TIỂU LUẬN xác ĐỊNH POLYPHENOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP sắc ký LỎNG CAO áp (HLPC HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TIỂU LUẬN XÁC ĐỊNH POLYPHENOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (HLPC - HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY) Bộ môn: Phương pháp phân tích Cơng nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên: MSSV: Lớp: Khoá: PGS.TS Quản Lê Hà Nguyễn Thị Hoài Thương 20190388 Kĩ thuật sinh học 01 64 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com MỤC LỤC MỤC LỤC Chương 1: TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 1.Giới thiệu polyphenol 2.Tác dụng polyphenol 3.Tác dụng không mong muốn polyphenol 4.Lý chọn đề tài 5.Các phương pháp xác định polyphenol 6.Giới thiệu chung phương pháp sắc ký 6.1 lịch sử phương pháp sắc ký 6.2 Nguyên lý phương pháp sắc ký 6.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1.Điều kiện chạy máy HPLC 2.Phương pháp thực nghiệm 2.1 Thu nhập chuẩn bị mẫu 2.2 Chuẩn bị dung dịch tiêu chuẩn Kết Tổng kết TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ĐỀ TÀI TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Giới thiệu polyphenol 1.1 Polyphenol gì? Ở thực vật có chế giúp bảo vệ thực vật chống lại phá hoại tia cực tím xâm nhập mầm bệnh sản sinh polyphenol thực chức người bảo vệ tái tạo cấu trúc tế bào Các hợp chất polyphenol sản phẩm tự nhiên "có cấu trúc polyphenol (tức là, số nhóm hydroxyl vịng thơm )" bao gồm bốn nhóm Flavonoid: chiếm khoảng 60% tất polyphenol, bao gồm: kaempferol,quercetin, catechin anthocyanin Axit phenolic: chiếm khoảng 30% polyphenol, như: stilben, lignans Polyphenolic amid: bao gồm hoạt chất avenanthramides yến mạch capsaicinoids ớt Các polyphenol khác: bao gồm axit ellagic mọng, lignans hạt lanh, hạt vừng, resveratrol rượu vang đỏ, chất curcumin củ nghệ Các polyphenol coi dưỡng chất đóng vai trị quan trọng sức khỏe người Polyphenol thường phân tử lớn ( đại phân tử ) Giới hạn trọng lượng phân tử chúng khoảng 800 dalton , cho phép khả khuếch tán nhanh chóng qua màng tế bào để chúng đến vị trí hoạt động nội bào dạng sắc tố sau tế bào hình thành Tác dụng polyphenol Gần đây, người ta quan tâm nhiều đến hợp chất polyphenol chúng hoạt động chất chống oxy hóa giúp vơ hiệu hóa gốc tự có hại gây hại cho tế bào ngăn ngừa tình trạng oxidative stress Oxidative stress liên quan đến số bệnh tiểu đường bệnh tim số loại ung thư Polyphenol mang lại số lợi ích sức khỏe: Giảm lượng đường máu Giảm nguy mắc bệnh tim Ngăn ngừa hình thành cục máu đơng Đặc tính chống ung thư Cải thiện hệ tiêu hóa Tăng cường chức não Một số polyphenol thường sử dụng làm thuốc nhuộm Ví dụ, tiểu lục địa Ấn Độ , vỏ lựu, có nhiều tannin polyphenol khác, nước ép nó, sử dụng nhuộm vải phi tổng hợp Polyphenol, đặc biệt tannin, sử dụng truyền thống cho da thuộc da ngày tiền chất hóa học xanh, đặc biệt sản xuất nhựa nhựa cách polyme hóa khơng sử dụng formaldehyde chất kết dính cho hạt Mục tiêu nói chung sử dụng dư lượng thực vật từ nho, ô liu (gọi pomaces ) vỏ hồ đào cịn sót lại sau chế biến Tác dụng không mong muốn polyphenol TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Mặc dù polyphenol thiếu sức khỏe, bên cạnh tác dụng tiêu thụ mức hợp chất có khả gây tác dụng khơng mong muốn Các nghiên cứu động vật cho thấy việc bổ sung polyphenol liều cao gây tổn thương thận, gây