TỔNG QUAN
Tổng quan về kháng sinh
Kháng sinh, một thành tựu vĩ đại của thế kỷ 20, đã góp phần giảm tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do nhiễm khuẩn, đặc biệt tại Việt Nam, nơi có khí hậu thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật Nhóm thuốc này đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị các bệnh lý nhiễm khuẩn, vốn là nguyên nhân hàng đầu gây ra bệnh tật và tử vong.
Kháng sinh (antibiotics) được định nghĩa: “là những chất kháng khuẩn
(antibacterial substaces) đươc tạo ra bởi các chủng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, Actinomycetes) có tác dụng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác”
Hiện nay, từ kháng sinh được mở rộng đến cả những chất kháng khuẩn có nguồn gốc tổng hợp như các sulfonamide và quinolon [2]
Các nhóm kháng sinh được phân loại theo cấu trúc hóa học thành các nhóm như sau:
Bảng 1.1.Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học
STT Tên nhóm Phân nhóm
Các penicilin Các cephalosorin Các beta-lactam khác Carbapenem Monobactam Các chất ức chế beta-lactamase
Các nhóm kháng sinh khác Sulfonamid
Đại cương về nhóm kháng sinh carbapenem
Nghiên cứu về biến đổi cấu trúc hóa học của peniciline và cephalosporin đã dẫn đến sự phát triển của nhóm kháng sinh beta-lactam mới, có khả năng kháng khuẩn rộng và kháng β-lactamase, đặc biệt hiệu quả đối với vi khuẩn Gram âm và trực khuẩn mủ xanh Nhóm kháng sinh này bao gồm imipenem, meropenem, ertapenem và doripenem, được FDA phê duyệt lần lượt vào các năm 1985, 1996, 2001 và 2007 Trong đó, imipenem và meropenem có phổ hoạt động rộng nhất chống lại hầu hết các chủng Pseudomonas và β-lactamase, trong khi ertapenem và doripenem có phổ hẹp hơn trên P.aeruginosa và Acinetobacter.
Các kháng sinh nhóm này đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị các trường hợp nhiễm khuẩn nặng nghi ngờ do vi khuẩn đa kháng, đặc biệt là liên quan đến trực khuẩn gram âm Chúng cũng được sử dụng khi các phác đồ điều trị kháng sinh khác không còn hiệu quả.
Carbapenem là một loại kháng sinh thuộc nhóm β-lactamase bán tổng hợp, có cấu trúc phân tử khác biệt so với penicillin Điểm khác biệt chính nằm ở việc một nguyên tử cacbon thay thế cho nguyên tử lưu huỳnh trong cấu trúc vòng thiazolidin, cùng với liên kết đôi giữa C-2 và C-3 Thêm vào đó, carbapenem còn có nhóm ethylhydroxyl gắn với vòng beta-lactam, trong khi penicillin có nhóm acylamino.
Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của các kháng sinh nhóm carbapenem
Carbapenem là một loại kháng sinh thuộc họ β-lactamase, hoạt động bằng cách gắn vào các protein gắn penicillin (PBPs), từ đó ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào vi khuẩn Việc này làm gián đoạn quá trình sinh tổng hợp thành tế bào, khiến vi khuẩn không còn lớp bảo vệ và bị tiêu diệt Các PBPs là enzyme quan trọng trong việc tạo liên kết chéo peptidoglycan, thành phần chính của vách tế bào vi khuẩn Mỗi loại carbapenem có ái lực đặc biệt với các nhóm PBPs khác nhau, dẫn đến tác dụng khác biệt so với các β-lactamase khác.
[10, 25,49] Vì vậy, thuốc có phổ kháng khuẩn rộng và không bị kháng chéo với các thuốc khác trong nhóm β-lactamase [14]
1.2.3 Phổ tác dụng của carbapenem
Carbapenem là nhóm kháng sinh phổ rộng, hiệu quả đối với cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm, bao gồm cả vi khuẩn hiếu khí và kị khí Nhóm thuốc này bền với các vi khuẩn sản sinh β-lactamase, và các loại thuốc trong nhóm carbapenem có phổ tác dụng tương tự nhau.
All drugs in this group are effective against Gram-positive cocci but show limited efficacy against MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) and enterococcal infections due to the inherent resistance of these bacterial species.
Carbapenem cho thấy hoạt lực in vitro mạnh mẽ đối với vi khuẩn hiếu khí Gram âm, với tất cả các kháng sinh trong nhóm đều có khả năng kháng khuẩn hiệu quả trên các vi khuẩn Gram âm.
Các kháng sinh thuộc nhóm carbapenem có hiệu quả cao đối với vi khuẩn kị khí, nhưng không tác động đến vi khuẩn không điển hình do chúng không có thành tế bào, là mục tiêu tác động của nhóm thuốc này.
1.2.4 Đánh giá xu hướng sử dụng kháng sinh carbapenem
Trong bối cảnh vi khuẩn đa đề kháng ngày càng gia tăng, carbapenem trở thành lựa chọn hàng đầu trong điều trị nhiễm khuẩn do vi khuẩn Gram âm sinh β-lactamase phổ rộng và vi khuẩn Gram âm đa kháng Nhóm kháng sinh này cũng được chỉ định cho các trường hợp nhiễm khuẩn nặng và bệnh nhân bị sốt giảm bạch cầu trung tính.
Kết quả khảo sát tại bệnh viện Bạch Mai giai đoạn 2012-2016 cho thấy lượng kháng sinh carbapenem, đặc biệt là meropenem, đã tăng gấp đôi trong 100 ngày nằm viện vào năm 2016 Meropenem được sử dụng nhiều nhất, tiếp theo là imipenem và ertapenem, nhờ vào hiệu quả và độ an toàn cao Phân tích lâm sàng cho thấy tỷ lệ đáp ứng lâm sàng và vi sinh của meropenem cao hơn so với imipenem, trong khi tỷ lệ biến cố bất lợi ở nhóm dùng meropenem lại thấp hơn đáng kể.
Năm 2016, Doripenem được đưa vào sử dụng với liều DDD/100 ngày nằm viện thấp nhất Phân tích tiêu thụ cho thấy nhóm kháng sinh này được sử dụng phổ biến ở tất cả các Khoa lâm sàng, Trung tâm và Viện Đặc biệt, ba đơn vị có mức tiêu thụ vượt trên 10 DDD/100 ngày nằm viện bao gồm Khoa hồi sức tích cực, Trung tâm hô hấp và Khoa truyền nhiễm.
Theo báo cáo của Nguyễn Thị Lệ Minh, tại khoa Hồi sức tích cực, Truyền nhiễm và Huyết học, tỷ lệ kháng thuốc của các chủng vi khuẩn phân lập đã đạt 64% đối với imipenem và 62% đối với meropenem vào năm 2011.
