2.4.1 Chuẩn bị tổng hợp dung dịch nano vàng
Dung dich nano vàng được điều chế theo phương pháp Turkevick sử dụng natri citrat làm chất khử để khử HAuCl4 xuống Au0 đồng thời các ion citrat hấp phụ trên bề mặt hạt Au cũng có tác dụng bảo vệ và làm ổn định hạt Au [23].
Dung dịch nano vàng được điều chế như sau: Chuyển 50,00ml dung dịch HAuCl4.3H2O 0,50mM vào cốc chịu nhiệt 100ml, đun đến khi sôi, thêm 5,00ml natri citrate 38,8mM (0,67%) vào và khuấy mạnh trên máy khuấy từ có gia nhiệt. Tiếp tục
đun dung dịch khoảng 10 phút đến khi dung dịch chuyển sang màu đỏ rượu vang, là khi các hạt nano vàng được hình thành. Để nguội dung dịch đến nhiệt độ phòng, dung dịch nano vàng bền trong khoảng 3-4 tuần khi bảo quản ở 4oC trong tủ lạnh [8].
2.4.2. Tối ưu hóa điều kiện phân tích
2.4.2.1. Khảo sát lực ion
Chuẩn bị 8 bình định mức dung tích 10 ml, lần lượt thêm vào từng bình 5,00 ml dung dịch AuNPs. Sau đó thêm vào các bình các thể tích dung dịch NaCl 1M khác nhau là 40, 80, 160, 200, 400, 600, 800, 1000µL, chỉnh pH = 4, thêm 1,00ml dung dịch meropenem có nồng độ 10-4M vào lần lượt các bình, định mức dung dịch đến vạch, trộn đều, đợi 17 phút và đo tỉ lệ độ hấp thụ quang A660/A520.
2.4.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH
Điều kiện thí nghiệm tương tự 2.4.2.1 nhưng khảo sát lần lượt ở các giá trị pH =3, 4, 5, 6, 7, 8.
2.4.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng
Thiết lập thí nghiệm tương tự 2.4.2.1 và theo dõi độ hấp thụ quang của dung dịch tại bước sóng 660nm trong vịng 30 phút.
2.4.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nano vàng
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nano vàng trong khoảng từ 5.10- 5-3.10-4 M lên giá trị tỉ lệ độ hấp thụ quang A660/A520.
2.4.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch meropenem
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch meropenem từ 5.10-7-2,5.10-5 M.
2.4.2.6. Xác định khoảng tuyến tính
Khoảng tuyến tính được khảo sát trong khoảng nồng độ meropenem từ 5.10-7- 2,5.10-5M với các điều kiện phân tích tối ưu được xác định từ các thí nghiệm trên.
2.4.3. Đánh giá phương pháp phân tích
Độ lặp của phương pháp được đánh giá bằng cách đo lặp lại 10 lần các dung dịch meropenem có nồng độ 7,5.10-7 M (~0,29 ppm); 10-6 M (~0,73 ppm) và 5.10-6 M (~2,88
ppm).
* Độ đúng của phương pháp được đánh giá thông qua độ chệch (bias):
Δ = 𝑿𝒕𝒃−µ
µ x100 (2.6) Trong đó:
- Δ: Độ chệch (bias), %
- Xtb: Giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm. - µ: Giá trị thực
* Đánh giá độ lặp lại của phương pháp thông qua phương sai mẫu và độ lệch chuẩn tương đối theo công thức:
S2 = ∑(𝑨𝒊−𝑨𝒕𝒃)𝟐
𝒏−𝟏 (2.7) RSD (%) = 𝑺𝑫
𝑨𝒕𝒃 x100% (2.8)
Nếu RSD (%) đều nhỏ hơn 5% chứng tỏ phương pháp có độ chụm tốt.
2.4.4. Định lượng meropenem trong mẫu thực tế
2.4.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các chất có thể có trong nền mẫu dược phẩm như Na2CO3, glucozo, saccarozo, lactozo ở các mức nồng độ: 0, 10-4, 5.10-4, 10-3(µg/ml) trong dung dịch meropenem có nồng độ 3.10-6 µg/ml.
