-Bƣớc 1: Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nƣớc cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí.
- Bƣớc 2: Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 1 - 2 phút, rửa nƣớc, thấm khô.
- Bƣớc 3: Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol 10% trong 1 - 2 phút, rửa nƣớc, thấm khô.
- Bƣớc 4:Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây, rửa nƣớc, thấm khô.
- Bƣớc 5: Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fucsin trong 1 - 2phút, rửa nƣớc, để khô trong không khí.Sau khi nhuộm Gram, đem tiêu bản soi ở vật kính dầu 1000.
3.4.5. Phản ứng sinh hóa
3.4.5.1. Phản ứng lên men đường
- Thử lên men các loại đƣờng: Dùng môi trƣờng pepton cho thêm 1% một trong các loại đƣờng Glucose, Saccarose, Lactose, Mannit và chỉ thị đỏ Phenol. Cấy vi khuẩn, để37°C/24h,đọc kết quả. Phản ứng dƣơng tính khi môi trƣờng chuyển màu đỏ, âm tính khi môi trƣờng không chuyển màu.
- A. pleuropneumoniae: Lên men các loại đƣờng Glucose, Saccarose, Mannit và không lên men đƣờng Lactose.
3.4.5.2. Kiểm tra đặc tính urease
Nguyên tắc: Sử dụng để phát hiện khả năng phân cắt urea thành ammonia do hoạt tính của urease từ vi sinh vật và kết là môi trƣờng bị kiềm hóa do NH3đƣợc tạo ra, sử dụng môi trƣờng Urea broth. Môi trƣờng có màu hồng khi dƣơng tính và đổi thành màu vàng cam khi âm tính.
3.4.5.3. Test indol
Nguyên tắc là để phát hiện khả năng oxi hóa tryptophan thành các dạng của indol, dùng thuốc thử Kovacs‟s. Kết quả dƣơng tính nếu xuất hiện màu đỏ trên mặt, âm tính nếu màu vàng.
3.4.5.4. Kiểm tra Voges-proskauer (VP)
Nguyên tắc: Xác định khả năng sinh acetyl methycarbinol trong quá trình lên men glucose, dùng thuốc thử naphtol và KOH 40%. Kết quả dƣơng tính khi có màu đỏ -hồng nhạt trên môi trƣờng, âm tính khi có màu vàng trên bề mặt môi trƣờng.
3.4.5.5. Kiểm tra oxidase
Nguyên tắc xác định sự hiện diện của enzyme oxidase sử dụng thuốc thử p- phenylenediamine. Kết quả dƣơng tính khi khuẩn lạc biến đổi thành màu xanh, âm tính nếu khuẩn lạc không đổi màu.
3.4.5.6. Thử nghiệm catalase
Nguyên tắc phát hiện enzyme catalase của vi sinh vật dùng thuốc thử hydrogen peroxide 30%. Kết quả dƣơng tính nếu có sủi bọt và âm tính nếu không sủi bọt.
3.4.5.7. Thử nghiệmCAMP
Phản ứng CAMP là phản ứng phối hợp giữa nhân tố protein tiết ra bởi vi sinh vật với nhân tố b-hemolysin tiết ra bởi S. aureus gây hiện tƣợng làm tan hồng cầu của cừu trên môi trƣờng thạch máu. Nhân tố CAMP có vai trò tăng cƣờng hoạt tính phospholipase C xúc tác thủy phân thành phần chủ yếu của mảng hồng cầu cừu là sphingommyelin của -hemolysin. Trong thử nghiệm CAMP, cấy chủng kiểm nghiệm cùng với chủng S. aureus tạo nhiều -hemolysin lên môi trƣờng thạch máu đƣợc bổ sung máu cừu. Kết quả dƣơng tính nếu có sự hình thành vùng cộng hƣởng tan huyết tại vùng tiếp giáp giữa hai đƣờng cấy củaA. Pleuropneumoniae vàS. aureus.
3.4.6. Phƣơng pháp xác định A. Pleuropneumoniae bằng kỹ thuật PCR
3.4.6.1. Kỹ thuật tách DNA vi khuẩn gram âm
- Các bƣớc tiến hành:
+ Pha 48mg Proteinase K dạng đông khô trong 2,4ml đệm tƣơng ứng (PK Storage buffer) đạt nồng độ 20mg/ml.
Trộn đều bằng máy vortex, sau đó chia đều ra các ống eppendorf, bảo quản ở tủ -20oC.
Bƣớc 1: Thu tế bào
+ Đối với TB nuôi trên đĩa thạch: Thu khoảng 1 vòng que cấy tế bào trên đĩa thạch cho vào ống eppendorf 1.5ml. Bổ sung 500ul đệm PBS vô trùng, trộn đều bằng máy vortex. Ly tâm 6000 vòng, 5 phút => bỏ dịch, giữ lại tủa tế bào.
