Ngiên cứu phân lập và giám định một số đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Actinobaccilus pleuropneumoniae gây viêm phổi lợn tại Thái Nguyên

TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG KHOA NÔNG - LÂM - NGƢ - LƢU THỊ TRÀ MY NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA VI KHUẨN ACTINOBACCILUS PLEUROPNEUMONIAEGÂYVIÊM PHỔI LỢN TẠI THÁI NGUYÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NgànhThú Y „ Phú Thọ, 2018 TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG KHOA ĐẠI NÔNG - LÂM - NGƢ TRƢỜNG HỌC HÙNG VƢƠNG KHOA NÔNG - LÂM - NGƢ LƢU THỊ TRÀ MY NGUYỄN LAN HƢƠNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA VI KHUẨN TÊN ĐỀ TÀI ACTINOBACCILUS PLEUROPNEUMONIAEGÂYVIÊM NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH MỘT SỐ PHỔI LỢN TẠI THÁI NGUYÊN ĐẶC ĐIỂM SINH HOÁT CỦA VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS GÂY VIÊM PHỔI LỢN TẠI THÁI NGUYÊN KHÓA LUẬN TỐTTHỰC NGHIỆP ĐẠI BÁO CÁO TẬP HỌC Ngành: Thú Y Ngành: Thú Y NGƢỜI HƢỚNG DẪN: TS NGUYỄN NGỌC MINH TUẤN NGƢỜI HƢỚNG DẪN: PGS TS CAOĐỖ VĂN 2.Th.S TẤT ĐẠT Ths.S: PHAN THỊ PHƢƠNG THANH Phú Thọ, 2018 Phú Thọ, 2018 i LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực đề tài hồn thành khóa luận, tơi ln nhận đƣợc giúp đỡ nhiểu tổ chức cá nhân Nhân dịp xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo nhà trƣờng, Ban lãnh đạo khoa Nông Lâm Ngƣ trƣờng đại học Hùng Vƣơng, Ban lãnh đạo công ty cổ phần Marphavet tạo điều kiện cho tơi đƣợc theo học chƣơng trình đào tạo đại học trƣờng thực tập công ty Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể thầy cô khoa Chăn nuôi Thú y, trƣờng Đại học Hùng Vƣơng; cán cơng nhân viên, đặc biệt cán phịng kiểm nghiệm vaccin cơng ty Marphavet nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy hƣớng dẫn khoa học TS Nguyễn Ngọc Minh Tuấn giảng viên trƣờng đại học Hùng Vƣơng Ths Đỗ Tất Đạt phó giám đốc cơng ty Marphavet trực tiếp hƣớng dẫn giúp đỡ tơi q trình thực đề tài hồn thành khóa luận Tơi ln biết ơn gia đình, bạn bè sinh viên đại học động viên, sát cánh bên giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Xin trân thành cảm ơn Phú Thọ, tháng năm 2018 Sinh viên thực Lƣu Thị Trà My ii MỤC LỤC Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu: 1.3 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm vi khuẩn A pleuropneumonia 2.1.1 Hình thái, kích thƣớc đặc tính nuôi cấy 2.1.2 Đặc tính sinh hóa 2.1.3.Cấu trúc kháng nguyên 2.1.4 Các yếu tố độc lực 2.1.5 Khả đề kháng với kháng sinh 11 2.2 Bệnh viêm phổi - màng phổi lợn A pleuropneumoniae 12 2.2.1.Triệu chứng 12 2.2.2 Bệnh tích 13 2.2.3 Các biện pháp phòng bệnh 13 2.2.4 Điều trị bệnh 14 2.3 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn A pleuropneumoniae nƣớc…………………………………………………………………………….15 CHƢƠNG 17 NỘI DUNG, ĐỊA ĐIỂM, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 17 3.