Meropenem
Meropenem (tên IUPAC: (4R,5S,6S)-3-[(3S,5S)-5-(dimethylcarbamoyl)pyrrolidin-3-yl]sulfanyl-6-[(1R)-1-hydroxyethyl]-4-methyl-7-oxo-1-azabicyclo[3.2.0]hept-2-ene-2-carboxylic acid) là một axit hữu cơ với công thức phân tử C15H25N3O5S và khối lượng phân tử 83,46 g/mol Meropenem có pKa1 = 2,9 và pKa2 = 7,4, chứa nhóm thio có ái lực mạnh với kim loại như vàng, cho phép hình thành liên kết S-Au thông qua liên kết cộng hóa trị Công thức cấu tạo và cấu trúc phân tử của meropenem được trình bày trong Hình 1.2.
Hình 1.2: Công thức cấu tạo và cấu trúc phân tử của meropenem
Meropenem là một kháng sinh thuộc họ β-lactamase, có tính không ổn định về mặt vật lý và hóa học Cấu trúc phân tử của meropenem chứa vòng β-lactam dễ bị mở vòng bởi các tác nhân như axit-base, ion kim loại, tác nhân oxy hóa và dung môi như nước và ancol Meropenem có điểm sôi 627°C và điểm nóng chảy trong khoảng 191-201°C Ở nhiệt độ phòng, meropenem có độ ổn định khoảng 9 giờ trước khi phân hủy dưới 10%, trong khi các dung dịch chuẩn có thể ổn định trong 24 giờ khi bảo quản ở 4°C Chất này thường xuất hiện dưới dạng bột tinh thể màu trắng đến vàng nhẹ, tan trong nước và methanol, nhưng thực tế không tan trong ethanol 95% và diethyl ete.
1.3.2 Dược lý và cơ chế tác dụng
Meropenem là một kháng sinh tổng hợp thuộc nhóm carbapenem, có cấu trúc và tác dụng dược lý tương tự như imipenem và ertapenem Điểm khác biệt của meropenem so với imipenem là khả năng bền vững trước tác dụng thủy phân của enzyme dehydropeptidase (DHP).
1) có ở vi nhung mao của tế bào ống lượn gần thận, vì vậy không cần dùng cùng với chất ức chế DHP-1[3]
Thuốc diệt khuẩn hoạt động bằng cách ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào vi khuẩn, thẩm thấu qua màng tế bào của cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương Chúng gắn kết với các protein liên kết penicillin (PBP) và làm bất hoạt các protein này, với ái lực mạnh nhất đối với PBP 2, 3 và 4 của Escherichia coli và Pseudomonas aeruginosa, cũng như PBP 1, 2 và 4 của các loại vi khuẩn khác.
Meropenem có phổ kháng khuẩn tương tự như imipenem, bao gồm hầu hết vi khuẩn Gram dương, Gram âm và một số vi khuẩn kỵ khí Tuy nhiên, meropenem có tác dụng mạnh hơn imipenem đối với Enterobacteriaceae, trong khi lại kém hơn trên vi khuẩn Gram dương Nồng độ diệt khuẩn của meropenem thường gấp một hoặc hai lần nồng độ kìm khuẩn, ngoại trừ Listeria monocytogenes, nơi nồng độ diệt khuẩn chưa được xác định Meropenem cũng bền vững với nhiều loại β-lactamase phổ rộng, nhưng không chịu được tác dụng thủy phân của metallo-beta lactamase.
Meropenem có phổ hoạt tính in vitro và trên lâm sàng với các vi khuẩn sau đây:
Gram-positive and aerobic bacteria include penicillin-sensitive strains of Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, and Staphylococcus aureus, which encompasses β-lactamase-producing strains but excludes oxacillin/methicillin-resistant strains.
Enterococcus faecalis (không bao gồm chủng kháng vancomycin) và S.viridans
Aerobic Gram-negative bacteria, including Escherichia coli, Haemophilus influenzae (including β-lactamase producing strains), Klebsiella pneumoniae, Neisseria meningitidis, Proteus mirabilis, and Pseudomonas aeruginosa, play significant roles in various infections and are critical in clinical microbiology.
Các vi khuẩn kị khí: Bacteroides fragilis, B thetaiotaomicron và
Kháng chéo giữa meropenem và các kháng sinh carbapenem khác có thể xảy ra do một số cơ chế như giảm tính thấm của màng ngoài vi khuẩn gram âm, giảm ái lực đối với PBP, tăng cường vận chuyển thuốc ra ngoài tế bào vi khuẩn, và sản xuất β-lactamase có khả năng thủy phân các carbapenem Tuy nhiên, không có kháng chéo giữa meropenem và các nhóm kháng sinh như quinolone, aminosid, macrolid và tetracyclin Một số chủng vi khuẩn có thể kháng nhiều nhóm kháng sinh do cơ chế giảm tính thấm màng tế bào và tăng cường vận chuyển thuốc ra ngoài.
Meropenem được tiêm tĩnh mạch và không hấp thu qua đường uống Sau khi tiêm 0,5g và 1g meropenem trong 5 phút, nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt lần lượt 50 và 112 microgam/ml.
30 phút, nồng độ đỉnh thu được tương ứng là 23 và 49 mcirogram/ml [3,31]
Thuốc có sự phân bố rộng rãi trong các tổ chức của cơ thể, bao gồm dịch não tủy, mật, cơ, da, van tim và dịch phúc mạc Thể tích phân bố ở người lớn khoảng 15-20 lít, trong khi ở trẻ em là 0,3-0,4 lít/kg Ngoài ra, thuốc liên kết với protein huyết tương khoảng 2%.
Meropenem được chuyển hóa thông qua phản ứng thủy phân vòng β-lactamase, dẫn đến sự hình thành chất không có hoạt tính Các nghiên cứu in vitro chỉ ra rằng meropenem bền vững hơn với enzyme DHP-1 so với imipenem, do đó không cần sử dụng kèm chất ức chế DHP-1.
Thời gian bán thải của meropenem trong huyết thanh khoảng 1 giờ, nhưng kéo dài hơn ở những bệnh nhân suy thận Độ thanh thải trung bình là 287 ml/phút với liều 250 mg và 205 ml/phút với liều 2g Thuốc chủ yếu được thải trừ qua bài tiết ở ống thận và lọc qua cầu thận, với khoảng 70% liều dùng được tìm thấy ở dạng không đổi trong nước tiểu trong vòng 12 giờ, trong khi chỉ có khoảng 2% thải trừ qua phân Ngoài ra, meropenem có thể được loại trừ bằng phương pháp thẩm tách máu.