Sự sai lệch tỉ lệ A660/520 khi cho thêm chất ảnh hưởng và khi khơng thêm chất ảnh hưởng được tính theo cơng thức:
S% = 𝑨𝒐−𝑨𝒊
𝑨𝒐 x100% (2.9) Trong đó:
S%: Sai số phần trăm tương đối
Ao: Tỷ lệ A660/520 khi khơng có thêm chất ảnh hưởng Ai: Tỷ lệ A660/520 khi thêm chất ảnh hưởng
Nếu S% < 10% coi như sự ảnh hưởng của chất ảnh hưởng đến kết quả đo là không lớn, ở mức độ chấp nhận được, không nhất thiết phải loại bỏ chất ảnh hưởng trong mẫu. Nếu S% > 10% có nghĩa sự ảnh hưởng của các chất ảnh hưởng đến kết quả đo là đáng
kể và cần thiết phải loại bỏ ảnh hưởng của các chất trong mẫu.
2.4.4.2. Đánh giá phương pháp phân tích trên nền mẫu thực
a. Độ lặp lại : Đánh giá độ lặp của phương pháp thông qua đo lặp lại mẫu thử 6 lần
trong ngày và khác ngày, đánh giá qua dao động (%RSD) hàm lượng thu được khi định lượng trên mẫu thử ở nồng độ làm việc. Trong nghiên cứu này lựa chọn nồng độ làm việc là 2.10-6M.
b. Độ đúng: Đánh giá ở 3 mức nồng độ 80-100-120% nồng độ làm việc. Mỗi nồng độ
đo lăp lại 3 lần. Từ đó tính được hiệu suất thu hồi ở ba mức nồng độ.
2.4.4.3. Quy trình phân tích mẫu
a. Chuẩn bị mẫu
Các mẫu thuốc tiêm có chứa meropenem được mua trên thị trường tại các hiệu thuốc trên địa bàn thành phố Hà Nội. Thông tin về các mẫu thuốc được cho trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Danh mục thuốc tiêm chứa meropenem được sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên mẫu/ngày sản xuất Nhà sản xuất
Hàm lượng meropenem trên nhãn Các thành phần khác trên nhãn 1 Meronem IV Hạn sử dụng: 30/06/2020
Số lô: MX267 Astra Zeneca 500mg/lọ Natri cacbonat
2 Merugold IV Hạn sử dụng: 06/04/2020 Số lô: 000707 Công ty Facta Farmaceutical SPA 1g/lọ Natri cacbonat 3 Meropenem Kabi Hạn sử dụng: 06/2020 Số lô: MVM5027 Công ty cổ phần Fresenius Kabi Bidiphar 500mg/lọ Natri cacbonat
4 Meropenem ™ Hạn sử dụng: 06/04/2020 Số lô:1703410 DEMO S.A. Phamaceutical Industry 500mg/lọ Natri cacbonat 5 Meropenem Kabi Hạn sử dụng: 07/2020 Số lô: MVN1027 Công ty Facta Farmaceutical SPA 1g/lọ Natri cacbonat 6 Medozopen Hạn sử dụng: 10/2019 Số lô: CK34AG Công ty Medochemie Ltd-Factory C, Cộng hòa Sip 1g/lọ Natri cacbonat 7 Meronem Hạn sử dụng: 12/10/2021 Số lô: PB160 Công ty ACS Dobfar SPA, Italy 1g/lọ Natri cacbonat b. Quy trình xử lý mẫu
Cân chính xác 14,8 mg thuốc tiêm có chứa meropenem trên cân phân tích, hịa tan bằng nước cất. Cho vào bình định mức 25 ml, định mức đến vạch bằng nước được dung dịch mẫu 1. Cho 5,00 ml dung dịch AuNPs vào bình định mức dung tích 10 ml, thêm 160µL dung dịch NaCl 1M, chỉnh pH = 4; thêm 600µl dung dịch mẫu 1, định mức đến vạch. Đợi 17 phút, ghi phổ hấp thụ phân tử UV-Vis và đo tỉ lệ độ hấp thụ quang A660/A520. Hàm lượng meropenem trong mẫu được định lượng theo phương pháp đường chuẩn.