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 17 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 17 3.2 Nội dung nghiên cứu 17 3.3 Thời gian, địa điểm, nguyên vật liệu dùng cho nghiên cứu 17 iii 3.3.1 Thời gian nghiên cứu 17 3.3.2 Địa điểm nghiên cứu 17 3.3.3 Nguyên liệu dụng cụ dùng cho nghiên cứu 17 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 3.4.1 phƣơng pháp thu thập mẫu 19 3.4.2 Phƣơng pháp lấy mẫu 20 3.4.3 Phƣơng pháp phân lập 20 3.4.4 Phƣơng pháp nhuộm Gram kiểm tra hình thái vi khuẩn 22 3.4.5 Phản ứng sinh hóa 23 3.4.6 Phƣơng pháp xác định A Pleuropneumoniae kỹ thuật PCR 24 3.4.7 Phƣơng pháp xác định mức độ mẫn cảm với số kháng sinh chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae phân lập đƣợc 28 3.5 Phƣơng pháp phân tích số liệu 29 CHƢƠNG 30 KẾT QUẢ 30 4.1 Kết tách khuẩn lạc nghi Actinobacillus pleuropneumoniae phân lập đƣợc từ mẫu phổi lợn môi trƣờng thạch 30 4.2 Kết nhuộm gram 31 4.3 Kết xác định đặc tính sinh vật, hóa học chủng A pleuropneumoniae phân lập đƣợc 32 4.4 Kết chạy phản ứng PCR định danh A pleuropneumoniae 37 4.5 Kết xác định triệu chứng, bệnh tích điển hình lợn mắc bệnh viêm phổi dovi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae gây Thái Nguyên 39 4.6 Kết xác định mức độ mẫn cảm với số kháng sinh vi khuẩn A pleuropneumoniae phân lập đƣợc 41 4.7 Kết thử nghiệm số phác đồ điều trị lợn nghi mắc viêm phổi dính sƣờn A pleuropneumoniae 42 CHƢƠNG 46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 iv 5.1 Kết luận 46 5.2 Đề nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU A pleuropneumoniae: Actinobacillus pleuropneumoniae AGID: Agargel Immuno Diffuse AGPT: Agar Gel Precipitin Test bronchiseptica: Bordetella bronchiseptica BHI: Brain Heart Infusion CAMP: Christie - Atkinson - Munch - Peterson Es: Công D.S.A: Dextrose Starch Agar DNA: Deoxyribo Nucleic Acid ELISA: Enzyme - Linked Immuno Sorbant Assay Fg : Greenish Fluorescent F0: parasuis: Orange Fluorescent Haemophilus parasuis pleuropneumoniae : Haemophilus pleuropneumoniae M hyopneumoniae: Mycoplasma hyopneumoniae MR: Methyl red MT: Môi trƣờng NAD: Nicotinamide Adenine Dinucleotide PBS: Phosphat buffer solution Nf: Not Fluorescent P multocida: Pasteurella multocida PCR: Polymerase Chain Reaction PRRS: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome TSA: Tryptic Soy Agar VK: Vi khuẩn VP: Voges - Proskauer VPDS: Viêm phổi dính sƣờn YPC: Yaest extract pepton, L.cystine vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Trình tự Nucleotide OmlA 27 Bảng 3.2: Thành phần phản ứng PCR xác định gen OmlA 28 Bảng 3.3: Bảng đánh giá mức độ mẫn cảm vi khuẩn 29 Bảng 4.1: Kết giám định vi khuẩn A pleuropneumoniae phân lập đƣợc từ phổi lợn nghi mắc bệnh viêm phổi dính sƣờn 30 Bảng 4.2: Kết xác định số đặc tính sinh học chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae phân lập đƣợc 36 Bảng 4.3: Kết phản ứng lên men đƣờng chủng vi khuẩn nghi vi khuẩn A pleuropneumoniae phân lập đƣợc 36 Bảng 4.4: Kết PCR 38 Bảng 4.5: Kết quan sát thu thập triệu chứng lợn nghi mắc bệnh vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumonie 39 Bảng 4.6: Kết quan sát bệnh tích lợn nghi mắc bệnh vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumonie 40 Bảng 4.7: Kết xác định mức độ mẫn cảm với số kháng sinh chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae phân lập đƣợc 41 Bảng 4.8: Kết điều trị thử nghiệm lợn nghi mắc lợn mắc viêm phổi dính sƣờn 43 vii DANH MỤC HÌNH Hình 3.1: Cách tiến hành nhuộm Gram 22 Hình 4.1: Hình thái khuẩn lạc A pleuropneumoniae thạch máu 31 Hình 4.2: Hình thái khuẩn lạc A pleuropneumoniae sau nhuộm gram 32 Hình 4.3: phản ứng Voges - proskauer (VP) 33 Hình 4.4: phản ứng Urease 33 Hình 4.5: phản ứng thử nghiệm Catalase 34 Hình 4.6: phản ứng thử nghiệm CAMP 34 Hình 4.7: phản ứng Indol 35 Hình 4.8: phản ứng Oxidase 35 Hình 4.9: Hình ảnh chạy PCR khuẩn