Meropenem được chỉ định điều trị nhiễm khuẩn do vi khuẩn Gram âm và Gram dương nhạy cảm, phù hợp cho cả người lớn và trẻ em từ 3 tháng tuổi trở lên.
Viêm phổi (viêm phổi cộng đồng hoặc mắc phải tại bệnh viện)
Nhiễm khuẩn đường tiết niệu có biến chứng
Nhiễm khuẩn phụ khoa, như niêm nội mạc tử cung và các bệnh lý viêm vùng chậu
Viêm phế quản-phổi ở bệnh nhân xơ hang
Nhiễm khuẩn trong và sau khi sinh
Nhiễm khuẩn da và tổ chức dưới da có biến chứng
Viêm màng não nhiễm khuẩn cấp tính, bệnh nhân sốt do giảm bạch cầu
Meropenem, khi sử dụng đơn lẻ hoặc kết hợp với các kháng sinh khác, đã được chứng minh hiệu quả trong việc điều trị nhiễm khuẩn hỗn hợp Tuy nhiên, hiện tại vẫn chưa có kinh nghiệm lâm sàng về việc sử dụng thuốc này ở trẻ em bị giảm bạch cầu trung tính hoặc có tình trạng suy giảm miễn dịch nguyên phát và thứ phát.
1.3.2.6 Tác dụng phụ của meropenem
Meropenem có thể gây ra một số tác dụng phụ không mong muốn, phổ biến nhất là rối loạn tiêu hóa như buồn nôn, nôn và tiêu chảy Ngoài ra, có thể xảy ra phản vệ, tăng bạch cầu ưa eosin, nổi mề đay và viêm đại tràng Đặc biệt, động kinh hoặc co giật có thể xuất hiện ở những bệnh nhân có tiền sử tổn thương hệ thần kinh trung ương hoặc người suy thận.
Các phương pháp xác định meropenem
Phương pháp sắc ký, đặc biệt là sắc ký lỏng ghép nối với detector UV, là công cụ phổ biến để xác định các chất có hoạt tính sinh học như meropenem Nghiên cứu của Thomas Roth và nhóm đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector UV để xác định meropenem trong huyết tương Meropenem được tách ra từ huyết tương thông qua quá trình tủa protein bằng methanol và sau đó được tách trên cột SPE với dung môi metanol/nước (7:3, v/v) Pha động sử dụng đệm TRIS/HCl 100mM (pH 8,5) chứa 15% metanol, với thể tích bơm mẫu là 20µl Meropenem được phát hiện ở bước sóng 300nm, với khoảng tuyến tính từ 10mg/l đến 200mg/l và hệ số hồi quy tuyến tính r² > 0,999 Đường cong hiệu chuẩn được xây dựng trong hơn 2 tuần, cho thấy độ biến thiên chỉ 2%, chứng tỏ độ ổn định và chính xác cao, trong khi giới hạn phát hiện trong huyết tương đạt 1,06 mg/l.
Nhóm tác giả Liusheng Huang và các cộng sự đã phát triển mô hình mô phỏng PK/PD cho nhiễm trùng qua màng sinh học và nghiên cứu tính ổn định của meropenem Họ cũng đã xác nhận meropenem trong vi khuẩn bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối khối phổ LC-MS/MS, phương pháp này nổi bật với tính chọn lọc cao và thời gian phân tích ngắn, rất phù hợp cho các thuốc không ổn định như meropenem, chỉ giữ được tính ổn định trong vài giờ ở nhiệt độ phòng Thời gian chạy mẫu là 6,6 phút trên hệ thống API5000, với việc sử dụng chuẩn nội ceftazidime, thời gian này được rút ngắn xuống còn 1,4 phút 100 µl dịch mẫu được trộn với dung dịch chuẩn nội ceftazidime và sau đó được lọc, dịch lọc được bơm trực tiếp lên cột C18.
(50x2, 1mm) Đệm A: dung dịch NH4FA 10mM ở pH=4,0 Đệm B: MeCN trong 0,1% axit formic
Chương trình Gradient: 7% dung môi B (0-1 phút), từ 7-90% dung môi B (1-2,5 phút), 90% dung môi B ( 2,5-3,5 phút), 90% đến 7% dung môi B( 3,5-6 phút) và 7% dung môi
Phương pháp phân tích sử dụng thời gian rửa giải từ 3,6 đến 6,6 phút với dung dịch amoni formate 10mM (pH=4) và acetonitrile chứa 0,1% axit formic, ở tốc độ dòng 0,3ml/phút Khoảng tuyến tính được xây dựng từ 50 đến 25000 ng/ml, với độ chính xác và phần trăm độ lệch chuẩn đều dưới 15%, chứng tỏ phương pháp này có độ tin cậy cao Giới hạn định lượng của phương pháp đạt 50 ng/ml.
Sắc ký siêu hiệu năng (UHPLC) với detector mảng diode là một phương pháp hiệu quả và tiết kiệm hơn so với sắc ký khối phổ, đồng thời cải thiện độ phân giải, thông lượng và độ nhạy so với HPLC-UV truyền thống Nhóm nghiên cứu của Gregori Casals đã phát triển quy trình định lượng meropenem trong huyết tương người bằng UHPLC Pha động sử dụng dung dịch đệm Na2HPO4.2H2O 0,1M với pH 7, kết hợp với 13% methanol, với tốc độ dòng 0,25 ml/phút và nhiệt độ cột 30°C Detector mảng diode được sử dụng để theo dõi hiệu quả tách ở bước sóng 270-320 nm, định lượng meropenem tại 295 nm Dung dịch làm việc được chuẩn bị bằng cách hòa tan dung dịch trung gian trong đệm MES (1M, pH 6) với 20 µg/ml ceftazidime làm chuẩn nội Mẫu huyết tương được chuẩn bị với 100 µl đệm MES và 100 µl mẫu, sau đó thêm 500 µl acetonitrile, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút và bay hơi dưới dòng khí nitơ ở 37°C Phần dư được hòa tan trong 200 µl dung dịch đệm MES, ly tâm 1.000 vòng/phút trong 10 phút Đường chuẩn được xây dựng từ 0,5-100 µg/ml, với giới hạn dưới là 0,5 µg/ml và giới hạn trên là 100 µg/ml, độ lệch chuẩn tương đối không vượt quá 15%.
Jens Martens Lobenhoffer và nhóm nghiên cứu đã áp dụng phương pháp HILIC-khối phổ để định lượng meropenem trong huyết tương người Quy trình chuẩn bị mẫu đơn giản, chỉ cần thêm đệm, bổ sung chất nội chuẩn, thực hiện kết tủa protein và ly tâm.