CHƯƠNG III-KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát đặc trưng của dung dịch nano vàng
3.1.1. Khảo sát hình thái bề mặt qua ảnh TEM
Do kết quả của hiệu ứng cộng hưởng plasmon bề mặt, dung dịch nano vàng có màu đỏ rượu đặc trưng, khi có mặt meropenem, dung dịch chuyển sang màu xanh dễ dàng quan sát bằng mắt thường (Hình 3.1)
Hình 3.1: Dung dịch nano vàng ở điều kiện thường (màu đỏ) và khi có mặt meropenem (màu xanh)
Hình thái hạt nano vàng được nghiên cứu thông qua ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Các hạt nano vàng tổng hợp được có hình cầu và phân bố đều với đường kính hạt trung bình khoảng 10nm (Hình 3.2a), như có thể thấy trong hình, các hạt nano vàng tách rời nhau do các ion citrat tích điện âm bao quanh hạt nano vàng như một chất hoạt động bề mặt ngăn cản sự co cụm của các hạt nano vàng. Hình 3.2b là ảnh TEM điển hình của dung dịch nano vàng khi kết hợp với meropenem, dễ dàng nhận thấy các hạt nano vàng co cụm lại với nhau thành từng đám do khi có thêm meropenem làm giảm điện tích âm của các hạt nano vàng và làm giảm lực đẩy tĩnh điện giữa các hạt vàng, từ đó làm tăng kích thước của hạt.
(a) (b)
Hình 3.2.Hình thái hạt nano vàng thơng qua ảnh TEM
(a): Hình thái hạt nano vàng ; (b): Hình thái hạt nano vàng khi có meropenem
3.1.2. Khảo sát đặc tính hấp thụ cộng hưởng bề mặt bằng phổ hấp thụ phân tử UV-VIS VIS
Màu sắc của dung dịch nano vàng gây nên bởi hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR). Hiện tượng này gây nên bởi sự phân cực hàng loạt của các electron tự do trên bề mặt hạt nano vàng khi tần số dao động của chúng trùng với tần số của bức xạ điện từ. Tần số dao động này thường nằm trong vùng khả kiến nên các hạt nano vàng có khả năng hấp thụ mạnh ánh sáng vùng khả kiến, gây nên sự thay đổi màu sắc của dung dịch nano vàng. Số lượng và vị trí của các dải hấp thụ plasmon phụ thuộc chủ yếu vào kích thước và hình thái của hạt, peak cộng hưởng có thể xuất hiện trong vùng khả kiến đến vùng hồng ngoại gần. Theo Mie bằng cách giải bài toán tán xạ của sóng điện từ trên một hạt cầu kim loại, với vàng nano dạng cầu, SPR xảy ra ở vùng khả kiến tại bước sóng khoảng 520-540nm. Nếu kích thước của hạt tăng lên thì cực đại hấp thụ ứng với SPR sẽ dịch chuyển về vùng có bước sóng dài hơn. Tuy nhiên, khi hạt cầu lớn đến một kích thước nào đó, sẽ trở thành dạng khối (bulk) và hiện tượng SPR sẽ biến mất. [5,44].
Tiến hành ghi phổ UV-Vis của dung dịch nano vàng khi có mặt và khơng có mặt meropenem trong vùng bước sóng khả kiến từ 400-800nm. Các phổ hấp thụ của dung dịch khi có mặt meropenem (đường cong 2) và khi khơng có mặt meropenem (đường cong 1) được cho trong Hình 3.3.