lạc nghi A pleuropneumoniae 38 Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài Trong năm qua, chăn ni lợn nƣớc ta có phát triển mạnh mẽ theo hƣớng chăn nuôi công nghiệp tập trung, đóng góp lớn cho phát triển kinh tế xã hội địa phƣơng Tuy nhiên xu hƣớng lại khơng theo tính quy hoạchdẫn đếntình trạng giá heo giảm đầu không đảm bảo.Theo Bộ NN&PTNT sau nhiều tháng chạm đáy, giá lợn tháng cuối năm có dấu hiệu tăng trở lại nhƣng khơng đủ để ngƣời chăn ni có lãi Tình trạng giá thấp kéo dài, khó khăn khâu tiêu thụ khiến ngƣời chăn nuôi lợn giảm đàn, bỏ đàn, treo chuồng Theo kết điều tra chăn nuôi kỳ 01/10/2017, đàn lợn nƣớc có 27,4 triệu con; giảm 5,7%; sản lƣợng thịt lợn xuất chuồng đạt 3,7 triệu tấn; tăng 1,9%.Không gặp nhiều rủi ro giá cả, thị trƣờng, chăn ni lợn cịn gặp vấn đề khó khăn nan giải loại dịch bệnh tiềm ẩn, ảnh hƣởng nhiều tới hiệu sản xuất Trong bệnh thƣờng gặp gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn ngồi bệnh truyền nhiễm thƣờng gặp bệnh viêm phổi đóng vai trị quan trọng việc gây tổn thất lớn cho chăn nuôi lợn nƣớc ta Bệnh viêm phổi vi khuẩn nguyên nhân gây chết nhiều lợn địa phƣơng nay, với nhiều nguyên gây bệnh bệnh lại đa dạng, triệu chứng bệnh khác Đặc biệt bệnh viêm phổi- viêm phổi màng phổi, Actinobaccilus pleuropneumonie gây tổn thất nghiêm trọng cho ngƣời chăn nuôi Vi khuẩn A.pleuropneumoniae gây dƣới thể viêm phổi gây chết nhiều lợn lứa tuổi, đặc biệt quan trọng lợn mắc bệnh viêm phổi màng phổi bị chết Ngoài vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae serovar thƣờng gặp gây chiếm tỷ lệ cao cịn serovar khác nhƣ 1, 7, gây Do cần đƣợc quan tâm nghiên cứu để có biện pháp làm giảm thiệt hại vi khuẩn A pleuropneumoniae gây Nếu khơng có biện pháp ngăn ngừa khả lây lan cao gây thiệt hại lớn cho đàn lợn ni Vì vậy, việc nghiên cứu phân lập xác định số đặc điểm sinh hóa vi khuẩn cần thiết từ biết đƣợc vai trò 39 4.5 Kết xác định triệu chứng, bệnh tích điển hình lợn mắc bệnh viêm phổi dovi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae gây Thái Nguyên - Sau tiến hành phân lập, xác định đặc tính sinh hóa, chạy phản ứng PCR vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae từ 30 mẫu lợn thu thập đƣợc kết có mẫu khuẩn lạc dƣơng tính với vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae Chúng quay trở lại điều tra triệu chứng bệnh tích mẫu lợn bị viêm phổi Actinobacillus pleuropneumoniae gây ra.Kết đƣợc thể bảng 4.5 4.6 Bảng 4.5: Kết quan sát thu thập triệu chứng lợn nghi mắc bệnh vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumonie Tổng số Biểu mẫu (con) Sốt, sốt nhẹ Lợn mệt mỏi, bỏ ăn, nơn, tiêu chảy, giảm trọng lƣợng, gầy Số có biểu Tỉ lệ (%) 3 100 3 100 3 100 3 100 33,33 Ho tự phát, ho ngắn từ đến cái, ho Triệu chứng giật giật thể bụng, vật tỏ đau đớn ho Thở khó, thở kiểu chó ngồi, nhịp tim tăng nhanh Có nhiều dịch bọt mũi miệng, mũi chân tai tím dần Từ bảng 4.5 thấy 100 % lợn sốt sốt nhẹ, lợn có biểu ho tự phát, ho ngắn từ đến cái, ho giật giật thể bụng, vật tỏ đau đớn ho Lợn có biểu mệt mỏi, bỏ ăn, nôn, tiêu chảy, giảm trọng lƣợng, gầy chiếm tỉ lệ 100% Lợn có tƣợng thở khó, thở kiểu chó ngồi, nhịp tim tăng nhanh chiếm Đối với 40 số trƣờng hợp lợn bị cấp thấy có nhiều bọt mũi miệng, chân, tai mũi tím dần chiếm 33,33% Bảng 4.6: Kết quan sát bệnh tích lợn nghi mắc bệnh vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumonie Tổng số