3.3.3.1. Nguyên liệu
- Động vật thí nghiệm: Lợn nghi mắc bệnh viêm phổi do Actinobacillus pleuropneumoniae.
- Các loại môi trƣờng dùng để nuôi cấy, lƣu giữ vi khuẩn do hãng Oxoid (Anh) và Merck (Pháp) sản xuất: Môi trƣờng thạch thƣờng, thạch máu, thạch MacConkey, thạch Chocolate, BHI broth, BHI agar, TSB ...
- Các loại môi trƣờng, hóa chất dùng để giám định, xác định các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn: Môi trƣờng đƣờng các loại, dung dịch Kovac‟s, dung dịch H2O2
3%, giấy thử Oxidase, nƣớc muối 6,5%, ... - NAD do hãng Oxoid (Anh) sản xuất.
3.3.3.2.Máy móc, dụng cụ thí nghiệm
- Các máy móc, dụng cụ dùng trong phòng thí nghiệm, các hoá chất dùng để sát trùng, tiêu độc, rửa dụng cụ ... nhƣ PCR, RT-PCR; ELISA, ....
- Tủ cấy An toàn sinh học cấp 1 - Tủ ấm CO2
- Bộ KIT tách chiết DNA vi khuẩn gram âm bao gồm: + Proteinase K
+ Buffer CL có thể bị lắng, nếu thấy thì có thể làm tan ở 56oC. + Buffer BL có thể bị lắng, nếu thấy thì có thể làm tan ở 56oC. + Ethanol (96%) + Buffer BW + Buffer TW + Buffer AE - Máy ủ nhiệt - Máy PCR Eppendorf - Máy ly tâm lạnh để bàn - Máy Votex - Máy điện di
- Máy chụp ảnh Gel điện di - Nồi hấp
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.4.1. phƣơng pháp thu thập mẫu
Dựa vào triệu chứng lâm sàng của lợn mắc bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae gây ra.
- Thể quá cấp tính: Lợn mắc bệnh sốt 41,5oC, mệt mỏi, bỏ ăn, có thể nôn mửa và tiêu chảy. Thời gian ngắn trƣớc khi chết, thƣờng có những biểu hiện khó thở dữ dội, thở bằng mồm, lợn ở tƣ thế ngồi thở, nhiệt độ giảm nhanh. Ngay trƣớc khi chết, có chảy nhiều dịch bọt lẫn máu ở miệng và mũi, nhịp tim tăng; phần da ở mũi, tai, chân và sau cùng toàn bộ cơ thể trở nên tím tái (Nicolet, 1992) [33], lợn mắc bệnh thƣờng chết sau 24 - 36 giờ.
- Thể cấp tính: Ở thể này thƣờng có nhiều lợn cùng mắc bệnh trong một chuồng hoặc ở những chuồng khác nhau. Lợn bệnh sốt từ 40,5oC - 41oC, da đỏ, mệt mỏi, nằm không muốn dậy, không muốn uống, bỏ ăn. Các dấu hiệu hô hấp nặng nhƣ khó thở, ho và đôi khi thở bằng miệng rất rõ (Fenwick và Henry, 1994) [15]. Bệnh diễn biến khác nhau ở từng cá thể, phụ thuộc vào mức độ tổn thƣơng ở phổi và thời điểm bắt đầu điều trị. Lợn thƣờng sống sót nếu qua đƣợc 4 ngày đầu của bệnh.
- Thể bán cấp tính: Thể này xuất hiện sau khi các dấu hiệu cấp tính mất đi; lợn bệnh không sốt hoặc sốt nhẹ, xuất hiện ho tự phát, với các cƣờng độ khác nhau, con vật kém ăn, giảm tăng trọng (Nicolet, 1992) [33].
- Thể mãn tính: Lợn mắc bệnh không có biểu hiện rõ ràng trên lâm sàng. Những con vật mắc bệnh thể mãn tính là nhân tố truyền bệnh cho những lợn khác. Những dấu hiệu viêm phổi sẽ biểu hiện rõ hơn nếu có nhiễm trùng kế phát các vi sinh vật đƣờng hô hấp khác (Mycoplasma, Pasteurella, PRRS) hay các nhân tố Stress (MacInnes và Rosendal, 1988) [31].
Chúng tôi thu thập đƣợc 30 mẫu lợn nghi mắc viêm phổi dính sƣờn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae gây ra tại tỉnh Thái Nguyên.
3.4.2. Phƣơng pháp lấy mẫu
Dịch ngoáy mũi, họng: Dùng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào mũi hoặc vùng họng của lợn. Sau đo tăm bông đƣợc để vào hộp lạnh ở 4oC rồi chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 2-8 giờ.
Bệnh phẩm là phổi hoặc hạch amidan: Dùng dao mổ cắt phần bệnh tích viêm phổi và hạch amidan của lợn có triệu chứng đƣợc mổ khám.
Lƣu ý: - động vật dùng để lấy mẫu đều chƣa đƣợc sử dụng thuốc kháng sinh điều trị.
Các mẫu bệnh phẩm đƣợc bảo quản trong túi nylon vô trùng ở nhiệt độ 4ºC và nhanh chóng đƣợc đƣa về phòng thí nghiệm.Sau đó, mẫu bệnh phẩm sẽ đƣợc cấy ria lên thạch PPLO có bổ sung chất bổ trợ đặc biệt (mPPLO), sau đó sẽ đƣợc để trong tủ ấm CO2 (5%) trong 24h.
37oC, CO2 5%, 24h
Nhuộm gram
Tách chiết DNA lên men đƣờng: glucose galactose, fructose, maltose
Sơ đồ 3.1:Phƣơng pháp phân lập A. Pleuropneumoniae
Mẫu Thạch PPLO Khuẩn lạc xanh nhầy Cấy thuần Giám định PCR
Kiểm tra sinh hóa
3.4.4. Phƣơng pháp nhuộm Gram kiểm tra hình thái vi khuẩn
Khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần kiểm tra đƣợc tiến hành phiết lên phiến kính, cố định, rồi nhuộm theo phƣơng pháp nhuộm Gram. Kiểm tra hình thái vi khuẩn dƣới kính hiển vi có độ phóng đại 1000 lần. Vi khuẩnA. pleuropneumoniae: bắt màu Gram âm, màu đỏ tía hoặc đỏ vàng, hình cầu trực khuẩn nhỏ.