Vi khuẩn A.pleuropneumoniae có dạng cầu trực khuẩn nhỏ, bắt màu gram âm, kích thƣớc khoảng 0,3-0,5 x 0,6-1,4 µm. Vi khuẩn không di động, không sinh nha bào, có khả năng hình thành giáp mô, tuy nhiên một số chủng không có giáp mô cũng đã đƣợc quan sát thấy. Dƣới kính hiển vi điện tử phát hiện vi khuẩn có nhung mao với kích thƣớc 0,5-2 x 60-450 nm.
Ta tiến hành nhặt mẫu khuẩn lạc và cấy thuần trên đĩa thạch PPLO có bổ sung chất bổ trợ (mPPLO) đặt trong tủ CO2 (5%) trong vòng 24h. Sau đó đem mẫu nhặt khuẩn lạc tiến hành đồng thời tách chiết DNA và thực hiện phản ứng sinh hóa
4.3. Kết quả xác định đặc tính sinh vật, hóa họccủa các chủng A. pleuropneumoniae phân lập đƣợc pleuropneumoniae phân lập đƣợc
Sau khi nhuộm gram chúng tôi tiến hành thử các đặc tính sinh hóa, sinh vật của 3 khuẩn lạc bắt màu gram âm nghi là vi khuẩn A. pleuropneumoniae. Tiến hành các phản ứng sinh hóa đối với chủng vi khuẩn phân lập đƣợc.
Hình 4.3: phản ứng Voges - proskauer (VP)
Hình 4.5: phản ứng thử nghiệm Catalase
Hình 4.7: phản ứng Indol
- Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.2và 4.3
Bảng 4.2: Kết quả xác định một số đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập đƣợc Stt Đặc tính Số chủng thử nghiệm Số chủng (+) Tỷ lệ (%) 1 Indol 3 0 0 2 Oxidase 3 3 100 3 CAMP 3 3 100 4 Urease 3 3 100 5 O.N.P.G 3 3 100 6 Yếu tố V 3 3 100 7 Catalase 3 0 0
Kết qủa ở bảng 4.2 cho thấy 100% số chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae
dƣơng tính với phản ứng urease, oxidase, CAMP, O.N.P.G.
100% các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae cần yếu tố V để phát triển, 100% số chủng vi khuẩnA. pleuropneumoniae âm tính với phản ứng sinh Indol
Bảng 4.3: Kết quả các phản ứng lên men đƣờng của chủng vi khuẩn nghi vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập đƣợc
Stt Đặc tính Số chủng thử nghiệm Số chủng (+) Tỷ lệ (%) 1 Glucose 3 3 100 2 Galactose 3 3 100 3 Fructose 3 3 100 4 Lactose 3 0 0 5 Maltose 3 3 100 6 Arabinose 3 0 0 7 Raffinose 3 0 0 8 Sorbitol 3 0 0
Tổng số 3mẫu vi khuẩn A. pleuropneumoniaesau khi cấy thuần trên thạch PPLO chúng tôi tiến hành thử các phản ứng lên men đƣờng trên môi trƣờng lỏng và môi trƣờng thạch. Kết quả ở bảng 4.3 cho thấy 100% số chủng có khả năng lên men loại đƣờng glucose, galactose, fructose, maltose và 100% số chủng không lên men đƣờng arabinose, lactose, raffinose, sorbitol [2,4,9].
Kết quả giám định 3 mẫu vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập đƣợc cho thấy chúng đều có những đặc tính sinh hóa của vi khuẩn A. pleuropneumoniae phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nƣớc.
4.4. Kết quả chạy phản ứng PCR định danh A. pleuropneumoniae.
Để khẳng định chính xác mẫu khuẩn lạc nghi ngờ là A. pleuropneumoniae
gây bệnh viêm phổi cho lợn, chúng tôi tiến hànhđem 3 mẫu thực hiện tách chiết DNA để chạy phản ứng PCR, kết quả kiểm tra phƣơng pháp điện di cho ta thấy:
Bảng 4.4: Kết quả PCR
Điện di Mẫu
Thời gian: 35 phút No. Mồi Kết quả
Điện thế: 100 V 1 LP-F/R +
2 LP-F/R +
3 LP-F/R +
Hình 4.9: Hình ảnh chạy PCR các khuẩn lạc nghi A. pleuropneumoniae
Ghi chú: Giếng M: 1 kb DNA ladder (NEB)
Giếng 1,2,3: Sản phẩm PCR các mẫu 1,2,3 tƣơng ứng (950 bp) Giếng N: Đối chứng âm
Kết luận:
- Kết quả chạy PCR nhìn vào bảng và hình ảnh ta thấy
+ Cả 3 mẫu khuẩn lạc đều dƣơng tính với gene định danh omlA của vi khuẩn
A. pleuropneumoniae
+ Có 3 mẫu cho kết quả dƣơng tính với vi khuẩnA. pleuropneumoniae. Trùng khớp với kết quả phản ứng sinh hóa ở trên.