Biểu mẫu (con) Khí quản chứa đầy chất nhầy, bọt đơi có lẫn máu Phổi sẫm màu khơng đồng đều, phổi bị Bệnh tích viêm Có nhiều tơ huyết gắn phổi thành ngực, hoành tim Bề mặt phổi có tơ huyết fibrin Số có biểu Tỉ lệ (%) 33,33 3 100 3 100 66,67 Từ bảng 4.6: thu đƣợc kết 100 % phổi sẫm màu khơng đồng đều, có tƣợng gan hóa đối xứng không đối xứng, phổi bị viêm Hiện tƣợng có nhiều tơ huyết gắn phổi thành ngực, hoành tim chiếm tỉ lệ 100 % Lợn mổ khám thấy khí quản chứa đầy chất nhầy, bọt đơi có lẫn máu chiếm tỉ lệ 33,33% trƣờng hợp bệnh tích lợn chết cấp tính Trên bề mặt phổi có tơ huyết fibrin chiếm tỉ lệ 66,67% Từ kết xác định bệnh tích từ lợn mắc viêm phổi dính sƣờn vi khuẩn A Pleuropneumoniae thấy lợn bị mắc viêm phổi dính sƣờn có triệu chứng sốt sốt nhẹ, lợn bỏ ăn mệt mỏi, lợn ho tự phát, ho ngắn từ đến cái, lợn thở khó thở kiểu chó ngồi, trƣờng hợp cấp tính tai mõm vùng da mỏng tím dần thiếu oxy, có bọt mũi, miệng Bệnh tích phổi bị gan hóa phần tồn phần, phổi bị viêm, bề mặt phổi có tơ huyết fibrin có nhiều tơ huyết gắn phổi 41 thành ngực, tim, hồnh Kết chúng tơi trùng khớp với kết nghiên cứu trƣớc (Nicolet, 1992) [33] (Fenwick Henry, 1994) [15] Kết xác định đốn lợn bị mắc viêm phổi dính sƣờn để có biện pháp phịng trị có hiệu 4.6 Kết xác định mức độ mẫn cảm với số kháng sinh vi khuẩn A pleuropneumoniae phân lập đƣợc Hiện nay, sử dụng kháng sinh không hƣớng dẫn chăn nuôi thú y nên xuất ngày nhiều loại vi khuẩn kháng thuốc, có vi khuẩn A pleuropneumoniae Để góp phần vào việc khống chế điều trị bệnh vi khuẩn A pleuropneumoniae gây lợn, tiến hành kiểm tra mức độ mẫn cảm với số kháng sinh chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae phân lập đƣợc, giúp cho việc lựa chọn kháng sinh điều trị đƣợc xác có hiệu Kết đƣợc trình bày bảng 4.7 Bảng 4.7: Kết xác định mức độ mẫn cảm với số kháng sinh chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae phân lập đƣợc Đánh giá mức độ mẫn cảm Số TT Kháng chủng sinh VK Mạnh d thử (mm) Trung bình (+) (%) d (mm) Kháng thuốc (+) (%) d (mm) (+) (%) Ceftiofur 23.5 100 - 0 - 0 Amoxicillin 21.3 100 - 0 - 0 Florfenicol 23 66,67 21.2 33,33 - 0 Ampicillin - 0 20.7 100 - 0 Tetracyclin - 0 26.4 66,67 22.1 33,33 Colistin 16.6 33,33 13.5 66,67 - 0 Kết đƣợc so sánh vớiBảng đánh giá mức độ mẫn cảm vi khuẩn với số loại kháng sinh (NCCLS - 2002) [39] Qua bảng 4.7 cho thấy: chủng vi khuẩnA pleuropneumoniae phân lập đƣợc mẫn cảm với ceftiofur amoxicillin, chiếm tỷ lệ 100%; 42 florfenicol 66,67% Một số kháng sinh đƣợc sử dụng nhiều có tỷ lệ mẫn cảm mức trung bình nhƣ ampicilin 100%, Colistin, tetracyclin 66,67% tỉ lệ kháng thuốc tetracyclin 33,33% Có nhiều nguyên nhân dẫn đến tƣợng kháng kháng sinh vi khuẩn A pleuropneumoniae ngày gia tăng nhƣ việc dùng kháng sinh điều trị kéo dài, kháng sinh đƣợc bổ xung vào thức ăn tƣợng di truyền tính kháng thuốc gen nằm plasmid vi khuẩn A pleuropneumoniae Từ kết làm tiền đề để đƣa phác đồ thử nghiệm thực tiễn để có phác đồ xác hiệu nhanh cho ngƣời chăn nuôi nhằm giảm thiểu thiệt hại kinh tế 4.7 Kết thử nghiệm số phác đồ điều trị lợn nghi mắc viêm phổi dính sƣờn A pleuropneumoniae Căn vào kết kháng sinh đồ chọn loại kháng sinh có độ mẫn cảm mạnh với vi khuẩn A Pleuropneumoniaephân lập đƣợc ceftiofur, amoxicillin,florfenicol xây dựng phác đồ điều trị thử nghiệm lợn mắc bệnh tỉnh Thái Nguyên Các phác đồ điều trị thử nghiệm lợn mắc bệnh nhƣ sau: + Phác đồ 1: Điều trị nguyên nhân lợn mắc viêm phổi dùng loại thuốc CEFANEW-LA công ty cổ phần thuốc thú y Marphavet sản xuất (thành phần ceftiofur: 10g/100 ml), tiêm bắp với liều lƣợng: ml/25 kg thể trọng/ngày, tƣơng ứng mg ceftiofur/kg thể trọng; thuốc tác dụng kéo dài 72 - 96 Điều trị triệu chứng, trợ lực, trợ sức: GLUCO-K-C-NAMIN, tiêm bắp với liều: ml/10 kg thể trọng/ngày +Phác đồ 2: Dùng loại thuốc MARPHAMOX-LA công ty cổ phần thuốc thú y Marphavet sản xuất (thành phần amoxicillin:15g/100 ml), tiêm bắp với liều lƣợng ml/10 kg thể trọng/ngày; tƣơng ứng 15 mg amoxicillin/kg thể trọng; thuốc tác dụng kéo dài 48 Điều trị triệu chứng, trợ lực, trợ sức: GLUCO-K-C-NAMIN, tiêm bắp với liều: ml/10 kg thể trọng/ngày 43 +Phác đồ 3: Dùng loại thuốc MARFLO-45% công ty cổ phần thuốc thú y Marphavet sản xuất (thành phần florfenicol: 45g/100 ml), tiêm bắp với liều lƣợng ml/30 kg thể trọng/ngày, tƣơng ứng 15 mg florfenicol/kg thể trọng; thuốc tác dụng kéo dài 72 - 96 Điều trị triệu chứng, trợ lực, trợ sức: GLUCO-K-C-NAMIN, tiêm bắp với liều: ml/10 kg thể trọng/ngày Và vào triệu chứng lợn mắc bệnh viêm phổi dính sƣờn vi khuẩn A pneuropneumoniae gây chọn lợn bị bệnh để tiến hành thử nghiệm phác đồ điều trị Kết điều trị thử nghiệm lợn nghi mắc PRRS mắc viêm phổi đƣợc trình bày bảng 4.8 Bảng 4.8: Kết điều trị thử nghiệm lợn nghi mắc lợn mắc viêm phổi dính sườn Phác đồ Loại thuốc CEFANEWLA (ceftiofur: I 10g/100ml) cách dùng tiêm bắp; thuốc tác dụng 72-96 Na tiêm bắp: 1lần/ngày (amoxicillin: 15g/100ml) (con) khỏi bệnh (con) Tỷ lệ (%) (4mg ceftiofur/kgTT); 1ml/10kg TT/ngày; LA điều trị điều trị Số 1ml/25kg TT/ngày Gluco-K-C- Marphamox- II Liều lƣợng Số đƣợc Số ngày 10 90,00 15 13 86,67 1ml/10kg TT/ngày (15mg amoxicillin/kgTT); tiêm bắp; thuốc tác dụng 48 Gluco-K-C- 1ml/10kg TT/ngày; Na tiêm bắp: 1lần/ngày 44 MARFLO45% III (florfenicol: 45g/100ml) 1ml/30kgTT/ngày (15mg florfenicol/kgTT); tiêm bắp; thuốc tác 13 10 76,92 38 32 84,21 dụng 72 - 96 Gluco-K-C- 1ml/10kg TT/ngày; Namin tiêm bắp: 1lần/ngày Tổng hợp Ghi chú: TT - Thể trọng - Qua bảng 4.8 cho thấy điều trị thử nghiệm lợn nghi mắc viêm phổi với loại kháng sinh ceftiofur, amoxicillin, florfenicol Ngoài sử dụng loại kháng sinh điều trị chúng tơi cịn bổ sung tiêm thêm Gluco.K.C.Namin để trợ sức trợ lực, giảm sốt, giảm ho, tiêu viêm tăng cƣờng sức đề kháng cho lợn bệnh - Ở phác đồ sử dụng ceftiofur với liều lƣợng mg/kg thể trọng, điều trị 10 lợn mắc viêm phổi có khỏi, đạt tỷ lệ 90,00% - Ở phác đồ sử dụng amoxicillin với liều lƣợng 15 mg/kg thể trọng; tiến hành điều trị 15 lợn mắc viêm phổi, khỏi 13 con, đạt tỷ lệ 86,67% - Ở phác đồ sử dụng florfenicol với liều lƣợng 15 mg/kg thể trọng; điều trị tổng số 13 lợn mắc viêm phổi, khỏi 10 con, đạt tỷ lệ 76,92% - Tổng cộng với phác đồ điều trị thử nghiệm 38 lợn mắc viêm phổi có 32 khỏi, đạt tỷ lệ trung bình 84,21% Trong đó, phác đồ có tỷ lệ khỏi cao (90,00%), tiếp đến phác đồ (86,67%) thấp phác đồ (76,92%) - Nhƣ vậy, phác đồ điều trị thử nghiệm lợn nghi mắc viêm phổi tỉnh Thái Nguyên có kết tốt, tỷ lệ lợn khỏi bệnh cao Từ kết thu đƣợc qua điều trị thử nhiệm, khuyến cáo ngƣời chăn nuôi chủ động sử dụng ba phác đồ để điều trị lợn nghi mắc viêm phổi, đặc biệt phác đồ (sử dụng kháng sinh ceftiofur) 45 - Xây dựng thành công phác đồ tạo điều kiện cho ngƣời chăn nuôi, cán thú y sở chủ động phòng điều trị bệnh viêm phổi lợn, giảm thiểu đƣợc