Phân tích mẫu huyết tương nhanh chóng nhờ vào độ nhạy cao của khối phổ, cho phép sử dụng chỉ 10 μl mẫu Cột sắc ký Hypersil GOLD HILIC, với vật liệu nền silica và lớp phủ polyethylenimide, cho thời gian lưu của meropenem là 4,17 phút Khoảng nồng độ tuyến tính của meropenem dao động từ 1 μg/ml đến 50 μg/ml, với hệ số tương quan R = 0.9997 và giá trị LOQ là 1 μg/ml.
Ali K Attia và cộng sự đã phát triển phương pháp vonampe sóng vuông (SWV) với điện cực biến đổi hóa học để xác định nồng độ meropenem trong huyết tương Điện cực này được chế tạo từ 15mg MWVNTs 3%, 485mg than chì và 0,3ml dầu prafin Sử dụng điện cực trong điều kiện độ rộng xung 50ms, độ cao xung 25mV và tốc độ quét 50mVs, nồng độ tuyến tính của meropenem đạt từ 2,5.10 -8 mol/l đến 8,0.10 -6 mol/l, với giới hạn phát hiện (LOD) là 2,9.10 -9 mol/l Phương pháp cho phép xác định đồng thời linezolid, meropenem và theophylline trong mẫu huyết tương, và đã được áp dụng để đo mẫu huyết tương của tình nguyện viên sau khi sử dụng thuốc.
60 phút, cho kết quả với độ lặp lại và độ chính xác cao, hàm lượng linezolid đạt 3,58.10 -5 mol/l, meropenem: 2,83.10 -5 mol/l, theophylline: 3,41.10 -5 mol/l
1.4.3 Phương pháp điện di mao quản
Phương pháp điện di mao quản là một kỹ thuật tiên tiến để phân tích meropenem, mang lại nhiều ưu điểm so với phương pháp sắc ký lỏng (LC) trong việc chuẩn bị mẫu Khác với LC, phương pháp này không yêu cầu phải kết tủa protein trong huyết tương trước khi đo, giúp tiết kiệm thời gian Ngoài ra, điện di mao quản có độ lặp lại và độ nhạy cao, đồng thời yêu cầu lượng mẫu thấp, làm cho thời gian phân tích trở nên ngắn hơn.
Nhóm nghiên cứu của Yahya Mrestani đã áp dụng phương pháp điện di mao quản có độ nhạy cao (CZE) kết hợp với detector UV để xác định meropenem trong dung dịch nước cũng như trong các mẫu sinh học như nước tiểu và huyết tương.
Khi xác định meropenem trong nước, việc sử dụng mao quản có độ nhạy cao mang lại kết quả đáng kể, cải thiện giới hạn phát hiện gấp 10 lần so với mao quản tiêu chuẩn.
Meropenem được xác định trong mẫu huyết tương tại pH 7,2, với phân tích định lượng được thực hiện ở hai bước sóng 200nm và 303nm Các thành phần của huyết tương có khả năng hấp thụ ánh sáng tại những bước sóng này.
Meropenem có thể được xác định trực tiếp ở bước sóng 303nm, với phương pháp đo trong huyết tương bằng cách pha loãng mẫu với tỉ lệ 1:4 Kết quả điện di cho thấy meropenem được tách hoàn toàn khỏi các thành phần huyết tương, với khoảng tuyến tính từ 0,5-200 àg/ml và giới hạn phát hiện là 4 àg/ml Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian di chuyển là 5% và của đỉnh cực đại là 4% ở nồng độ 10 àg/ml Đường chuẩn có phương trình tuyến tính (y = 10.1x + 20.1) với hệ số tương quan 𝑅² = 0,999 Độ thu hồi trung bình từ các mẫu là 98,6% ở nồng độ 5 mg/ml và 97,8% ở nồng độ 50 mg/ml so với dung dịch chuẩn Đối với mẫu nước tiểu, mẫu được pha loãng trong dung dịch đệm và có giới hạn phát hiện là 0,3 àg/ml, với độ lệch chuẩn tương đối là 2,0%.
Toshihiro Kitahashi và Itaru Furuta đã phát triển một phương pháp xác định meropenem trong huyết thanh bằng cách tiêm trực tiếp huyết thanh vào mao quản mà không cần bước tiền xử lý Meropenem được phát hiện ở bước sóng 297nm, với dung dịch đệm là natritetraborate 25mM và NaOH 0,1M chứa natridodecyl sulphate 90mM, pH Thời gian di chuyển của meropenem là 7,2 phút, với giới hạn phát hiện (LOD) là 2,0mg/l Độ lệch chuẩn tương đối giữa các ngày và độ chính xác lần lượt là 3,43-8,87% và 4,28%.
8,54% Hiệu suất thu hồi đạt 94-111% và 92-105%
Phương pháp phân tích nhanh chóng và đáng tin cậy, giúp giảm lượng máu cần thu thập và giảm thiểu chất thải lỏng Hệ thống phân tích tự động hoạt động dễ dàng, giảm thiểu sai số giữa các phép đo do không cần bước tiền xử lý mẫu Thông tin về các phương pháp xác định meropenem, điều kiện xử lý mẫu, khoảng tuyến tính và giới hạn phát hiện được trình bày trong Bảng 1.2.
Bảng 1.2.Một số nghiên cứu xác định meropenem
Tên phương pháp Điều kiện xử lý mẫu Khoảng tuyến tính LOD TLTK
Sắc ký lỏng hiệu năng cao detector
Meropenem được tách khỏi huyết tương bằng cách tủa protein sử dụng metanol, sau đó được chiết trên cột SPE bằng metanol/ nước (7:3,v/v)
Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ (LC-
100àl dịch mẫu được ly tâm với 100àl chuẩn nội (ceftazidime)
10000 vòng/phút trong 4 phút Dịch sau ly tâm được bơm vào hệ LC- MS/MS
Sắc ký lỏng siêu hiệu năng detector DAD
(UHPLC/DAD) dịch mẫu được ly tâm với chuẩn nội (ceftazidime) và đệm MES, ly tâm
13000 vòng/phút trong 5 phút Dịch sau ly tâm được bay hơi đến khô bằng nito , phần dư được hoàn nguyên trong đệm MES, ly tâm
10000 vòng/phút trong 10 phút Dịch thu được bơm vào cột
Sắc ký lỏng tương tác thân nước (HILIC)
Thêm dung dịch đệm, bổ sung chất nội chuẩn, kết tủa protein và ly tâm
1 àg/ml- 50 àg/ml 0,3 àg/ml [28]
Phương pháp vonampe sóng vuông (SWV)
Meropenem được tách ra khỏi nền mẫu bằng cách tủa protein sử dụng ACN, sau đó ly tâm
15000 vòng/phút trong 5 phút, dịch sau ly tâm được hòa
2,9.10 -9 mol/l [13] trong đệm BR (pH)
Phương pháp điện di mao quản vùng
Mẫu huyết tương được pha loãng trong nước với tỉ lệ 1:4
Mẫu nước tiểu được pha loãng trực tiếp trong dung dịch đệm
Phương pháp điện di mao quản trực tiếp
Tiêm trực tiếp huyết thanh vào mao quản mà không cần bước tiền xử lý mẫu
Giới thiệu về vật liệu vàng nano và ứng dụng
Nano, một thuật ngữ có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, mang nghĩa là kích thước nhỏ Hạt nano được xác định là những hạt có kích thước nằm trong khoảng từ 1 đến 100 nanomet.