4.5. Kết quả xác định triệu chứng, bệnh tích điển hình của lợn mắc bệnh viêm phổi dovi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae gây ra tại Thái Nguyên phổi dovi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae gây ra tại Thái Nguyên
- Sau khi tiến hành phân lập, xác định đặc tính sinh hóa, chạy phản ứng PCR của vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae từ 30 mẫu lợn thu thập đƣợc kết quả có 3 mẫu khuẩn lạc dƣơng tính với vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae.
Chúng tôi quay trở lại điều tra triệu chứng và bệnh tích của 3 mẫu lợn bị viêm phổi do Actinobacillus pleuropneumoniae gây ra.Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 4.5 và 4.6
Bảng 4.5: Kết quả quan sát thu thập triệu chứng của lợn nghi mắc bệnh do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumonie
Biểu hiện Tổng số mẫu (con) Số con có biểu hiện Tỉ lệ (%) Triệu chứng Sốt, sốt nhẹ 3 3 100
Lợn mệt mỏi, bỏ ăn, nôn, tiêu chảy,
giảm trọng lƣợng, gầy. 3 3 100
Ho tự phát, ho ngắn từ 2 đến 3 cái, ho giật giật thể bụng, con vật tỏ ra đau đớn khi ho
3 3 100
Thở khó, thở kiểu chó ngồi, nhịp tim
tăng nhanh 3 3 100
Có nhiều dịch bọt ở mũi miệng, mũi và
chân tai tím dần 3 1 33,33
Từ bảng 4.5 có thể thấy 100 % lợn sốt hoặc sốt nhẹ, lợn có biểu hiện ho tự phát, ho ngắn từ 2 đến 3 cái, ho giật giật thể bụng, con vật tỏ ra đau đớn khi ho. Lợn có biểu hiện mệt mỏi, bỏ ăn, nôn, tiêu chảy, giảm trọng lƣợng, gầy chiếm tỉ lệ 100%. Lợn có hiện tƣợng thở khó, thở kiểu chó ngồi, nhịp tim tăng nhanh chiếm. Đối với
một số trƣờng hợp lợn bị quá cấp thấy có nhiều bọt ở mũi miệng, chân, tai và mũi tím dần chiếm 33,33% .
Bảng 4.6: Kết quả quan sát bệnh tích của lợn nghi mắc bệnh do vi khuẩn
Actinobacillus pleuropneumonie Biểu hiện Tổng số mẫu (con) Số con có biểu hiện Tỉ lệ (%) Bệnh tích
Khí quản chứa đầy chất nhầy, bọt đôi
khi có lẫn máu 3 1 33,33
Phổi sẫm màu không đồng đều, phổi bị
viêm 3 3 100
Có nhiều tơ huyết gắn giữa phổi và
thành ngực, cơ hoành và tim 3 3 100 Bề mặt phổi có tơ huyết và fibrin 3 2 66,67 Từ bảng 4.6: chúng tôi thu đƣợc kết quả 100 % phổi sẫm màu không đồng đều, có hiện tƣợng gan hóa đối xứng hoặc không đối xứng, phổi bị viêm. Hiện tƣợng có nhiều tơ huyết gắn giữa phổi và thành ngực, cơ hoành và tim chiếm tỉ lệ 100 %. Lợn mổ khám thấy khí quản chứa đầy chất nhầy, bọt đôi khi có lẫn máu chiếm tỉ lệ 33,33% trƣờng hợp bệnh tích này ở lợn chết cấp tính. Trên bề mặt phổi có tơ huyết và fibrin chiếm tỉ lệ 66,67%.