+ Đối với tế bào nuôi lắc: Ly tâm thu tủa tế bào, loại bỏ dịch. (A600 = 1 sẽ tƣơng đƣơng khoảng 2x109 tế bào).
Bƣớc 2: Thêm đệm CL
+ Bổ sung 200µL đệm CL vào tế bào thu đƣợc trong ống eppendorf 1.5ml. + Trộn đều bằng pipet.
Bƣớc 3: Xử lý enzyme
+ Ủ ở 56oC trong 15 phút cho đến khi dung dịch trong suốt (Thời gian ủ có thể thay đổi tùy theo loại vi khuẩn và số lƣợng tế bào. Có thể ủ lâu hơn để phân giải hoàn toàn tế bào).
+ Sau khi ủ đƣa hỗn hợp về nhiệt độ phòng.
+ Spin để dồn hết chất lỏng xuống không để đọng trên nắp.
Bƣớc 4: Xử lý loại RNA (có thể không cần thiết)
+ Khi thí nghiệm yêu cầu không lẫn tạp RNA vào hỗn hợp DNA, xử lý mẫu tách bằng 20µl RNAse.
+ Trộn đều bằng máy vortex và ủ 2 phút ở nhiệt độ phòng.
Bƣớc 5: Thêm đệm BL
Bổ sung 200 µl Buffer BL và trộn đều bằng máy vortex. + Ủ ở 70oC trong vòng 10 phút.
+ Đƣa về nhiệt độ phòng và spin để dồn chất lỏng xuống.
+ Bƣớc này là bƣớc quan trọng, phải trộn đều mẫu và đệm BL để cho kết quả tốt nhất.
Bƣớc 6: Thêm Ethanol
+ Bổ sung 200µl Cồn ethanol 96% (không kèm trong kit) + Trộn đều bằng máy vortex, Spin để dồn chất lỏng xuống
+ Chú ý trộn đều mẫu và ethanol để cho kết quả tốt. Sau khi bổ sung ethanol vào mẫu sẽ xuất hiện kết tủa trắng. Bƣớc này cần thiết để chuyển tất cả hỗn hợp, kể cả kết tủa sang cột SV ở bƣớc tiếp theo.
Bƣớc 7: Chuyển lên cột
+ Chuyển toàn bộ chất lỏng lên Cột SV bằng pipet một cách cẩn thận. + Ly tâm 13000 vòng trong 1 phút.
+ Chuyển cột sang đế mới.
+ Nếu hỗn hợp không chảy hết qua màng thì tiến hành ly tâm lại ở tốc độ tối đa cho đến khi loại bỏ hết tất cả phần dung dịch. Ly tâm ở tốc độ tối đa không ảnh hƣởng đến việc thu DNA.
+ Bổ sung 600 µl đệm BW và ly tâm ở 13000 vòng trong 1 phút. + Loại bỏ chất lỏng ở đế cột, giữ lại cột.
+ Nếu cột SV có cặn mầu sau khi ly tâm thì lặp lại bƣớc này cho đến khi loại bỏ đƣợc cặn mầu.
+ Ly tâm ở tốc độ tối đa không ảnh hƣởng đến việc thu DNA.
Bƣớc 9: thêm đệm TW
+ Bổ sung 700 µl Buffer TW và ly tâm ở 13000 vòng trong 1 phút. + Loại bỏ chất lỏng ở đế cột, giữ lại cột.
Bƣớc 10: Ly tâm
+ Ly tâm 10 phút ở 13000 vòng, bỏ đế cột.Chuyển cột sang ống eppendorf 1.5ml mới
+ Bƣớc này cần thực hiện cẩn thận để loại bỏ hết chất mang của đệm TW. Nếu vẫn còn chất mang của đệm TW thì lặp lại bƣớc này rồi mới chuyển cột sang ống eppendorf 1.5ml mới.
+ Ly tâm phải thực hiện ở tốc độ tối đa.
Bƣớc 11: Thu DNA
+ Bổ sung 50µl đệm AE hoặc nƣớc. Để yên trong vòng 1 phút ở nhiệt độ phòng.
+ Ly tâm ở 13000 vòng trong 1 phút.
- Các hóa chất sử dụng trong quá trình tách chiết:
+ PBS buffer (Phosphate Buffered Saline): Là một dung dịch đệm đƣợc dùng phổ biến trong nghiên cứu sinh học, không độc với hầu hết các tế bào, giữ ổn định độ pH của môi trƣờng.
+ Proteinase K: Là một serin protease phổ rộng, có tác dụng thủy phân Protein. Enzym này đƣợc chiết xuất từ nấm Engyodontium album. Proteinase K có thể tiêu hóa đƣợc keratin tự nhiên (tóc), do đó nó có tên là Proteinase K.