Vào năm 1857, Michael Faraday phát hiện ra các hạt nano vàng ruby (AuNPs), mở đường cho sự phát triển của công nghệ nano hiện đại Sau đó, bốn mươi năm, Zsigmonday đã kết hợp công nghệ của mình với khám phá của Faraday và giới thiệu một quy trình mới.
Phương pháp phát triển mầm vẫn được áp dụng hiện nay để tổng hợp hạt nano vàng Zsigmondy đã phát minh ra một máy siêu âm nhằm mô tả cấu trúc, hình dạng và kích thước của hạt nano vàng.
Các hạt vàng nano có kích thước từ 1-100nm sở hữu tính chất quang, điện độc đáo khác biệt so với vàng dạng khối Sự khác biệt nổi bật giữa vàng nano và vàng khối là sự thay đổi màu sắc, với hạt vàng nano có thể chuyển từ màu vàng sang đỏ tía, tím hoặc xanh tùy thuộc vào kích thước của chúng Hiện tượng này được giải thích bởi hiệu ứng plasmon bề mặt.
Hình 1.3: Màu sắc của các keo vàng nano theo kích thước hạt Bảng 1.3 Kích cỡ các hạt nano vàng được sử dụng hiện nay
Kích cỡ của các hạt (nm)
Thể tích của hạt (nm 3 )
1.5.2 Tính chất quang của hạt nano vàng
1.5.2.1 Hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt cục bộ (Localized surface plasmon resonace :LSPR)
Hạt nano vàng có tính chất vật lý và hóa học phụ thuộc vào sự giam cầm không gian của các hạt điện tử, dẫn đến sự thay đổi các thuộc tính theo kích thước, hình dạng, mức độ tổng hợp và môi trường Chúng thể hiện màu sắc đặc trưng, với màu đỏ rượu đặc trưng do hiệu ứng cộng hưởng plasmon bề mặt (LSPR) gây ra Tính chất quang học này rất quan trọng và được ứng dụng rộng rãi, đặc biệt trong chẩn đoán và điều trị ung thư.
Hình 1.4.Hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt
Điện trường của sóng điện từ tác động lên các electron tự do trên bề mặt hạt nano, gây ra sự phân cực do electron bị dồn về một phía Dưới tác động của lực phục hồi Coulombic, các electron trở lại vị trí ban đầu, tạo ra sự dao động gọi là "plasmon" Khi tần số dao động của đám mây electron trùng với tần số của bức xạ điện từ, hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt xuất hiện, đặc biệt ở hạt vàng nano, dẫn đến sự hấp thụ mạnh ánh sáng trong vùng khả kiến và thay đổi màu sắc của dung dịch nano vàng Số lượng và vị trí của dải plasmon phụ thuộc vào kích thước, hình thái của hạt vàng nano, cũng như hằng số điện môi, chỉ số khúc xạ của môi trường xung quanh, trạng thái bề mặt và khoảng cách giữa các hạt.
1.5.2.2 Sự phụ thuộc của tính chất quang học vào kích thước hạt a) Hạt nano vàng dạng cầu Để giải thích được các tính chất quang của các hạt nano kim loại, Mie đã giải bài toán tán xạ của sóng điện từ trên một hạt cầu kim loại bằng cách giải phương trình Maxwell Bằng cách này ông đã mô tả tính chất quang học (tán xạ và hấp thụ) của vàng nano dạng cầu ở bất kỳ kích thước nào Theo đó, với vàng nano dạng cầu, SPR xảy ra ở vùng khả kiến tại bước sóng khoảng 520-540nm (hình 1.5) Nếu kích thước (d) của hạt tăng lên thì cực đại hấp thụ ứng với SPR sẽ dịch chuyển về vùng có bước sóng dài, tức là vùng ánh sáng đỏ Tuy nhiên, khi hạt cầu lớn đến một kích thước nào đó, sẽ trở thành dạng khối (bulk) và hiện tượng SPR sẽ biến mất [5,44]
Hạt nano vàng dạng thanh có tính chất quang học đặc biệt, được giải thích qua thuyết Gans, cho thấy sự thay đổi trong cộng hưởng plasmon bề mặt khi hình dạng của hạt không còn là cầu Đối với hạt nano dạng thanh, sự phân cực lưỡng cực của điện tử theo chiều ngang và dọc không còn tương đương, dẫn đến sự xuất hiện của hai loại cộng hưởng plasmon: cộng hưởng plasmon theo chiều dọc (TSPR) và cộng hưởng plasmon theo chiều ngang (LSPR) Dao động TSPR có cực đại trong vùng khả kiến (520-540 nm), trong khi dao động LSPR mạnh hơn và có cực đại trong vùng bước sóng lớn hơn, từ khả kiến đến hồng ngoại gần, tùy thuộc vào tỉ số cạnh của hạt nano.
Hình 1.6 Sự phân bố điện tích trên một thanh nano dưới kích thước của ánh sáng tới
Bước sóng hấp thụ cực đại của dao động LSPR phụ thuộc vào chỉ số khúc xạ của môi trường xung quanh Khi chỉ số khúc xạ tăng, SPR có xu hướng chuyển sang vùng ánh sáng màu đỏ, với sự dịch chuyển gần như tuyến tính theo chỉ số khúc xạ Tính chất này rất quan trọng trong các ứng dụng cảm biến plasmon.
1.5.2.3 Một số tính chất khác của hạt nano vàng a Tính chất nhiệt
Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của vật liệu phụ thuộc vào mức độ liên kết giữa các nguyên tử trong mạng tinh thể, với số phối vị của các nguyên tử ảnh hưởng đến khả năng tái sắp xếp của chúng Các nguyên tử ở bề mặt vật liệu có số phối vị nhỏ hơn so với các nguyên tử bên trong, dẫn đến sự thay đổi dễ dàng hơn về trạng thái Do đó, khi kích thước hạt nano giảm, nhiệt độ nóng chảy cũng giảm Ví dụ, hạt vàng có kích thước 2nm có Tm khoảng 0 °C, trong khi hạt 6nm có Tm đạt 950 °C.
