Tài liệu Giáo trình sinh học thực vật potx

Khả năng kiến lập và duy trì các cơ quan và các mô thực vật phôi, đỉnh sinh trưởng, rễ, hoa tế bào, callus, tế bào trần trong nhân giống vô trùng để tái sinh những cây mới từ chúng là kế

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT

MỤC LỤC

MỤC LỤC - 1 -

PHẦN I NHÂN GIỐNG IN VITRO - 3 -

MỞ ĐẦU - 3 -

CHƯƠNG I NHỮNG NGUYÊN TẮC CỦA NUÔI CẤY MÔ - 5 -

TRONG CÔNG TÁC VI NHÂN GIỐNG - 5 -

I GIỚI THIỆU CHUNG - 5 -

II TÁI SINH CÂY CON TRONG NUÔI CẤY MÔ - 6 -

1 Nhân giống từ hạt trong điều kiện vô trùng .- 6 -

2 Nuôi cấy phôi - 6 -

3 Nuôi cấy tế bào trứng - 6 -

III NHÂN GIỐNG CÂY CON BẰNG BIỆN PHÁP NUÔI CẤY MÔ - 7 -

1.Giai đoạn I Kiến lập và ổn định mẫu cấy .- 7 -

2.Giai đoạn 2: nhân giống - 9 -

3.Giai đoạn 3: hình thành rễ .- 9 -

4.Giai đoạn 4 Làm cho các cây tái sinh thích nghi khí hậu - 10 -

IV SƠ LƯỢC LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT.- 11 - CHƯƠNG II PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT - 15 - I BẢO ĐẢM ĐIỀU KIỆN VÔ TRÙNG - 15 -

1 Ý nghĩa cuả vô trùng trong nuôi cấy mô thực vật .- 15 -

2 Nguồn nhiễm tạp .- 15 -

3 Vô trùng dụng cu ïthủy tinh, nút đậy và môi trường .- 15 -

4 Vô trùng mô cấy .- 16 -

5 Vô trùng nơi thao tác cấy và tủ cấy vô trùng .- 17 -

II CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG - 17 -

1 Đường .- 18 -

2 Các muối khoáng đa lượng .- 18 -

3 Các muối khoáng vi lượng .- 19 -

4.Các vitamin - 19 -

5 Các chất kích thích sinh trưởng (phytohormone) .- 20 -

6 Các chất hữu cơ khác .- 21 -

7 Chuẩn bị các dung dịch đậm đặc và dung dịch làm việc .- 21 -

8 Vấn đề lựa chọn môi trường - 23 -

III CHỌN VÀ XỬ LÝ MÔ CẤY .- 23 -

IV PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT .- 24 -

1.Cách bố trí phòng thí nghiệm nuôi cấy mô .- 24 -

2 Các thiết bị chủ yếu của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật .- 24 -

CHƯƠNg III CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ - 26 -

I NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG - 26 -

1/ Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây khoai tây - 27 -

2/ Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây địa lan - 29 -

II NHÂN GIỐNG BẰNG CON ĐƯỜNG PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH - 32 -

III NHÂN GIỐNG BẰNG CÁCH TẠO MÔ SẸO (CALLUS) .- 34 -

IV NHÂN GIỐNG BẰNG NUÔI CẤY LÁT MỎNG - 36 -

V ỨNG DỤNG KỸ THUẬT VI GHÉP TRONG NHÂN GIỐNG .- 38 -

VI NUÔI CẤY TÚI PHẤN - 41 -

1.Chọn vật liệu khởi nguyên - 41 -

2.Tạo các tổ hợp gen mới bằng phương pháp lai hữu tính .- 41 -

3.Nuôi cấy túi phấn cây lai .- 42 -

VII NUÔI CẤY VÀ DUNG HỢP PROTOPLAST Ở THỰC VẬT - 45 -

1 Tách và nuôi cấy protoplast thực vật .- 46 -

2 Dung hợp protoplast - 48 -

VIII CHUYỂN GEN THỰC VẬT - 51 -

1 Agrobacterium .- 51 -

2 Chuyển gen nhờ Agrobacterium - 52 -

PHẦN II NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH TRONG VƯỜM ƯƠM - 54 -