phát triển khối u gây cân nồng độ hormone tuyến giáp Ở người, việc sử dụng polyphenol nhiều dẫn đến tăng nguy gây đột quỵ tử vong sớm Ngoài ra, bạn cần lưu ý số loại thực phẩm giàu polyphenol tương tác với hấp thu chất dinh dưỡng tương tác với thuốc Chẳng hạn polyphenol giảm khả hấp thụ sắt, thiamine folate thể Không vậy, bạn tiêu thụ số lượng lớn số loại thực phẩm giàu polyphenol đậu Hà Lan gây triệu chứng tiêu hóa khó chịu như: đầy hơi, khó tiêu Lý chọn đề tài Sự diện hợp chất phenolic khác làm cho nho trở thành nguồn chất chống oxy hóa quan trọng Hoạt động chống oxy hóa polyphenol chế độ ăn uống coi lớn vitamin hàm lượng polyphenol nho phản ánh chất có lợi cho sức khỏe Giống nho (Vitis viniferaL.) loại trái có hàm lượng hợp chất phenol cao Các hợp chất phenolic rượu vang sản phẩm phụ rượu vang thu hút nhiều quan tâm tính chất chống oxy hóa kháng khuẩn tác dụng có lợi cho sức khỏe người chúng Nhiều công nhân báo cáo tầm quan trọng hợp chất phenolic chất bảo vệ sức khỏe người theo cách khác Rượu đồ uống tiêu thụ nhiều giới Mức tiêu thụ tăng lên đáng kể nhận thức đặc tính tăng cường sức khỏe loại rượu vang truyền đạt hợp chất polyphenol khác flavonoid, anthocyanins, tannin, v.v Các hợp chất phenol thành phần quan trọng rượu vang định chất lượng rượu ảnh hưởng trực tiếp đến cảm quan chúng đặc tính rượu vang màu sắc, hương vị, vị đắng, làm se hương thơm Chất lượng nho làm rượu vang yếu tố góp phần vào chất lượng cuối rượu vang Để chọn giống nho sản xuất rượu vang, không cần trọng đến suất kinh tế, khả chống chịu sâu bệnh, thu hồi nước trái cây, hàm lượng đường axit mà phải trọng đến đặc tính chức anthocyanins, phenolics, tannin, v.v Không hàm lượng tổng số anthocyanins, phenol tannin, thành phần chúng có vai trò quan trọng việc định chất lượng rượu Vì điều kiện trồng nho có vai trị định hàm lượng phenol nho, nên điều tra thực để xác định hàm lượng phenol nho làm rượu Nó dẫn đến việc định lượng thành phần phenolic giai đoạn thu hoạch thiết lập sở để phân biệt giống nho làm rượu dựa thành phần phenolic độ chín phenolic nho Các phương pháp xác định polyphenol Việc lựa chọn phương pháp phù hợp hiệu để tách lớn hợp chất phenolic có hoạt tính sinh học từ mô thực vật vấn đề quan trọng cộng đồng khoa học Các phương pháp tách truyền thống cho polyphenol chiết lỏng-lỏng, sắc ký lớp mỏng(thin layer chromatography – TLC), sắc ký lỏng hiệu cao(HPLC) Giới thiệu chung phương pháp sắc ký TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 6.1 Lịch sử phương pháp sắc ký: Nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet) phát minh kĩ thuật sắc ký vào năm 1903 ông nghiên cứu chlorophyl Năm 1952 Archer John Porter Martin Richard Laurence Millington Synge trao giải Nobel Hoá học cho phát minh họ sắc ký phân bố Kĩ thuật sắc ký phát triển nhanh chóng suốt kỉ 20 Các nhà nghiên cứu nhận thấy nguyên tắc tảng sắc ký Tsvet áp dụng theo nhiều cách khác nhau, từ xuất nhiều loại sắc ký khác Đồng thời, kĩ thuật thực sắc ký tiến liên tục, cho phép phân tích phân tử tương tự 6.2 Nguyên lí phương pháp sắc ký: Sắc ký phương pháp vật lý để phân tách, phân li, phân ích chất dựa phân bố khác chúng hai pha động pha tĩnh Có nhiều nguyên nhân đưa đến phân bố khác chất, lặp lặp lại tượng hấp phụ - phản hấp phụ chất dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh nguyên nhân chủ yếu việc tách sắc ký Hầu hết phương