Tính dẫn điện của kim loại rất tốt, hay điện trở của kim loại nhỏ nhờ vào mật độ điện tử tự do cao trong đó c Tính chất từ
Các kim loại quý như vàng và bạc có tính nghịch từ trong trạng thái khối nhờ vào sự bù trừ cặp điện tử Khi kích thước của vật liệu giảm, sự bù trừ này trở nên không hoàn hảo, dẫn đến việc vật liệu có từ tính tương đối mạnh Ngoài ra, tính chất xúc tác của các kim loại quý trên chất mang cũng đáng chú ý.
Các hạt nano vàng có kích thước dưới 10nm được sử dụng trong tổng hợp xúc tác và có khả năng kháng đầu độc Nghiên cứu cho thấy xúc tác nano vàng trên chất mang có thể chịu đựng sự đầu độc lưu huỳnh gấp 5-7 lần so với xúc tác thông thường Ngoài ra, nano Au còn có khả năng làm sạch lưu huỳnh đầu độc trên bề mặt xúc tác kim loại ở nhiệt độ thấp.
1.5.3 Công nghệ sản xuất hạt nano vàng
Hiện nay, có hai phương pháp chính để chế tạo vật liệu nano: phương pháp từ dưới lên và phương pháp từ trên xuống Phương pháp từ trên xuống bắt đầu từ các vật liệu khối và giảm kích thước của chúng, trong khi phương pháp từ dưới lên bắt đầu từ các nguyên tử hoặc ion kết hợp lại Các phương pháp tổng hợp keo vàng nano được chia thành ba nhóm: phương pháp hóa học, phương pháp bức xạ và phương pháp khử sinh học.
Phương pháp tổng hợp hạt nano vàng được phát triển bởi J Turkevich và đồng nghiệp vào năm 1951, hiện là phương pháp phổ biến nhất trong lĩnh vực này Trong quy trình, natri citrate hoạt động như chất khử và chất ổn định, phản ứng với vàng (Au) ở nhiệt độ cao để tạo ra huyền phù keo Phương pháp cho phép tổng hợp các hạt nano vàng đơn phân tán dạng cầu tan trong nước với kích thước từ 10-20nm và độ bền cao Kích thước hạt có thể điều chỉnh bằng cách giảm lượng
Vào năm 1994, Brust và Schiffrin đã phát triển một phương pháp tổng hợp hạt nano vàng ổn định nhiệt với kích thước từ 1,5-5,2nm, sử dụng tetraoctyl ammonium bromide (TOAB) để chuyển pha Au từ nước sang pha hữu cơ Tuy nhiên, TOAB không bảo vệ hạt nano một cách bền vững, dẫn đến hiện tượng kết tủa sau hai tuần Để khắc phục, cần bổ sung alkanethiol như một tác nhân làm bền mạnh hơn Việc thêm các chất khử cũng làm thay đổi màu sắc của pha hữu cơ từ cam sang nâu sẫm, chỉ ra sự hình thành của hạt nano vàng.
1.5.3.3 Phương pháp phát triển mầm
NGHIỆM
Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình xác định meropenem thông qua phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis, sử dụng hạt nano vàng Phương pháp này được áp dụng để xác định hàm lượng kháng sinh meropenem trong các mẫu dược phẩm.
Nghiên cứu được tiến hành phân tích trên đối tượng là mẫu thuốc chứa meropenem
Nội dung của nghiên cứu bao gồm:
1 Tổng hợp hạt nano vàng dạng cầu bằng phương pháp Turkevich
2 Khảo sát các đặc trưng quang học, hình thái học.v.v của dung dịch nano vàng điều chế được bằng các phương pháp UV-Vis, TEM
3 Khảo sát các yếu tổ ảnh hưởng đến phương pháp xác định meropenem bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis sử dụng hạt nano vàng
- Khảo sát chọn cực đại hấp thụ để đo độ hấp thụ quang
- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến dung dịch
-Khảo sát ảnh hưởng của môi trường phản ứng: nồng độ muối NaCl và pH
-Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch vàng và nồng độ dung dịch meropenem đến tỉ lệ độ hấp thu quang A660/A520
3 Đánh giá phương pháp phân tích
- Xác định khoảng tuyến tính
- Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, đánh giá độ chụm và độ chính xác của phương pháp phân tích
4 Áp dụng quy trình phân tích để phân tích mẫu thực tế: mẫu thuốc tiêm chứa meropenem
- Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu tới việc xác định meropenem
- Đánh giá độ chụm và độ thu hồi của phương pháp trên nền mẫu thuốc
- Xác định hàm lượng meropenem trong các mẫu thực tế.
Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
Tất cả hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều thuộc loại tinh khiết phân tích (PA) Danh sách thiết bị hóa chất được sử dụng được trình bày chi tiết trong bảng 2.1.
Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Tên hóa chất Nguồn gốc Độ tinh khiết
Vàng(III) clorua trihidrat (HAuCl4.3H2O) Merck, Đức PA
Chuẩn meropenem 99,5% Sigmal-Adrich PA
Natri citrate Merck, Đức PA
Natri clorua Merck, Đức PA
Natri hiđroxit Merck, Đức PA
Axit clohidric Merck, Đức PA
Natri cacbonat Merck, Đức PA
2.2.2 Dụng cụ và thiết bị
Các thiết bị sử dụng đều được hiệu chuẩn theo ISO 17025
- Máy quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS 1601 PC-Shimadzu (Nhật Bản), bước sóng làm việc từ 400-800nm, cuvet chiều dày 1cm
-Cân phân tích Scientech ZSA 210, hãng sản xuất: Scientech-Mỹ, độ chính xác 0,0001g -Máy đo pH HANA HI2210-02
Các thiết bị và dụng cụ khác:
- Ống ly tâm nhựa dung tích 15ml, 50ml
- Pipet chia vạch các loại: 1ml, 2ml, 5ml, 10ml
-Micropipet cỏc lọai: 20-200àl, 100-1000 àl
-Cốc thủy tinh chịu nhiệt dung tích 100ml, 250ml
- Bình định mức thủy tinh dung tích các loại: 10ml, 25ml, 50ml, 100ml, 250ml.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp chế tạo hạt nano vàng
Các hạt nano vàng được chế tạo bằng phương pháp Turkevick và các cộng sự [23], trong đó muối HAuCl4 được khử xuống Au bằng natri citrate (hình 2.1)
Hình 2.1.Phương pháp Turkevick tổng hợp hạt nano vàng
Cơ chế tạo hạt nano vàng diễn ra thông qua phản ứng citrate khử HAuCl4, tạo ra mầm tinh thể vàng có xu hướng co cụm để giảm thiểu bề mặt Tuy nhiên, sự bao bọc của các ion citrate mang điện tích âm xung quanh hạt nano vàng, hoạt động như một chất hoạt động bề mặt, ngăn cản sự co cụm của các tinh thể và giữ cho kích thước hạt vàng ở mức nhỏ.