thiệt hại, tăng giá trị sản phẩm chăn ni Từ ổn định nguồn cung cấp thực phẩm tiêu dùng hàng ngày làm cho giá ổn định đồng thời giúp ngành chăn nuôi lợn tỉnh phát triển bền vững 46 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Các mẫu A Pleuropneumoniae phân lập đƣợc mang hình thái, đặc tính ni cấy, hóa học tƣơng đồng với tài liệu ngồi nƣớc cơng bố - A pleuropneumoniaephân lập đƣợc vi khuẩn bắt màu Gram âm, dạng cầu trực khuẩn, kích thƣớc khoảng 0,3-0,5 x 0,6-1,4 pm.Dƣới kính hiển vi điện tử phát vi khuẩn có nhung mao với kích thƣớc 0,5-2 x 60-450 nm - 100% Vi khuẩnA pleuropneumoniae lên men đƣờng glucose, xylose, mannitol, mannose không lên men đƣờng arabinose, lactose, raffinose, sorbitol Dƣơng tính với phản ứng urease, oxidase, CAMP, O.N.P.G; âm tính với phản ứng sinh Indol không mọc thạch MacConkey - Lợn bị mắc viêm phổi dính sƣờn vi khuẩn Actinobaccillus pneuropneumoniae có triệu chứng sốt sốt nhẹ, lơn bỏ ăn mệt mỏi, lợn ho tự phát, ho ngắn từ đến cái, lợn thở khó, thở kiểu chó ngồi, trƣờng hợp cấp tính tai mõm vùng da mỏng tím dần thiếu oxy, có bọt mũi, miệng Bệnh tích phổi bị gan hóa phần tồn phần, phổi bị viêm, bề mặt phổi có tơ huyết fibrin có nhiều tơ huyết gắn phổi thành ngực, tim, hoành - Vi khuẩnA pleuropneumoniae phân lập đƣợc mẫn cảm với ceftiofur amoxicillin - Sử dụng kháng sinh Ceftiofur, amoxilin, fofenicol thuốc trợ sức trợ lực điều trị bệnh viêm phổi dính sƣờn đạt hiệu cao 5.2 Đề nghị - Tiếp tục tiến hành phản ứng PCR xác định gen độc tố chọn đƣợc chủng vi khuẩnA pleuropneumoniae mang tính đại diện, điển hình, phù hợp với thực địa để dùng làm giống sản xuất vaccine phòng bệnh viêm phổi cho lợn - Áp dụng phác đồ thử nghiệmđiều trị lợn nghimắc viêm phổi vi khuẩn A Pleuropneumoniaegây địa phƣơng 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Tiêu Quang An, Nguyễn Hữu Nam (2011), “Xác định số vi khuẩn kế phát gây chết lợn vùng dịch lợn Tai xanh huyện Văn Lâm tỉnh Hƣng Yên năm 2010”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 18(3), tr 56- 64 Đặng Xuân Bình, Nguyễn Thị Ngân, Phan Hồng Phúc (2007), “Tình hình nhiễm Actinobacillus pleuropneumoniaevà bệnh viêm phổi màng phổi lợn”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 14(2), tr 36-39 Lê Văn Dƣơng (2013), “Nghiên cứu số đặc tính sinh học vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Streptococcussuis gây viêm phổi Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn Bắc Giang, biện pháp phòng trị” Luận án tiến sỹ thú y, Đại học Thái Nguyên,tr 82- 116 Nguyễn Thị Thu Hằng (2010), Nghiên cứu số đặc tính sinh học tính sinh miễn dịch Actinobacillus pleuropneumoniae phân lập từ lợn làm sở cho việc chế tạo vaccine.Luận án tiến sĩ Nông nghiệp, Viện Thú y Quốc gia, Hà Nội, tr 115-116 Trịnh Quang Hiệp, Cù Hữu Phú, Nguyễn Thu Hằng, Âu Xuân Tuấn (2004), “Xác định đặc tính sinh vật hoá học, độc lực vi khuẩn Actinobacillus, Pasteurella Streptocococcus gây bệnh viêm phổi lợn”, Tạp chí khoa học-cơng nghệ Bộ Nơng nghiệp PTNT (4), tr 476-477 Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Nguyễn Thu Hằng, Âu Xuân Tuấn, Nguyễn Bích Thuỷ, Vũ Ngọc Quý, Phạm Bảo Ngọc (2005), “Xác định nguyên nhân gây bệnh đƣờng hô hấp lợn nuôi số tỉnh phía Bắc”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 12(4), tr 23-32 Tiếng Anh Archambault M., Rioux S., Jacques M (1999), Evaluation of the hemoglobine binding activity of