CHƯƠNG I YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG CỦA NHÂN GIỐNG - 54 -

I CÁC YẾU TỐ CƠ BẢN VỀ VI KHÍ HẬU CỦA MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG .- 54 -

1.Aùnh sáng - 54 -

2 Nước và độ ẩm - 55 -

3 Nhiệt độ .- 55 -

4 Khí và trao đổi khí .- 55 -

5 Dinh dưỡng khoáng - 55 -

II KHAY, CHẬU TRỒNG CÂY - 56 -

1.Khay phẳng đáy - 56 -

2 Chậu đất nung - 56 -

3 Chậu plastic .- 56 -

4 Chậu sợi .- 56 -

5 Chậu giấy - 57 -

6 Túi polyethylene - 57 -

7 Khay trồng bằng gỗ .- 57 -

III QUẢN LÝ CÁC YẾU TỐ THỔ NHƯỠNG TRONG NHÂN GIỐNG VÀ SẢN XUẤT CÂY GIỐNG - 57 -

CHƯƠNG II KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG MỘT SỐ CÂY PHỔ BIẾN .- 63 -

I KÍCH THÍCH TẠO RỄ .- 63 -

II SỬ DỤNG PHYTOHORMONE KÍCH THÍCH CÀNH CHIẾT RA RỄ .- 64 -

III NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG TỪ RỄ .- 65 -

IV NHÂN GIỐNG TỪ VẢY CỦ - 69 -

V NHÂN GIỐNG TỪ LÁ - 70 -

VI NHÂN GIỐNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CÀNH - 72 -

VII NHÂN GIỐNG CÂY ĐỖ QUYÊN .- 73 -

VIII GHÉP CÀNH - 74 -

PHẦN I NHÂN GIỐNG IN VITRO

MỞ ĐẦU

Giống là một khâu rất quan trọng trong sản xuất nông nghiệp Công tác giống chủ yếu bao gồm các khâu thu thập nguồn gen, bảo quản quỹ gen, lai tạo, tuyển chọn, thử nghiệm giống và nhân giống

Nhờ phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nên ngày nay phần lớn các công việc này được thực hiện một cách khá thuận lợi và nhanh chóng

Sự hình thành và phát triển của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết quả của những phát hiện sau đây trong lĩnh vực sinh lý thực vật và di truyền học phân tử:

1 Tính toàn thể (potipotency) của mô và tế bào thực vật cho phép tái sinh được cây hoàn chỉnh từ mô, thậm chí từ một tế bào nuôi tách rời;

2 Khả năng tạo các cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn, từ đó tạo các dòng đồng hợp tử tuyệt đối và nhờ đó rút ngắn được chu trình lai tạo;

3 Khả năng hấp thu ADN ngoại lai vào tế bào thực vật và khả năng chuyển gen để gây biến đổi (transformation) ở thực vật do ADN ngoại lai nhờ công nghệ gen (genetic engineering);

4 Khả năng nuôi cấy các tế bào thực vật như nuôi cấy vi sinh vật dẫn đến khả năng ứng dụng di truyền phân tử vào thực vật bậc cao để phục vụ cho công tác tạo giống;

5 Kỹ thuật nuôi cấy protoplast và khả năng dung hợp protoplast, tái sinh cây hoàn chỉnh từ protoplast lai (cybrid);

6 Khả năng loại trừ virus bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tạo các dòng vô tính sạch bệnh ở các cây nhân giống vô tính;

7 Khả năng dùng chồi nách, các thể chồi protocorm vào nhân giống vô tính với tốc độ cực nhanh một số cây trồng;

8 Khả năng sử dụng phương pháp nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất thụ khi lai xa;

9 Khả năng bảo quản các nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm;

10 Khả năng tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài và ở nhiệt độ thấp mà không mất tính toàn thể của tế bào