Hình 2.2: Cơ chế phát triển mầm của phương pháp Turkevick
2.3.2 Phương pháp hấp thụ phân tử UV-Vis xác định hàm lượng meropenem sử dụng hạt nano vàng
Phương pháp UV-Vis dựa trên nguyên tắc cho chùm ánh sáng với bước sóng xác định trong vùng khả kiến (Vis) hoặc vùng tử ngoại gần (UV) đi qua vật thể hấp thụ, thường là dung dịch Qua việc đo lượng ánh sáng bị hấp thụ, ta có thể xác định nồng độ và hàm lượng của dung dịch.
Sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch tuân theo định luật Bouguer-Lambert-Beer
Trong đó : A là độ hấp thụ hoặc mật độ quang
C: Nồng độ mol chất ban đầu (mol/l) l : Bề dày lớp hấp thụ dung dịch (cm) ɛ: Hệ số hấp thụ phân tử (l/mol.cm)
(Nếu C = 1 mol/l, l = 1 cm thì ɛ được gọi là hệ số hấp thụ phân tử gam; nếu C = 1%
(v/v), l = 1 cm thì ɛ được gọi là hệ số hấp thụ riêng (E))
Nghiên cứu này áp dụng phương pháp phổ hấp thụ phân tử UV-Vis để xác định bước sóng hấp thụ cực đại của dung dịch vàng nano Thí nghiệm được thực hiện cả trong điều kiện có mặt và không có mặt của chất phân tích meropenem, nhằm đánh giá ảnh hưởng của meropenem đến đặc tính quang học của dung dịch vàng nano.
Phương pháp xác định meropenem bằng hạt nano vàng dựa trên quang học sử dụng phổ hấp thụ phân tử UV-Vis của dung dịch nano vàng ổn định bằng citrate, có màu đỏ tươi với đỉnh hấp thụ tại bước sóng 520nm Khi meropenem có mặt trong dung dịch, nó sẽ hấp phụ lên bề mặt hạt nano vàng thông qua liên kết giữa Au và nhóm –SH của meropenem Sự hấp phụ này làm giảm điện tích âm trên bề mặt hạt Au, dẫn đến giảm lực đẩy tĩnh điện và khiến các hạt vàng co cụm lại Kết quả là dung dịch chuyển từ màu đỏ sang màu xanh, đồng thời xuất hiện một dải hấp thụ cực đại thứ hai tại bước sóng 660nm trên phổ hấp thụ phân tử UV-Vis.
Hình 2.3.Cơ chế của phương pháp xác định meropenem sử dụng nano vàng
Thiết lập mối quan hệ giữa tỉ lệ độ hấp thụ quang ở hai bước sóng 660nm và 520nm với nồng độ meropenem làm cơ sở để định lượng meropenem
2.3.3 Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua TEM
Kính hiển vi điện tử truyền qua là thiết bị nghiên cứu vi cấu trúc vật rắn, sử dụng chùm điện tử năng lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật mỏng Thiết bị này ứng dụng thấu kính từ để tạo ra hình ảnh với độ phóng đại lớn, có thể lên tới hàng triệu lần Hình ảnh được ghi nhận bằng máy chụp kỹ thuật số hoặc màng quang học, giúp nghiên cứu chi tiết cấu trúc vi mô.
Phương pháp TEM cung cấp cái nhìn chân thực về kích thước hạt vật liệu và cách sắp xếp của các nguyên tử trong mẫu Nó cho phép theo dõi chi tiết cách sắp xếp tại từng hạt và diện tích nhỏ hơn một micromet vuông Nguyên lý hoạt động của phương pháp TEM được minh họa trong Hình 2.4.
Hình 2.4: Sơ đồ nguyên lý hoạt động của thiết bị kính hiển vi điên tử truyền qua TEM
2.3.4 Đánh giá độ tin cậy của phương pháp
2.3.4.1 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ tối thiểu của chất phân tích mà hệ thống phân tích vẫn có thể tạo ra tín hiệu có ý nghĩa, so với tín hiệu mẫu trắng hoặc tín hiệu nền.
Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của chất phân tích mà hệ thống có thể cung cấp tín hiệu phân tích có ý nghĩa định lượng, khác biệt so với tín hiệu mẫu trắng hoặc tín hiệu nền.
Có nhiều phương pháp khác nhau để xác định LOD và LOQ, tùy thuộc vào kỹ thuật và điều kiện trang thiết bị cụ thể Trong luận văn này, chúng tôi sử dụng công thức tính LOD và LOQ để đảm bảo tính chính xác và hiệu quả trong quá trình phân tích.
Sb: Sai số của giá trị y trong phương trình hồi quy của đường chuẩn b: Hệ số hồi quy tuyến tính
2.3.4.2 Độ lặp lại của phương pháp phân tích Độ lặp lại đặc trưng cho mức độ gần nhau giữa các giá trị riêng lẻ xi khi tiến hành các mẫu thử giống hệt nhau, bằng cùng một phương pháp phân tích, trong cùng điều kiện thí nghiệm( cùng người phân tích, trang thiết bị, phòng thí nghiệm) trong khoảng thời gian ngắn Do vậy còn được gọi là độ chính xác trong phòng thí nghiệm Độ lặp lại của phương pháp được xác định qua độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) theo công thức sau:
RSD (%) hay còn gọi là hệ số biến thiên (CV%) là một chỉ số quan trọng trong thống kê Công thức tính RSD là RSD % = (SD / 𝑥𝑡𝑏) × 100% Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) được ưa chuộng hơn độ lệch chuẩn (SD) vì nó cho phép đánh giá mức độ phân tán của dữ liệu so với giá trị trung bình, từ đó cung cấp cái nhìn rõ ràng hơn về độ chụm của các số liệu trong các tập hợp lặp lại.
2.3.4.3 Độ đúng (độ thu hồi) của phương pháp Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của (10) dãy lớn các kết quả thí nghiệm và các giá trị quy chiếu được chấp nhận Do đó thước đo độ đúng thường đánh giá qua sai số tương đối hay bằng phương pháp xác định độ thu hồi Trong nghiên cứu này xác định độ đúng thông qua việc xác định độ chệch (%Bias) với dung dịch chuẩn và qua hiệu suất thu hồi với nền mẫu thêm chuẩn.
Quy trình thực nghiệm
2.4.1 Chuẩn bị tổng hợp dung dịch nano vàng
Dung dịch nano vàng được sản xuất bằng phương pháp Turkevick, trong đó natri citrat đóng vai trò là chất khử, chuyển đổi HAuCl4 thành Au 0 Đồng thời, các ion citrat cũng hấp phụ trên bề mặt hạt vàng, giúp bảo vệ và ổn định cấu trúc của hạt vàng.