Actinobacillus pleuropneumoniae using fluorescein labeled pig hemoglobin and flow cytometry FEMS Microbiol Lett;173:17-25 Bertram T A (1986), Intravascular macrophages in lungs of pigs infected 48 with Haemophilus pleuropneumoniae Vet Pathol 23: 681-691 Blackall P J., Klaasen H B L M., van den Bosch H., Kuhnert P., Frey J (2002), Proposal of a new serovar of Actinobacillus pleuropneumoniae: serovar 15, Vet Microbiol (84) 47-52 10 Chang Y F., Shi J R., Ma D P., Shin S J., Lein D H (1993), Molercular analysis of the Actinobacillus pleuropneumoniae RTX Toxin-III gene cluster DNA Cell Biol 12: 351-362 11 Cho W S., Chae C (2001), Expression of the apx IV Gene in Pigs Naturally Infected with Actinobacillus pleupneumoniae, J Comp Path 125, p 34 - 40 12 Chung J W., Ng- Thow- Hing C., Budman L I., Gibbs B F., Nash J H., Jacques M., Coulton J W (2007), Outer membrane proteome of Actinobacillus pleuropneumoniae: LC-MS/MS analyses validate in silico predictions Proteomics Jun; 7(11): 1854-1865 139, pp 1-5 13 Devenish J., Rosendal S., Bosse J T., Wilkie B N., Johnson R (1990), Prevalence of seroreactors to the 104-kilodalton hemolysin of Actinobacillus pleuropneumoniae in swine herds, J Clin Microbiol 28:789-791 14 Fedorka-Cray P J., Hoffman L., Cray W C., Gray J T., Breish S A., Anderson G A (1993), Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae Part I History, epidemiology, serotyping, and treatment Compend Contin Ed Practic Vet 15:1447-1455 15 Fenwick B., Henry S (1994), Porcine pleuropneumonia.J Am Vet Med Assoc 204:1334-1340 16 Frey J., Nicolet J (1988), Purification and partial characterization of a hemolysin produced by Actinobacillus pleuropneumoniae type strain 4074 FEMS Microbiol Lett 55:41-46 17 Frey J., Nicolet J (1990), Hemolysin patterns of Actinobacillus pleuropneumoniae J.Clin Microbiol 28:232-236 18 Frey J., Bosse J T (1993), Actinobacillus pleupneumoniae RTX toxins: Uniform designation of haemolysins, cytolysins pleurotocin and their genes, J Gen 49 Microbiol 139, p 1723 - 1728 19 Frey J., Kuhn R., Nicolet J (1994), Association of the CAMP phenomenon in Actinobacillus pleuropneumoniae with the RTX toxins ApxI, ApxII and ApxIII FEMS Microbiol Lett124 245-251 20 Gerlach G F., Klashinsky S., Anderson C., Potter A A., Willson P J (1992), Characterization of two genes encoding distinct transferring binding proteins in different Actinobacillus pleuropneumoniae isolates Infect Immun;60: 3253-3261 21 Gonzalez G C., Yu R H., Rosteck P R J R., Schryvers A B (1995), Sequence, genetic analysis and expression of transferrin receptor genes Microbiology (Reading) 141: 2405-2416 22 Jacobsen M J., Nielsen J P., Nielsen R (1996), Comparison of virulence of different A pleuropneumoniae serotypes and biotypes using an aerosol infection model.Veterinary Microbiology 49: 159-168 23 Jacques M (2004), Surface polysaccharides and iron-uptake systems of Actinobacillus pleuropneumoniae The Canadian Journal of Veterinary Research 68:81-85 24 Jensen A E., Bertram T A (1986), Morphological and biochemical comparison of virulent and avirulent isolates of Haemophilus pleuropneumoniae serotype Infect Immun 51:419-424 25 Kamp E M., Vermeulen T M., Smits M A., Haagsma J (1994), Production of Apx toxins by field strains of A pleuropneumoniae and Actinobacillus suis Infect Immun 62: 4063-4065 26 Kilian M (1976), A taxonomic study