Nuôi cấy mô tế bào thực vật không chỉ góp phần giải quyết một cách có hiệu quả công tác giống cây trồng mà còn mở ra một chân trời mới trong nghiên cứu di

truyền thực vật, các cơ chế sinh tổng hợp ở thực vật, sinh lý phát triển, vai trò của phytohormone trong đời sống thực vật và nhiều vấn đề sinh học cơ bản khác Nuôi cấy mô tế bào thực vật còn là công cụ để thu nhận các chất có hoạt tính sinh học (alcaloid, steroid ) qua nuôi cấy mô tế bào cây thuốc ở quy mô lớn

CHƯƠNG I NHỮNG NGUYÊN TẮC CỦA NUÔI CẤY MÔ

TRONG CÔNG TÁC VI NHÂN GIỐNG

I GIỚI THIỆU CHUNG

Khả năng kiến lập và duy trì các cơ quan và các mô thực vật (phôi, đỉnh sinh trưởng, rễ, hoa tế bào, callus, tế bào trần) trong nhân giống vô trùng để tái sinh những cây mới từ chúng là kết quả của những nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu ứng dụng trong các phòng thí nghiệm thực vật học, bệnh học và di truyền học từ cuối

thế kỷ 19 Công việc này được gọi chung là nuôi cấy mô và cơ quan, nuôi cấy trong

ống nghiệm, vi nhân giống và thuật ngữ mới nhất là công nghệ sinh học

Các quy trình chính của công nghệ sinh học bao gồm tái sinh chồi, tái sinh

cây con, tạo callus và tạo phôi vô tính

Vi nhân giống khác với phương pháp nhân giống truyền thống ở chỗ quá trình được chia thành nhiều giai đoạn để có thể kiểm mỗi khía cạnh của quá trình tái sinh và phát triển cây con Mỗi bước của trật tự công việc có thể được thao tác (hoặc lập chương trình) bằng cách chọn mẫu cấy và kiểm tra môi trường nhân giống Nhìn sâu vào các cơ chế sinh học của mỗi quá trình vi nhân giống sẽ có thể tìm thấy khả năng ứng dụng nó trong phương pháp nhân giốngcây con phục vụ sản xuất đại trà

Trong chương này sẽ mô tả các công việc đã nêu và xác định các cơ sở hình thái, sinh lý và di truyền của quá trình sinh trưởng và phát triển của cây trong nuôi cấy mô

Trước hết hãy cùng nhau nắm vững ý nghĩa của một số thuật ngữ quan trọng

• Nuôi cấy mô Thuật ngữ này dùng cho một trật tự các thao tác dùng để

duy trì và sinh trưởng của các mô thực vật (tạo callus, tế bào, tế bào trần), của các

cơ quan trong nuôi cấy vô trùng Kỹ thuật này dùng để nhân giống, cải biến genotype (tức tạo giống mới), sản xuất sinh khối chứa các sản phẩm hóa sinh học, nghiên cứu bệnh học thực vật, bảo quản phôi và các nghiên cứu khoa học Tất cả

các thao tác này đều được gọi chung là công nghệ sinh học

• Vi nhân giống Thuật ngữ dùng để ám chỉ công việc nhân giống thực vật

trong ống nghiệm Có 4 giai đoạn phát triển đặc trưng của công việc này là kiến lập, nhân chồi, tạo rễ và làm cho cây con tái sinh thích nghi với khí hậu

• Mẫu cấy Đó là mẫu thực vật dùng để nhân giống Mẫu cấy có thể là đoạn

cành cắt, lát mỏng, chồi hoặc hạt

• Tạo phôi vô tính Sự hình thành phôi từ các tế bào sinh dưỡng chứ không

phải từ hợp tử sau khi thụ phấn

• Callus Sự hình thành các tế bào không phân hóa (thường là từ các tế bào

nhu mô)