+ Buffer CL: (Cell Lysis buffer): Trong hầu hết các quy trình tách chiết đối với nucleic acid, protein hay các nội quan khác thì bƣớc đầu tiên luôn luôn là ly giải
tế bào. Lysis buffer là một dung dịch đệm đƣợc dùng để phá vỡ cấu trúc màng tế bào và hầu hết chứa các muối để điều chỉnh độ axít và độ thẩm thấu của tế bào ly giải.
+ Buffer BL (Bacterial Lysis buffer): Trong tách chiết DNA, đệm này đƣợc sử dụng để hòa tan DNA cũng nhƣ RNA, do đó nó sẽ ngăn chặn quá trình thủy phân của DNA.
+ Ethanol (96%): Kết tủa DNA trong dung dịch.
+ Buffer BW (Bind and Wash buffer): Loại bỏ các muối và các thành phần khác của quá trình tách chiết, chỉ giữ lại DNA trên cột.
+ Buffer AE: (Acetate-EDTA buffer): Là một buffer để lƣu trữ DNA, giảm thiểu quá trình thủy phân của DNA trong khi thao tác các thí nghiệm.
3.4.6.2. Kỹ thuật PCR xác định A.Pleuropneumoniae
PCR (Polymerase Chain Reaction) còn đƣợc gọi là phản ứng khuếch đại đoạn gen, đây là phƣơng pháp tổng hợp một đoạn DNA đặc hiệu trong điều kiện in-vitro với sự xúc tác của enzyme DNA-Polymerase để cắt 1 đoạn DNA đích cần tổng hợp. Cho đến nay kỹ thuật PCR đƣợc xem là một trong những phƣơng pháp nền quan trọng nhất của công nghệ sinh học hiện đại.
3.4.6.3. Kỹ thuật PCR được sử dụng để xác định gen OmlA
Bảng 3.1: Trình tự Nucleotide của OmlA Gen
đích
Ký hiệu
Primers Chuỗi Primer (5’-3’)
Kích cỡ sản phẩm
(bp)
OmlA LPF LPR
5‟-AAG GTT GAT ATG TCC GCA CC-3‟
5‟-CAC CGA TTA CGC CTT GCC A-3‟ 950bp Thành phần các chất trong phản ứng PCR đƣợc thực hiện với tổng thể tích là 25 µl, đƣợc trình bày nhƣ sau:
Bảng 3.2: Thành phần phản ứng PCR xác định gen OmlA Thành phần Thể tích (µl) Nồng độ
Mồi xuôi 1 10 µM/µl
Mồi ngƣợc 1 10 µM/µl
Dung dịch đêm AMP x5 gồm: 5 +750 mM Trí-HCl +200 mM (NH4)2SO4 +0,1% Tween 20 +dNTPs +2mM MgCl2
Tag DNA polymerase 0,05 500UI
DNA vi khuẩn 1
Nƣớc khử ion 17
Tổng cộng 25
Phản ứng PCR gồm các giai đoạn: tiền biến tính 24oC/2phút và 26 chu kỳ nhiệt (biến tính ở 94oC/1 phút, ủ bắt cặp 52oC/1phút, kéo dài 72oC/1phút) và kéo dài cuối cùng 72oC/10 phút.
Phân tích sản phẩm PCR đƣợc tiến hành điện di trển 1,5% Agarose trong dung dịch 1xTAE với hiệu điện thể 110V trong 30 phút. Đọc kết quả và chụp ảnh bằng hệ thống.Đọc kết quả và chụp ảnh bằng hệ thống UVP MultiDoc-It Digital Imaging System.Ảnh chụp đƣợc lƣu giữ và xử lý kết quả khi cần thiết.
Nếu sau quá trình điện di cho kích cỡ là các vạch hiển thị tƣơng ứng với 950bp thì có thể kết luận chủng vi khuẩn kiểm tra là A. Pleuropneumoniae.
3.4.7. Phƣơng pháp xác định mức độ mẫn cảm với một số kháng sinh của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập đƣợc chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập đƣợc
* Cách tiến hành:
- Vi khuẩn A. Pleuropneumoniaenuôi cấy trong môi trƣờng thạch TSA qua đêm. Các khuẩn lạc của các vi khuẩn đƣợc tạo huyền phù trong nƣớc muối sinh lý 0,9% để đƣợc độ đục tƣơng đƣơng ống McFarland 1 (3 x 108
CFU/ml). Dùng tăm bông vô trùng, tẩm dung dịch đã pha loãng và dàn đều lên thạch đĩa Muller Hinton.