Từ kết quả xác định bệnh tích từ lợn mắc viêm phổi dính sƣờn do vi khuẩn A. Pleuropneumoniae chúng tôi thấy khi lợn bị mắc viêm phổi dính sƣờn đều có triệu chứng sốt hoặc sốt nhẹ, lợn bỏ ăn mệt mỏi, lợn ho tự phát, ho ngắn từ 2 đến 3 cái, lợn thở khó thở kiểu chó ngồi, trƣờng hợp cấp tính thì tai mõm và vùng da mỏng tím dần do thiếu oxy, có bọt ở mũi, miệng. Bệnh tích phổi bị gan hóa một phần hoặc toàn phần, phổi bị viêm, bề mặt phổi có tơ huyết và fibrin có nhiều tơ huyết gắn giữa phổi
và thành ngực, cơ tim, cơ hoành. Kết quả của chúng tôi trùng khớp với các kết quả nghiên cứu trƣớc của (Nicolet, 1992) [33] và (Fenwick và Henry, 1994) [15].
Kết quả trên chúng ta có thể xác định phỏng đoán lợn bị mắc viêm phổi dính sƣờn để có biện pháp phòng trị có hiệu quả nhất.
4.6. Kết quả xác định mức độ mẫn cảm với một số kháng sinh của vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập đƣợc pleuropneumoniae phân lập đƣợc
Hiện nay, do sử dụng kháng sinh không đúng hƣớng dẫn trong chăn nuôi và thú y nên xuất hiện ngày càng nhiều loại vi khuẩn kháng thuốc, trong đó có vi khuẩn
A. pleuropneumoniae. Để góp phần vào việc khống chế và điều trị bệnh do vi khuẩn
A. pleuropneumoniae gây ra ở lợn, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra mức độ mẫn cảm với một số kháng sinh của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập đƣợc, giúp cho việc lựa chọn kháng sinh điều trị đƣợc chính xác và có hiệu quả. Kết quả đƣợc trình bày tại bảng 4.7.
Bảng 4.7: Kết quả xác định mức độ mẫn cảm với một số kháng sinh của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập đƣợc
TT Kháng sinh Số chủng VK thử Đánh giá mức độ mẫn cảm Mạnh Trung bình Kháng thuốc d (mm) (+) (%) d (mm) (+) (%) d (mm) (+) (%) 1 Ceftiofur 3 23.5 3 100 - 0 0 - 0 0 2 Amoxicillin 3 21.3 3 100 - 0 0 - 0 0 3 Florfenicol 3 23 2 66,67 21.2 1 33,33 - 0 0 4 Ampicillin 3 - 0 0 20.7 3 100 - 0 0 5 Tetracyclin 3 - 0 0 26.4 2 66,67 22.1 1 33,33 6 Colistin 3 16.6 1 33,33 13.5 2 66,67 - 0 0
Kết quả đƣợc so sánh vớiBảng đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng sinh (NCCLS - 2002) [39]
Qua bảng 4.7 cho thấy: các chủng vi khuẩnA. pleuropneumoniae phân lập đƣợc mẫn cảm nhất với ceftiofur và amoxicillin, chiếm tỷ lệ 100%; tiếp theo là
florfenicol là 66,67%. Một số kháng sinh đang đƣợc sử dụng nhiều có tỷ lệ mẫn cảm ở mức trung bình nhƣ ampicilin là 100%, Colistin, tetracyclin 66,67% và tỉ lệ kháng thuốc của tetracyclin là 33,33%. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến hiện tƣợng kháng kháng sinh của vi khuẩn A. pleuropneumoniae ngày càng gia tăng nhƣ do việc dùng kháng sinh điều trị kéo dài, do kháng sinh đƣợc bổ xung vào thức ăn và do hiện tƣợng di truyền tính kháng thuốc bởi các gen nằm trong plasmid của vi khuẩn A. pleuropneumoniae.
Từ kết quả trên sẽ làm tiền đề để đƣa ra phác đồ thử nghiệm trên thực tiễn để có phác đồ chính xác và hiệu quả nhanh nhất cho ngƣời chăn nuôi nhằm giảm thiểu thiệt hại kinh tế.
4.7. Kết quả thử nghiệm một số phác đồ điều trị lợn nghi mắc viêm phổi dính sƣờn do A. pleuropneumoniae sƣờn do A. pleuropneumoniae
Căn cứ vào kết quả kháng sinh đồ chúng tôi chọn 3 loại kháng sinh có độ mẫn cảm mạnh với các vi khuẩn A. Pleuropneumoniaephân lập đƣợc là ceftiofur, amoxicillin,florfenicol và xây dựng 3 phác đồ điều trị thử nghiệm lợn mắc bệnh tại tỉnh Thái Nguyên.