II TÁI SINH CÂY CON TRONG NUÔI CẤY MÔ

Phương pháp nhân giống trong ống nghiệm có thể được sử dụng có hiệu quả trong hàng loạt kiểu thao tác cho nẩy mầm và tái sinh cây con nếu có biện pháp bảo vệ để tránh sự nhiễm tạp và khi những trở ngại mang tính di trưyền của mẫu cấy được khắc phục

1 Nhân giống từ hạt trong điều kiện vô trùng

Thành công của phương pháp nhân giống từ hạt đạt được đối với hạt hoa lan Hạt hoa lan rất bé, không chứa chất dinh dưỡng dự trữ và nói chung phụ thuộc vào quan hệ cộng sinh với một số loại nấm đặc hiệu để tiếp nhận chất dinh dưỡng Người ta đã tính được khoảng 30.000 hạt trong một quả Catleya Năm 1922 Levis Knudson thông báo kết quả nuôi cấy thành công hoa lan trong môi trường nuôi cấy không cộng sinh có cung cấp muối khoáng và đường saccharose Cơ sở của sự thành công này là sự phát hiện rằng calcium hypochloride có thể được sử dụng để khử trùng bề mặt mà không gây độc cho phôi đang nẩy mầm Quy trình này đã rút ngắn đáng kể thời gian nhân giống Hiện nay nó vẫn được sử dụng để cho nẩy mầm các hạt lai

2 Nuôi cấy phôi

Nuôi cấy phôi bao gồm tách phôi từ hạt và cho nó nẩy mầm trong môi trường vô trùng Công dụng chủ yếu của kỹ thuật này là “cứu” các phôi không thể nẩy mầm bên trong hạt trước khi quả chín Rất nhiều cây lai giữa các loài bước đầu được nhân giống bằng phương pháp này rất có kết quả nhưng đôi khi phôi bị hỏng

trong quá trình phát triển (hiện tượng bất thụ của phôi vô tính) Những dòng chín

sớm của nhiều loại cây ăn quả có xu hướng cho quả chín trước khi phôi của chúng phát triển đầy đủ Trong điều kiện tự nhiên những phôi này dễ bị hỏng nhưng nếu tách chúng và nuôi chúng trong môi trường nuôi cấy thích hợp thì có thể làm cho chúng nẩy mầm

Ứng dụng thứ hai của nuôi cấy phôi là kích thích nẩy mầm những hạt chín đang ngủ để rút ngắn chu trình nhân giống

3 Nuôi cấy tế bào trứng

Hệ thống này bao gồm nuôi cấy vô trùng trứng tách rời, noãn (đã thụ phấn hoặc chưa thụ phấn), và thực giá noãn gắn bên trong tế bào trứng Mặc dù kỹ thuật này đã được sử dụng lần đầu tiên để nghiên cứu các vấn đề về cây ăn quả và sự phát triển của hạt, quy trình thích hợp đã được sử dụng trong nhân giống, đặc biệt là trong việc làm hoàn thiện bộ gen

Tế bào trứng chưa thụ tinh được tách và cấy trong môi trường dinh dưỡng cùng với phấn hoa và sau đó cho thụ phấn trong ống nghiệm Quy trình này đã được sử dụng rất có hiệu quả đối với những cây có nhiều loại tế bào trứng Phấn hoa có thể đặt trực tiếp vào thực giá noãn để ống phấn có thể phát triển trực tiếp vào tế bào trứng

Tế bào trứng nuôi cấy rất có hiệu quả trong việc cứu phôi khi còn rất non nếu như chúng chưa bị tách khỏi cây mẹ Đây là kỹ thuật đơn giản hơn nhiều so với nuôi cấy phôi Các tế bào trứng có thể được khử trùng dễ dàng hơn và nói chung có thể sinh trưởng dễ dàng trong môi trường cơ bản có chứa muối khoáng, đường và đôi khi cần thêm một số phytohormone

Kỹ thuật nuôi tế bào trứng ít phổ biến và có nhu cầu dinh dưỡng khoáng thay đổi Đối với đa số các loài môi trường cơ bản về muối khoáng vô cơ và đường là quan trọng, nhưng auxin có thể cần được sử dụng để kích thích sinh trưởng

