2.3.1. Phương pháp chế tạo hạt nano vàng
Các hạt nano vàng được chế tạo bằng phương pháp Turkevick và các cộng sự [23], trong đó muối HAuCl4 được khử xuống Au bằng natri citrate (hình 2.1).
Hình 2.1.Phương pháp Turkevick tổng hợp hạt nano vàng
Cơ chế tạo hạt nano vàng: phản ứng citrate khử HAuCl4 tạo ra mầm tinh thể vàng có xu hướng co cụm lại với nhau để cực tiểu hóa bề mặt. Tuy nhiên sự bao bọc của các ion citrate tích điện âm quanh hạt nano vàng với vai trò như một chất hoạt động bề mặt sẽ ngăn cản sự co cụm của các tinh thể tạo thành các hạt vàng có kích thước nhỏ.
Hình 2.2: Cơ chế phát triển mầm của phương pháp Turkevick
2.3.2 Phương pháp hấp thụ phân tử UV-Vis xác định hàm lượng meropenem sử dụng hạt nano vàng hạt nano vàng
Nguyên tắc của phương pháp UV-Vis: Dựa trên việc cho chùm ánh sáng có độ dài
bước sóng xác định trong vùng khả kiến (Vis) hay trong vùng tử ngoại gần (UV) đi qua vật thể hấp thụ (thường ở dạng dung dịch). Từ lượng ánh sáng đã bị hấp thụ bởi dung dịch tính được nồng độ (hàm lượng) của dung dịch đó.
Sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch tuân theo định luật Bouguer-Lambert-Beer
A= -lgT= lg 𝑰𝒐
𝑰 = εlC với T=lt/l0 (2.1)
Trong đó : A là độ hấp thụ hoặc mật độ quang C: Nồng độ mol chất ban đầu (mol/l) l : Bề dày lớp hấp thụ dung dịch (cm) ɛ: Hệ số hấp thụ phân tử (l/mol.cm)
(Nếu C = 1 mol/l, l = 1 cm thì ɛ được gọi là hệ số hấp thụ phân tử gam; nếu C = 1% (v/v), l = 1 cm thì ɛ được gọi là hệ số hấp thụ riêng (E)).
T: Độ truyền qua.
Nghiên cứu sử dụng phương pháp phổ hấp thụ phân tử UV-Vis để xác định bước sóng hấp thụ cực đại của dung dịch vàng nano khi có mặt và khơng có mặt chất phân tích là meropenem.
Nguyên tắc của phương pháp xác định meropenem với hạt nano vàng bằng phương pháp quang học: Phổ hấp thụ phân tử UV-Vis của dung dịch nano vàng ổn định bằng
sóng 520m. Khi trong dung dịch chứa meropenem và nano vàng, meropenem sẽ hấp phụ trên bề mặt các hạt nano vàng nhờ liên kết giữa Au và nhóm –SH trong phân tử meropenem. Khi đó điện tích âm trên bề mặt hạt Au giảm, làm giảm lực đẩy tĩnh điện và khiến cho các hạt vàng co cụm lại. Dung dịch chuyển từ màu đỏ sang màu xanh và trên phổ hấp thụ phân tử UV-Vis xuất hiện một dải hấp thụ cực đại thứ hai xung quanh bước sóng 660nm (hình 2.3).
(a) (b)
Hình 2.3.Cơ chế của phương pháp xác định meropenem sử dụng nano vàng
Thiết lập mối quan hệ giữa tỉ lệ độ hấp thụ quang ở hai bước sóng 660nm và 520nm với nồng độ meropenem làm cơ sở để định lượng meropenem.
2.3.3. Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua TEM
Kính hiển vi điện tử truyền qua là một thiết bị nghiên cứu vi cấu trúc vật rắn, sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (có thể tới hàng triệu lần). Ảnh có thể được ghi nhận bằng các máy chụp kĩ thuật số hoặc màng quang học.
Phương pháp TEM cho bức ảnh chân thực về kích thước của hạt vật liệu, cách sắp xếp của các nguyên tử trong mẫu, theo dõi được cách sắp xếp đo trong chi tiết từng hạt, từng diện tích cỡ micromet vng và nhỏ hơn. Ngun lý hoạt động của phương pháp do TEM được trình bày trên Hình 2.4.
Hình 2.4: Sơ đồ nguyên lý hoạt động của thiết bị kính hiển vi điên tử truyền qua TEM
2.3.4. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp
2.3.4.1. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích cịn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền.
Giới hạn định lượng (LOQ): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền.
Có nhiều cách khác nhau để xác định LOD, LOQ phụ thuộc vào từng phương pháp, kỹ thuật và điều kiện trang thiết bị cụ thể. Trong luận văn này sử dụng cơng thức tính LOD và LOQ như sau:
LOD = 𝟑∗𝑺𝒃
𝒃 (2.2) LOQ = 𝟏𝟎∗𝑺𝒃
𝒃 (2.3)
Trong đó:
b: Hệ số hồi quy tuyến tính
2.3.4.2. Độ lặp lại của phương pháp phân tích
Độ lặp lại đặc trưng cho mức độ gần nhau giữa các giá trị riêng lẻ xi khi tiến hành các mẫu thử giống hệt nhau, bằng cùng một phương pháp phân tích, trong cùng điều kiện thí nghiệm( cùng người phân tích, trang thiết bị, phịng thí nghiệm) trong khoảng thời gian ngắn. Do vậy cịn được gọi là độ chính xác trong phịng thí nghiệm.
Độ lặp lại của phương pháp được xác định qua độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) theo công thức sau:
SD = √∑ (𝑥𝑖−𝑥𝑡𝑏)2
𝑛−1 (2.4) RSD % = 𝑆𝐷
𝑥𝑡𝑏× 100% (2.5)
RSD (%) còn được gọi là hệ số biến thiên (CV%). Người ta sử dụng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) hơn là độ lệch chuẩn(SD) do có thể đánh giá được độ lệch chuẩn chiếm bao nhiêu phần trăm giá trị trung bình và có cái nhìn rõ hơn về độ chụm của các số liệu trong tập hợp lặp lại.
2.3.4.3. Độ đúng (độ thu hồi) của phương pháp
Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của (10) dãy lớn các kết quả thí nghiệm và các giá trị quy chiếu được chấp nhận. Do đó thước đo độ đúng thường đánh giá qua sai số tương đối hay bằng phương pháp xác định độ thu hồi. Trong nghiên cứu này xác định độ đúng thông qua việc xác định độ chệch (%Bias) với dung dịch chuẩn và qua hiệu suất thu hồi với nền mẫu thêm chuẩn.