Các phác đồ điều trị thử nghiệm lợn mắc bệnh nhƣ sau:
+ Phác đồ 1: Điều trị nguyên nhân lợn mắc viêm phổi dùng loại thuốc CEFANEW-LA do công ty cổ phần thuốc thú y Marphavet sản xuất (thành phần ceftiofur: 10g/100 ml), tiêm bắp với liều lƣợng: 1 ml/25 kg thể trọng/ngày, tƣơng ứng là 4 mg ceftiofur/kg thể trọng; thuốc tác dụng kéo dài 72 - 96 giờ.
Điều trị triệu chứng, trợ lực, trợ sức: GLUCO-K-C-NAMIN, tiêm bắp với liều: 1 ml/10 kg thể trọng/ngày.
+Phác đồ 2: Dùng loại thuốc MARPHAMOX-LA do công ty cổ phần thuốc thú y Marphavet sản xuất (thành phần amoxicillin:15g/100 ml), tiêm bắp với liều lƣợng 1 ml/10 kg thể trọng/ngày; tƣơng ứng là 15 mg amoxicillin/kg thể trọng; thuốc tác dụng kéo dài 48 giờ.
Điều trị triệu chứng, trợ lực, trợ sức: GLUCO-K-C-NAMIN, tiêm bắp với liều: 1 ml/10 kg thể trọng/ngày.
+Phác đồ 3: Dùng loại thuốc MARFLO-45% do công ty cổ phần thuốc thú y Marphavet sản xuất (thành phần florfenicol: 45g/100 ml), tiêm bắp với liều lƣợng 1 ml/30 kg thể trọng/ngày, tƣơng ứng là 15 mg florfenicol/kg thể trọng; thuốc tác dụng kéo dài 72 - 96 giờ.
Điều trị triệu chứng, trợ lực, trợ sức: GLUCO-K-C-NAMIN, tiêm bắp với liều: 1 ml/10 kg thể trọng/ngày.
Và căn cứ vào triệu chứng của lợn mắc bệnh viêm phổi dính sƣờn do vi khuẩn
A. pneuropneumoniae gây ra chúng tôi chọn ra lợn bị bệnh để tiến hành thử nghiệm phác đồ điều trị.
Kết quả điều trị thử nghiệm lợn nghi mắc PRRS và mắc viêm phổi đƣợc trình bày tại bảng 4.8
Bảng 4.8: Kết quả điều trị thử nghiệm lợn nghi mắc lợn mắc viêm phổi dính sườn
Phác đồ Loại thuốc Liều lƣợng và cách dùng Số đƣợc điều trị (con) Số ngày điều trị Số khỏi bệnh (con) Tỷ lệ (%) I CEFANEW- LA (ceftiofur: 10g/100ml) 1ml/25kg TT/ngày (4mg ceftiofur/kgTT); tiêm bắp; thuốc tác dụng 72-96 giờ 10 6 9 90,00 Gluco-K-C- Na min 1ml/10kg TT/ngày; tiêm bắp: 1lần/ngày II Marphamox- LA (amoxicillin: 15g/100ml) 1ml/10kg TT/ngày (15mg amoxicillin/kgTT); tiêm bắp; thuốc tác dụng 48 giờ 15 8 13 86,67 Gluco-K-C- Na min 1ml/10kg TT/ngày; tiêm bắp: 1lần/ngày
III MARFLO- 45% (florfenicol: 45g/100ml) 1ml/30kgTT/ngày (15mg florfenicol/kgTT); tiêm bắp; thuốc tác dụng 72 - 96 giờ 13 7 10 76,92 Gluco-K-C- Namin 1ml/10kg TT/ngày; tiêm bắp: 1lần/ngày Tổng hợp 38 0 32 84,21 Ghi chú: TT - Thể trọng
- Qua bảng 4.8 cho thấy điều trị thử nghiệm lợn nghi mắc viêm phổi với 3 loại kháng sinh là ceftiofur, amoxicillin, florfenicol. Ngoài sử dụng các loại kháng sinh điều trị chúng tôi còn bổ sung tiêm thêm Gluco.K.C.Namin để trợ sức trợ lực, giảm sốt, giảm ho, tiêu viêm và tăng cƣờng sức đề kháng cho lợn bệnh.
- Ở phác đồ 1 sử dụng ceftiofur với liều lƣợng 4 mg/kg thể trọng, điều trị 10 con lợn mắc viêm phổi có 9 con khỏi, đạt tỷ lệ là 90,00%.
- Ở phác đồ 2 sử dụng amoxicillin với liều lƣợng 15 mg/kg thể trọng; tiến hành điều trị 15 con lợn mắc viêm phổi, khỏi 13 con, đạt tỷ lệ 86,67%.