pháp sắc ký dựa nguyên tắc trên, hiệu phương pháp phụ thuộc vào lựa chọn pha động pha Pha động Phân tách chất Pha tĩnh Mẫu Sơ đồ Nguyên lí phương pháp sắc kí tĩnh 6.3 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) Năm 1967, giáo sư Csaba Horváth tác giả tạo máy HPLC để nghiên cứu nucleotide Phương pháp có ưu điểm áp suất cao, độ phân giải cao, vận tốc sắc ký nhanh, HPLC áp dụng nhiều lĩnh vực nghiên cứu đa dạng phân tích dược phẩm, dung dịch sinh lý, polymer thiên nhiên tổng hợp, loại dư lượng môi trường, hợp chất vô cơ,… Phương pháp HPLC không làm hư hại mẫu phân tích nên có tỉ lệ thu hồi mẫu cao, thường từ 90-100%, mẫu thu hồi thực loại nghiên cứu khác phân tích phổ, thử nghiệm hoạt tính sinh học TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Pha động Hệ thống chuyển dung môi Hệ thống bơm mẫu Chuẩn bị mẫu Cột sắc ký Detector Hệ thống xử lý liệu Sơ đồ Nguyên lí phương pháp Sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) HPLC dựa vào pha động (dạng lỏng) để phân tách thành phần trộn lẫn vào Những thành phần hoà tan vào dung mơi sau tác dụng áp suất cao, chúng bị lôi kéo di chuyển qua cột sắc ký Trong cột, hỗn hợp phân tác thành cấu tử Sự tương tác chất tan với pha động pha tĩnh phụ thuộc chọn lựa khác dung môi, pha tĩnh HPLC cho kết thu nhiều cấu tử khác nhay mà kỹ thuật sắc ký khác không thực dễ dàng phân tách số lượng lớn chất hoá học trộn lẫn vào CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Điều kiện chạy máy HPLC Dụng cụ Cột Pha động Tốc độ ch Nhiệt độ c Detector Thời gian TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Phương pháp thực nghiệm 2.1.Thu thập chuẩn bị mẫu Từ giống, kg mẫu mọng thu thập ngẫu nhiên từ phần trên, chùm từ nho xác định khác từ lần nhân rộng Các chùm thu hoạch độ chín kỹ thuật đạt tổng chất rắn hòa tan (TSS) khoảng 22–24 độ C Các mẫu mọng thu thập được đóng gói túi polythene cấp thực phẩm bảo quản - 20 -C để nghiên cứu thêm Các mọng làm sau đồng Để chiết hợp chất phenolic, g mẫu đồng hút vào ống polypropylene 15 ml chứa ml axit formic 0,1% metanol 20% Hỗn hợp quay xoáy phút sau ly tâm tốc độ 5000 vịng / phút phút Một ml phần phía chuyển vào ống siêu nhỏ lại ly tâm tốc độ 10.000 vòng / phút 4C 10 phút Phần phía lọc qua màng lọc 0,2μm dịch lọc sử dụng để phân tích gam mẫu 5ml axit fomic 0,1% metanol 20% Quay xốy vịng phút Li tâm hỗn hợp tốc độ 5000 vòng/phút, nhiệt độ phòng Ly tâm dịch tốc độ 10 000 vòng/phút, 4°C 10 phút Lọc dịch lên qua màng lọc 0,2μm 2.2 Chuẩn bị dung dịch tiêu chuẩn Các chất chuẩn đối chiếu chứng nhận riêng lẻ tất hợp chất thử nghiệm mua từ Sigma- Aldrich với độ tinh khiết 90% Metanol (loại HPLC) cung cấp Sigma-Aldrich, thuốc thử khác lấy từ Thomas Baker Dung dịch gốc chuẩn hợp chất phenol chuẩn bị cách hòa tan 10 mg chất phân tích riêng lẻ 10 ml metanol bảo quản - 20 °C Dung dịch làm việc trung gian 10 mg / L chuẩn bị cách trộn thể tích thích hợp dung dịch gốc metanol Kết Bảng 1: Các hợp chất phenolic từ giống nho làm rượu vang đỏ TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Bảng 2Các hợp chất phenolic từ giống nho làm rượu vang trắng TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Hình 1: Sắc ký đồ phenol chuẩn mức độ tập trung 100lg/ml((1: Axit gallic; 2: Axit chlogenic; 3: Axit caftaric; 4: Axit vanilic; 5: Catechin; 6: Epicatechin; 7: Quercetin; 8: Kampherol 9: Resveratro) TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Hình 2: Hình 2Sắc ký đồ phenol mẫu (Cabernet Sauvignon) (1: Axit gallic; 2: Axit chlogenic; 3: Axit caftaric; 4: Axit vani; 5: Catechin; Epicatechin; Nhận xét: Trong số hợp chất flavonoid, axit gallic hợp chất tìm thấy nho làm rượu vang đỏ, dao động từ 1,846 mg / kg Petit Verdot đến 0,635 mg / kg giống Caladoc (Bảng1) Các giống rượu vang trắng cho thấy nồng độ axit gallic thấp so với giống rượu vang đỏ, dao động từ 0,780 mg / kg giống Gros Meseng đến 0,537 mg / kg giống Vermentino Gros Meseng chứa nồng độ catechin cao (10,304 mg / kg) nồng độ catechin thấp ghi nhận Vermentino Flavan-3-ol tìm thấy hạt nho Hàm lượng flavan-3-ol hạt cao mọng Điều tổng số hạt nho đóng vai trị quan trọng tổng hàm lượng catechin epicatechin toàn nho Trong giống nho làm rượu nghiên cứu, piceatannol nằm khoảng từ 16,86 mg / kg Caladoc đến 0,52 mg / kg Niellucio Các loại mọng màu đỏ chứa tỷ lệ piceatannol cao so với nho làm rượu vang trắng Trong giống rượu vang trắng, nồng độ dao động từ 0,61 mg / kg Muscat White đến mức thấp Colombard (0,15 mg / kg) Taware cộng ( 2010) báo cáo tích tụ piceatannol tăng lên giai đoạn sau nhiễm bệnh Do đó, thay đổi nồng độ piceatannol khả phát triển hệ thống miễn dịch nho chống lại mầm bệnh (Hình1và2) Tổng kết Để phân biệt giống nho làm rượu dựa hàm lượng phenolic chúng, Sự khác biệt giống rượu vang cách sử dụng phân tích thống kê sử dụng để lựa chọn loại nho làm rượu thích hợp cho việc chuẩn bị loại rượu vang có chất lượng cụ thể Trong nghiên cứu này, phân tích thành phần cho phép tách loại rượu theo hàm lượng polyphenol Hiệu suất đa dạng nhóm khác hợp chất phenolic có sẵn Dựa hợp chất phenolic cấu trúc chúng, giống nho làm rượu vang phân biệt Trên sở liệu thu từ nghiên cứu tại, kết luận đặc tính giống chịu trách nhiệm cho biểu hợp chất phenolic nho Các 10 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com biểu thức ghi lại dạng biến thể phenolic Thơng tin tạo hữu ích cho việc tối ưu hóa quy trình làm rượu để tạo rượu chất lượng từ điều kiện khí hậu nhiệt đới TÀI LIỆU THAM KHẢO https://123docz.net/document/193216-flavonoids-la-polyphenols.htm https://tailieumienphi.vn/doc/nho-chong-lai-hoi-chung-chuyen-hoa-ffm6tq.html https://sci-hub.se/10.1016/j.foodchem.2015.06.101 https://sci-hub.se/10.1016/s0021-9673(99)01225-x https://sci-hub.se/10.1016/j.chroma.2003.08.034 https://sci-hub.se/10.1007/s13197-018-3438-x https://vi.wikipedia.org/wiki/S%E1%BA%AFc_k%C3%BD_l%E1%BB%8Fng_hi%E1%BB%87u_n %C4%83ng_cao https://nhathuocngocanh.com/phuong-phap-sac-ky-long-hieu-nang-cao-hplc/ https://hellobacsi.com/an-uong-lanh-manh/thong-tin-dinh-duong/tac-dung-cua-polyphenol/ https://en.wikipedia.org/wiki/Polyphenol 11 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com ... lịch sử phương pháp sắc ký 6.2 Nguyên lý phương pháp sắc ký 6.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1.Điều kiện chạy máy HPLC 2 .Phương pháp thực nghiệm 2.1 Thu nhập... thiệu polyphenol 2.Tác dụng polyphenol 3.Tác dụng không mong muốn polyphenol 4.Lý chọn đề tài 5.Các phương pháp xác định polyphenol 6.Giới thiệu chung phương pháp sắc ký 6.1 lịch sử phương pháp sắc. .. tách sắc ký Hầu hết phương pháp sắc ký dựa nguyên tắc trên, hiệu phương pháp phụ thuộc vào lựa chọn pha động pha Pha động Phân tách chất Pha tĩnh Mẫu Sơ đồ Nguyên lí phương pháp sắc kí tĩnh 6.3 Phương