ Blot • Phân tích hình ảnh • Tách / digestion • Phân tích khối phổ • Bioinformatics The Proteomics Toolbox Kỹ thuật 2-D đựơc sử dụng rộng rãi nghiên cứu protein Kỹ thuật cho phép: – Có thể xem so sánh hàng ngàn protein – Có khả phân tách dạng protein khác xảy có thay đổi sau dịch mã – Cho phép so sánh khác biệt giúp nghiên cứu thay đổi biểu protein hệ phức hợp sinh học – Là hệ thống đơn giản dễ sử dụng cho hầu hết PTN nghiên cứu Proteomics 2-D PAGE Phân tích phân biệt (Differential Analysis) A Proteins from cultured human cells A = Derivative of B Protein samples courtesy of Dr Steven Seeholzer, Fox Chase Cancer Center B Ứng dụng Proteomics • • • • • • • • Chỉ thị chẩn đóan/ khối u Khám phá mục tiêu điều chế thuốc Disease / protein pathways Vaccine antigens / sinh học trình lây nhiễm Plant drought tolerance / Kháng bệnh Toxicology Gene expression profiling Human Proteome Organization