- Dùng máy tự động đặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxioid (Anh) lên mặt đĩa thạch;
- Bồi dƣỡng đĩa thạch ở 37oC/18 - 24 giờ (5% CO2). Đọc kết quả bằng cách đo đƣờng kính vòng vô khuẩn và so sánh với bảng chuẩn để đánh giá mức độ mẫn cảm hay kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn kiểm tra (bảng 3.3).
Bảng 3.3: Bảng đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng sinh (NCCLS - 2002)[39] TT Loại
kháng sinh Hàm lƣợng Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm)
Mạnh Trung bình Kháng thuốc 1 Ceftiofur 30 µg ≥ 21 18 - 20 17 2 Ampicillin 10 µg ≥ 22 19 - 21 ≤ 18 3 Amoxicillin 20 µg ≥ 20 - ≤ 19 4 Neomycin 30 µg ≥ 17 13 - 16 ≤ 12 5 Amikacin 30 µg ≥ 17 15 - 16 ≤ 14 6 Gentamicin 10 µg ≥ 19 - ≤ 15 7 Lincomycin 15 µg ≥ 15 13 - 14 ≤ 12 8 Colistin 10 µg ≥ 15 13 - 14 ≤ 12 9 Tetracyclin 30 µg ≥ 29 26 - 28 ≤ 25 10 Erythromycin 15 µg ≥ 21 16 - 20 ≤ 15 11 Florfenicol 30 µg ≥ 23 - ≤ 20
3.5. Phƣơng pháp phân tích số liệu
Số liệu thu đƣợc trong các thí nghiệm đƣợc xử lý theo phƣơng pháp thống kê sinh học với sự hỗ trợ của phần mềm Excel.
CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ
4.1.Kết quả tách khuẩn lạcnghi Actinobacillus pleuropneumoniae phân lập đƣợc từ mẫu phổi lợn trên môi trƣờngthạch
Từ 30 mẫu bệnh phẩm phổi đƣợc thu thập chúng tôi đem cấy trên môi trƣờng thạch PPLO,sau đó sẽ đƣợc để trong tủ ấm CO2 (5%) trong 24h. Sau 24h thu đƣợc 5 mẫu cho khuẩn lạc có hình dạng trắng xanh, có nhày đây là những đặc điểm nghi ngờ khuẩn lạc là vi khuẩn A. pleuropneumoniaechiếm tỉ lệ 16,67%.
Sau khi thu đƣợc 5 mẫu khuẩn lạc nghi ngờ là A.pleuropneumoniae chúng tôi tiếp tục thử đặc tính nuôi cấy trên các môi trƣờng khác nhƣ môi trƣờng thạch thƣờng, thạch máu, thạch choccolate thạch Macnonkey, TSA.
Bảng 4.1: Kết quả giám định vi khuẩn A.pleuropneumoniae phân lập đƣợc từ phổi của lợn nghi mắc bệnh viêm phổi dính sƣờn.
MT Đặc tính Actinobacillus pleuropneumoniae Số mẫu kiểm tra n = 5 Số mẫu dƣơng tính Tỉ lệ (%) MT thạch thƣờng S (khuẩn lạc dạng S), nhỏ vàng 5 4 80 MT thạch máu Mọc manh, nhỏ, dung huyết 5 3 60 MT thạch chocolate
khuẩn lạc nhầy, màu
trắng xám. 5 2 40 MT thạch MacConkey Không mọc 5 3 60 Môi trƣờng TSA khuẩn lạc nhỏ, màu trắng trong, dƣới ánh sáng đèn
Từ bảng 4.1 ta thấy:
Dựa trên đặc tính nuôi cấy trên các môi trƣờng của vi khuẩn
ActinobacillusPleuropneumoniae:
+ MT thạch thƣờng: khuẩn lạc dạng S, nhỏ vàng
+ MT thạch máu: khuẩn lạc mọc manh, nhỏ, dung huyết + MT thạch chocolate: khuẩn lạc nhỏ trắng
+ MT thạch MacConkey: khuẩn lạc không mọc
+ Môi trƣờng TSAkhuẩn lạc nhỏ, màu trắng trong, dƣới ánh sáng đèn điện có màu xám xanh
Và quan sát hình thái các mẫu khuẩn lạc kiểm tra, thu thập đƣợc sau khi nuôi cấy (n=5) chúng tôi thấy 80% khuẩn lạc mọc trênMT thạch thƣờng: khuẩn lạc dạng S, nhỏ vàng, và môi trƣờng TSAkhuẩn lạc nhỏ, màu trắng trong, dƣới ánh sáng đèn điện có màu xám xanh. 60% khuẩn lạc mọc trên MT thạch máu: khuẩn lạc mọc manh, nhỏ, dung huyết và không mọc trên môi trƣờng thạch MacConkey.