- Ở phác đồ 3 sử dụng florfenicol với liều lƣợng 15 mg/kg thể trọng; điều trị tổng số 13 con lợn mắc viêm phổi, khỏi 10 con, đạt tỷ lệ 76,92%.
- Tổng cộng với 3 phác đồ chúng tôi điều trị thử nghiệm 38 con lợn mắc viêm phổi có 32 con khỏi, đạt tỷ lệ trung bình là 84,21%. Trong đó, phác đồ 1 có tỷ lệ khỏi là cao nhất (90,00%), tiếp đến là phác đồ 2 (86,67%) và thấp nhất là phác đồ 3 (76,92%).
- Nhƣ vậy, cả 3 phác đồ điều trị thử nghiệm lợn nghi mắc viêm phổi tại tỉnh Thái Nguyên đều có kết quả tốt, tỷ lệ lợn khỏi bệnh khá cao. Từ kết quả thu đƣợc qua điều trị thử nhiệm, chúng tôi đã khuyến cáo ngƣời chăn nuôi chủ động sử dụng cả ba phác đồ trên để điều trị lợn nghi mắc viêm phổi, đặc biệt là phác đồ 1 (sử dụng kháng sinh ceftiofur).
- Xây dựng thành công 3 phác đồ trên đã tạo điều kiện cho ngƣời chăn nuôi, cán bộ thú y cơ sở chủ động phòng và điều trị bệnh viêm phổi ở lợn, giảm thiểu đƣợc thiệt hại, tăng giá trị sản phẩm chăn nuôi. Từ đó ổn định nguồn cung cấp thực phẩm trong tiêu dùng hàng ngày làm cho giá cả ổn định đồng thời giúp ngành chăn nuôi lợn của tỉnh phát triển bền vững.
CHƢƠNG 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
- Các mẫu A. Pleuropneumoniae phân lập đƣợc đều mang hình thái, đặc tính nuôi cấy, hóa học tƣơng đồng với các tài liệu trong và ngoài nƣớc đã công bố.
- A. pleuropneumoniaephân lập đƣợc là vi khuẩn bắt màu Gram âm, dạng cầu trực khuẩn, kích thƣớc khoảng 0,3-0,5 x 0,6-1,4 pm.Dƣới kính hiển vi điện tử phát hiện vi khuẩn có nhung mao với kích thƣớc 0,5-2 x 60-450 nm.
- 100% Vi khuẩnA. pleuropneumoniae lên men đƣờng glucose, xylose, mannitol, mannose và không lên men đƣờng arabinose, lactose, raffinose, sorbitol. Dƣơng tính với phản ứng urease, oxidase, CAMP, O.N.P.G; âm tính với phản ứng sinh Indol và không mọc trên thạch MacConkey.
- Lợn bị mắc viêm phổi dính sƣờn do vi khuẩn Actinobaccillus pneuropneumoniae có triệu chứng sốt hoặc sốt nhẹ, lơn bỏ ăn mệt mỏi, lợn ho tự phát, ho ngắn từ 2 đến 3 cái, lợn thở khó, thở kiểu chó ngồi, trƣờng hợp cấp tính thì tai mõm và vùng da mỏng tím dần do thiếu oxy, có bọt ở mũi, miệng. Bệnh tích phổi bị gan hóa một phần hoặc toàn phần, phổi bị viêm, bề mặt phổi có tơ huyết và fibrin có nhiều tơ huyết gắn giữa phổi và thành ngực, cơ tim, cơ hoành.
- Vi khuẩnA. pleuropneumoniae phân lập đƣợc mẫn cảm nhất với ceftiofur và amoxicillin.
- Sử dụng kháng sinh Ceftiofur, amoxilin, fofenicol và các thuốc trợ sức trợ lực trong điều trị bệnh viêm phổi dính sƣờn đạt hiệu quả cao.
5.2. Đề nghị
- Tiếp tục tiến hành các phản ứng PCR xác định các gen độc tố và chọn ra đƣợc các chủng vi khuẩnA. pleuropneumoniae mang tính đại diện, điển hình, phù hợp với thực địa để dùng làm giống sản xuất vaccine phòng bệnh viêm phổi cho lợn.
- Áp dụng phác đồ đã thử nghiệmđiều trị lợn nghimắc viêm phổi do vi khuẩn
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Tiêu Quang An, Nguyễn Hữu Nam (2011), “Xác định một số vi khuẩn kế phát gây chết lợn trong vùng dịch lợn Tai xanh ở huyện Văn Lâm tỉnh Hƣng Yên