of the genus Haemophilus, with the proposal of a new species J Gen Microbiol 9-62 27 Langford P R., Loynds B M., Kroll J S (1996), Cloning and molecular characterisation of copper-zinc superoxidase dismutase from Actinobacillus pleuropneumoniae Inf and Imm 64: 5035-5041 28 Leman A D (1992), The decision to repopulate In Proceedings Am Assoc Swine Pract pp 9-12 50 29 Macdonald J., Rycroft A N (1992), Molecular cloning and expression of ptxA, the gene encoding the 120-kilodalton cytotoxin of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype Infection and Immunity 60: 2726- 2732 30 Macdonald J., Rycroft A N (1993), Actinobacillus pleuropneumoniae haemolysin II is secreted from Escherichia coli by Actinobacillus pleuropneumoniae pleurotoxin secretion gene products FEMS Microbiol Lett 109, 317-322 31 MacInnes J I., Rosendal S (1988), Prevention and control of Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae infection in swine: A review Can Vet J 572573 32 Nicolet J., Schifferli D (1982), In vitro susceptibility of Haemophilus- Pleuropneumoniae to antimirobial substances Porc Int Congr Pig Vet Soc 7:71 33 Nicolet J (1992),Actinobacillus pleuropneumoniae: In Leman AD, Straw B, Mengeling WL, D’Allaire S, Taylor DJ (ed.): Diseases of swine Iowa State University Press, Ames, pp 401-408 34 Nielsen R., Adresen L O., Plambeck T., Nielsen J P., Krarup L T., Jorsal S V (1997), Serological characterization of Actinobacillus pleuropneumoniae biotype strains isolated from pigs in two Danish herds Vet Microbiol 54, 35 - 46 35 Prescott J F., Baggot J D (1993), Antimicrobial Therapy in Medicine Ames: Iowa State Univ Press 36 Rayamajhi N., Shin S J., Kang S G., Lee D Y., Ahn J M., Yoo H S (2005), Development and use of a multiplex polymerase chain reaction assay based on Apx toxin genes for genotypeing of Actinobacillus pleuropneumoniae isolates J Vet Diagn Invest Jul;17(4): 359-62 37 Rycroft A N., Williams D., Cullen J M., MacDonald J (1991a), The cytotoxin of Actinobacillus pleuropneumoniae (pleurotoxin) is distinct from the hemolysin and is associated with a 120 kDa polypeptide J Gen Microbiol 137: 561- 568 51 38 Ward C K., Inzana T J (1997), Identification and characterization of a DNA region involved in the export of capsular polysaccharide by A pleuropneumoniae serotype 5a Infect and Immun 65: 2491-2496 39 Negrete-Abascal E., Tenorio V R., Serrano J J., Garcia C., de la Garza M (1994), Secreted proteases from Actinobacillus pleuropneumoniae serotype degrade porcine gelatin, hemoglobin and immunoglobulin A Can J Vet Res 58:8386 PHỤ LỤC Một số hình ảnh trình nghiên cứu Hình 1: lợn bị VPDS Hình 3: mẫu phẩm phổi bệnh Hình 2: mổ khám lợn VPDS Hình 4: ni cấy VK Giảng viên hƣớng dẫn TS NGUYỄN NGỌC MINH TUẤN Sinh viên thực LƢU THỊ TRÀ MY ... gây đột biến chủng A pleuropneumoniae serotype để không sản sinh ApxI ApxII sau dùng chủng đột biến làm giống gốc sản xuất vaccine cho thấy động vật thí nghiệm khơng có khả bảo hộ chủng tự nhiên... đến khác độc lực Các chủng A pleuropneumoniae độc lực cao có lớp vỏ dầy, số chủng khơng độc có lớp vỏ mỏng dễ dàng bị phá vỡ Quan sát dƣới kính hiển vi điện tử cho thấy chủng có độc lực có kích... vỏ A pleuropneumoniae có đặc tính chống lại thực bào đƣợc coi chắn chủ yếu vi khuẩn chống lại hệ thống bảo vệ vật chủ Những chủng A pleuropneumoniae có vỏ bình thƣờng có khả kháng lại với tƣợng