Hình 3.3. Phổ hấp thụ của dung dịch nano vàng khi có mặt meropenem (1) Phổ hấp thụ của dung dịch nano vàng
(2) Phổ hấp thụ của dung dịch nano vàng khi có mặt meropenem (10-5 M)
Đường 1 cho thấy phổ hấp thụ UV-Vis của dung dịch nano vàng có một đỉnh hấp thụ cực đại ở 520nm (dải hấp thụ cộng hưởng plasmon bề mặt) giống như trong tính tốn của Mie cho hạt vàng ở dạng cầu có kích thước nhỏ dưới 100 nm. Khi cho thêm meropenem (10-5M) vào dung dịch nano vàng, trên đường 2 xuất hiện thêm một đỉnh cực đại ở bước sóng 660nm. Nguyên nhân là do sự thay đổi kích thước hạt nano vàng từ vài chục nm đến vài trăm nm (xem mục 3.1.1) khi có mặt meropenem, làm dịch chuyển cực đại hấp thụ SPR về bước sóng dài hơn, dẫn đến sự thay đổi màu sắc của dung dịch nano Au từ đỏ sang xanh..Từ khảo sát trên tiến hành lựa chọn hai bước sóng hấp thụ cực đại là 520nm và 660nm và sử dụng tỉ lệ độ hấp thụ quang tại 2 bước sóng này làm tín hiệu phân tích để định lượng meropenem.
3.2. Khảo sát các điều kiện xác định meropenem bằng dung dịch nano vàng
dịch nano vàng, tiến hành nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của một số thông số như pH, nồng độ muối NaCl, thời gian phản ứng, nồng độ dung dịch nano vàng. Điều kiện tối ưu được lựa chọn dựa trên việc tối ưu tỉ lệ độ hấp thụ quang ở 2 bước sóng 660nm và 520nm. (A650/A520). Tỉ lệ này cho thấy mức độ co cụm của hạt nano vàng khi có mặt meropenem. Sự co cụm của các hạt nano vàng gây ra do sự giảm điện tích trên bề mặt của hạt nano vàng, do đó, mọi yếu tố gây nên sự thay đổi này đều sẽ làm thay đổi giá trị A660/A520.
3.2.1. Ảnh hưởng của pH
Nhờ lực tĩnh điện giữa các hạt nano vàng- citrate tĩnh điện âm nên dung dịch nano vàng có thể bền vững trong khoảng pH từ 4-12, pH của dung dịch quyết định dạng tồn tại và điện tích của meropenem cũng như điện tích bề mặt của hạt nano vàng. Khả năng co cụm của các hạt nano vàng tỉ lệ thuận với điện tích âm trên bề mặt hạt nano vàng. Khi khơng có mặt meropenem, ở pH càng cao dung dịch càng bền vững do điện tích âm của citrate tăng theo pH. Khi có mặt meropenem, meropenem kết hợp với hạt AuNPs thơng qua liên kết cộng hóa trị Au-S, meropenem dễ dàng bị hấp phụ trên bề mặt hạt citrate-AuNPs tích điện âm. Sự hấp phụ meropenem mang điện tích dương sẽ làm giảm điện tích âm trên bề mặt hạt Au khiến chúng co cụm lại với nhau.Vì vậy, pH của dung dịch ảnh hưởng tương đối lớn đến tỉ lệ độ hấp thụ quang A660/A520. Hình 3.4 cho thấy tỉ lệ độ hấp thụ quang A660/A520 tăng trong khoảng pH 3,0-4,0, sau đó giảm mạnh trong khoảng pH từ 5,0-8,0. Tại các giá trị pH lớn hơn 5,0 khơng có sự khác biệt đáng kể về co cụm của các hạt nano vàng khi thêm meropenem do ở pH cao các nhóm thio của meropenem phân li làm meropenem mang điện tích âm và khó hấp phụ trên bề mặt hạt citrate-nano Au cũng mang điện tích âm.