Dung dịch nano vàng được điều chế bằng cách chuyển 50,00ml dung dịch HAuCl4.3H2O 0,50mM vào cốc chịu nhiệt 100ml và đun sôi Sau đó, thêm 5,00ml natri citrate 38,8mM (0,67%) vào và khuấy mạnh trên máy khuấy từ có gia nhiệt Tiếp tục đun khoảng 10 phút cho đến khi dung dịch chuyển sang màu đỏ rượu vang, cho thấy các hạt nano vàng đã được hình thành Dung dịch sau đó được để nguội đến nhiệt độ phòng và có thể bảo quản bền trong khoảng 3-4 tuần ở 4°C trong tủ lạnh.
2.4.2 Tối ưu hóa điều kiện phân tích
Chuẩn bị 8 bình định mức dung tích 10 ml, thêm 5,00 ml dung dịch AuNPs vào từng bình Tiếp theo, bổ sung các thể tích dung dịch NaCl 1M khác nhau là 40, 80, 160, 200, 400, 600, 800, 1000 µL, điều chỉnh pH về 4 Sau đó, thêm 1,00 ml dung dịch meropenem nồng độ 10^-4 M vào từng bình, định mức dung dịch đến vạch và trộn đều Đợi 17 phút rồi đo tỉ lệ độ hấp thụ quang A660/A520.
2.4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH Điều kiện thí nghiệm tương tự 2.4.2.1 nhưng khảo sát lần lượt ở các giá trị pH =3, 4, 5,
2.4.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng
Thiết lập thí nghiệm tương tự 2.4.2.1 và theo dõi độ hấp thụ quang của dung dịch tại bước sóng 660nm trong vòng 30 phút
2.4.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nano vàng
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nano vàng trong khoảng từ 5.10 -
5-3.10 -4 M lên giá trị tỉ lệ độ hấp thụ quang A660/A520.
2.4.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch meropenem
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch meropenem từ 5.10 -7 -2,5.10 -5 M
2.4.2.6 Xác định khoảng tuyến tính
Khoảng tuyến tính được khảo sát trong khoảng nồng độ meropenem từ 5.10 -7 - 2,5.10 -5 M với các điều kiện phân tích tối ưu được xác định từ các thí nghiệm trên
2.4.3 Đánh giá phương pháp phân tích Độ lặp của phương pháp được đánh giá bằng cách đo lặp lại 10 lần các dung dịch meropenem có nồng độ 7,5.10 -7 M (~0,29 ppm); 10 -6 M (~0,73 ppm) và 5.10 -6 M (~2,88 ppm)
* Độ đúng của phương pháp được đánh giá thông qua độ chệch (bias): Δ = 𝑿𝒕𝒃−à à x100 (2.6)
- Xtb: Giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm
* Đánh giá độ lặp lại của phương pháp thông qua phương sai mẫu và độ lệch chuẩn tương đối theo công thức:
Nếu RSD (%) đều nhỏ hơn 5% chứng tỏ phương pháp có độ chụm tốt
2.4.4 Định lượng meropenem trong mẫu thực tế
2.4.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các chất có thể có trong nền mẫu dược phẩm như
Na2CO3, glucozo, saccarozo, lactozo ở cỏc mức nồng độ: 0, 10 -4 , 5.10 -4 , 10 -3 (àg/ml) trong dung dịch meropenem cú nồng độ 3.10 -6 àg/ml
Sự sai lệch tỉ lệ A660/520 khi cho thêm chất ảnh hưởng và khi không thêm chất ảnh hưởng được tính theo công thức:
S%: Sai số phần trăm tương đối
Ao: Tỷ lệ A660/520 khi không có thêm chất ảnh hưởng
Ai: Tỷ lệ A660/520 khi thêm chất ảnh hưởng
Nếu S% dưới 10%, ảnh hưởng của chất đến kết quả đo được coi là không lớn và chấp nhận được, do đó không cần loại bỏ chất ảnh hưởng trong mẫu Ngược lại, khi S% trên 10%, sự ảnh hưởng của các chất là đáng kể, yêu cầu phải loại bỏ chúng để đảm bảo độ chính xác của kết quả đo.
2.4.4.2 Đánh giá phương pháp phân tích trên nền mẫu thực a Độ lặp lại : Đánh giá độ lặp của phương pháp thông qua đo lặp lại mẫu thử 6 lần trong ngày và khác ngày, đánh giá qua dao động (%RSD) hàm lượng thu được khi định lượng trên mẫu thử ở nồng độ làm việc Trong nghiên cứu này lựa chọn nồng độ làm việc là 2.10 -6 M b Độ đúng: Đánh giá ở 3 mức nồng độ 80-100-120% nồng độ làm việc Mỗi nồng độ đo lăp lại 3 lần Từ đó tính được hiệu suất thu hồi ở ba mức nồng độ
2.4.4.3 Quy trình phân tích mẫu a Chuẩn bị mẫu
Các mẫu thuốc tiêm chứa meropenem hiện có sẵn tại các hiệu thuốc trên địa bàn thành phố Hà Nội Thông tin chi tiết về các mẫu thuốc này được trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2 Danh mục thuốc tiêm chứa meropenem được sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên mẫu/ngày sản xuất Nhà sản xuất
Hàm lượng meropenem trên nhãn
Các thành phần khác trên nhãn
Meronem IV Hạn sử dụng: 30/06/2020
Số lô: MX267 Astra Zeneca 500mg/lọ Natri cacbonat
Merugold IV Hạn sử dụng: 06/04/2020
Công ty Facta Farmaceutical SPA
Meropenem Kabi Hạn sử dụng: 06/2020
Công ty cổ phần Fresenius Kabi Bidiphar
Công ty Facta Farmaceutical SPA
Công ty Medochemie Ltd-Factory C, Cộng hòa Sip
Công ty ACS Dobfar SPA, Italy
1g/lọ Natri cacbonat b Quy trình xử lý mẫu
Cân chính xác 14,8 mg meropenem và hòa tan trong nước cất, sau đó cho vào bình định mức 25 ml và định mức đến vạch bằng nước để tạo dung dịch mẫu 1 Tiếp theo, cho 5,00 ml dung dịch AuNPs vào bình định mức 10 ml, thêm 160 µL dung dịch NaCl 1M và điều chỉnh pH về 4 Sau đó, thêm 600 µL dung dịch mẫu 1 và định mức đến vạch Đợi 17 phút, sau đó ghi lại phổ hấp thụ phân tử UV-Vis và đo tỉ lệ độ hấp thụ quang.
A660/A520 Hàm lượng meropenem trong mẫu được định lượng theo phương pháp đường chuẩn.