Bảng 3.1.Ảnh hưởng của pH đến tỉ lệ độ hấp thụ quang
pH A520 A660 A660/A520
3,0 0,466 0,613 1,32
5,0 0,520 0,149 0,29
6,0 0,508 0,123 0,24
7,0 0,511 0,121 0,24
8,0 0,518 0,103 0,19
Hình 3.4. Ảnh hưởng của pH
Tại giá trị pH=4,0, tỉ lệ độ hấp thụ quang A660/A520 là lớn nhất. Do đó, trong các thí nghiệm tiếp theo lựa chọn giá trị pH=4,0 là giá trị tối ưu cho tất cả các khảo sát.
3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl
NaCl là một trong những chất điện li mạnh, ảnh hưởng nhiều đến khả năng co cụm của hạt nano Au do chúng có khả năng làm co lại lớp điện kép được tạo thành bởi các ion citrate mang điện tích âm hấp phụ trên bề mặt hạt nano Au. Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của nồng độ chất điện li mạnh (ở đây là muối NaCl), được cho trong bảng 3.2 và biểu diễn trên hình 3.5.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến tỉ lệ độ hấp thụ quang
CNaCl(M) A520 A660 A660/A520
0,004 0,558 0,686 1,23 0,008 0,597 0,779 1,30 0,016 0,598 0,790 1,32 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400 2 4 6 8 A 66 0/ A 52 0 pH Ảnh hưởng của pH
0,020 0,483 0,561 1,16
0,040 0,349 0,354 1,01
0,060 0,364 0,361 0,99
0,080 0,362 0,356 0,98
0,100 0,378 0,374 0,98
Hình 3.5.Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl
Khi có mặt NaCl, khả năng co cụm của các hạt nano vàng tăng lên thể hiện qua tỉ lệ A660/A520 tăng lên theo nồng độ NaCl, đạt bão hịa khi nồng độ NaCl là 0,016M và sau đó giảm dần. Sự giảm tỉ lệ A660/A520 do khi tăng nồng độ NaCl đến một giới hạn nhất định, sự kết tụ của các hạt nano xảy ra ngay cả khi khơng có chất phân tích nên khi cho meropenem vào nồng độ của meropenem bị hấp phụ lên hạt vàng càng giảm. Do đó lựa chọn nồng độ NaCl là 0,016M là điều kiện tối ưu cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nano vàng
Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ của các hạt nano vàng trong khoảng từ 3.10-4M đến 5.10-5M, tại nồng độ NaCl là 0,016M và nồng độ meropenem thêm vào là 10-6 M. Kết quả được biểu diễn trong bảng 3.3 và hình 3.6.
0.700 0.800 0.900 1.000 1.100 1.200 1.300 1.400 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 A 66 0 /A 5 20 CNaCl(M)
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch AuNPs đến tỉ lệ độ hấp thụ quang
C AuNPs (10-4M) A520 A660 A660/A520
0,5 0,103 0,075 0,72 1,0 0,199 0,167 0,84 1,5 0,272 0,317 1,17 2,0 0,429 0,592 1,38 2,5 0,482 0,588 1,22 3,0 0,544 0,657 1,21
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch AuNPs.
Tỉ lệ độ hấp thụ quang A660/A520 của dung dịch nano Au khi có mặt meropenem ở nồng độ nano Au 2,5.10-4 M là cao nhất, do đó dung dịch nano vàng 2,5.10-4 M được lựa chọn là điều kiện tối ưu cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.4. Ảnh hưởng của thời gian
Ảnh hưởng của thời gian tới độ ổn định màu của dung dịch sau khi thêm meropenem được khảo sát trong thời gian 30 phút. Nhận thấy độ hấp thụ quang ở bước sóng 660nm tăng nhanh ở 17 phút đầu sau đó giảm dần, chứng tỏ hiện tượng co cụm của các hạt nano vàng bắt đầu xảy ra ngay sau khi trộn và kết thúc sau khoảng thời gian 17 phút. Tại điều kiện tối ưu, sau khi thêm meropenem có thể quan sát bằng mắt thường dung
0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 0.2 0.7 1.2 1.7 2.2 2.7 3.2 A 66 0 /A 5 20 CAu(10-4M)
dịch chuyển màu từ đỏ sang xanh (tương ứng với sự co cụm của các hạt AuNPs) và