III NHÂN GIỐNG CÂY CON BẰNG BIỆN PHÁP NUÔI CẤY MÔ

Vi nhân giống phần lớn cây trồng bao gồm 4 giai đoạn chủ yếu được thực hiện trên các môi trường khác nhau và chịu các biện pháp kiểm tra khác nhau:

- Giai đoạn I: Kiến lập, tức tạo các điều kiện cần thiết để tái sinh cây con từ mẫu cấy;

- Giai đoạn II: Nhân cây giống

- Giai đoạn III: Tạo rễ;

- Giai đoạn IV: Làm cho các cây tái sinh thích nghi khí hậu

1.Giai đoạn I Kiến lập và ổn định mẫu cấy

Mục tiêu của giai đoạn I là đặt thành công mẫu cấy vào môi trường vô trùng bằng cách tránh bị nhiễm tạp và chuẩn bị đầy đủ môi trường trong ống nghiệm để tái sinh được cây con một cách ổn định Giai đoạn này bao gồm các nội dung sau:

1/ Chọn mẫu cấy Sự lựa chọn và duy trì nguồn thực vật là yếu tố quan trọng

đảm bảo sự thành công của vi nhân giống Có 3 khía cạnh đòi hỏi phải đặc biệt quan tâm:

a/ Đặc điểm di truyền và phát sinh cá thể của nguồn thực vật dùng để nhân giống

b/ Kiểm tra nguồn gây bệnh

c/ Điều kiện sinh lý của cây cho phép sử dụng nó trong nhân giống

Trước hết, xác định đúng đặc điểm di truyền là rất quan trọng bởi vì sự nhầm lẫn ở giai đoạn này có thể làm nẩy sinh những vấn đề phức tạp và gây nên sự thiệt hại đáng kể về kinh tế trước khi tìm được con đường chuyển sang các giai đoạn tiếp theo Trong số các loài và giống cây trồng khác nhau có sự biến động đáng kể về khả năng tái sinh cây con trong các điều kiện nhân giống khác nhau Cần phải thực hiện sự nghiên cứu một cách có hệ thống để có được những kiến thức và kinh nghiệm cần thiết đối với từng loại cây Cần phải dành thời gian để xác định nhu cầu của những giống cây chưa quen thuộc, mặc dù, nói chung, có thể tìm được thông tin về những giống cây đó trong các tài liệu đã xuất bản

Nói chung, những thực vật dễ nhân giống bằng các biện pháp thông thường thì cũng đễ thực hiện vi nhân giống Ví dụ các loại thảo mộc vừa dễ nhân giống thông thường vừa dễ thực hiện vi nhân giống Trong khi đó các loại cây gỗ thì khó

tái sinh hơn nhiều và đễ nhân giống chúng cần phải tìm được các phương pháp thích hợp

Thành công trong vi nhân giống các loài cây gỗ rất phụ thuộc vào đặc điểm của cây non dùng để nhân giống Vi nhân giống cây con mọc từ hạt dễ hơn nhiều

so với những cây đã trưởng thành, và các chủng khác nhau của cùng một loài cây trồng thường có các yêu cầu đặc trưng riêng trong vi nhân giống Nói chung, yếu tố hạn chế trong vi nhân giống là sự hình thành rễ chứ không phải là tăng sinh trưởng bộ rễ đã hình thành Các thao tác nhằm thu nhận những cây giống trẻ hóa bao gồm sự lựa chọn những bộ phận còn trẻ của phần gốc cây con sinh ra từ hạt để tạo ra chồi bất định và phối hợp bằng cách ghép những chồi bất định này với cây con sinh trưởng từ hạt

Mục đích của vi nhân giống là tạo được cây giống trẻ hóa có đầy đủ khả năng

ra rễ Sự tiến bộ về khả năng ra rễ và song song với nó là những biến đổi về sức khỏe và hình thái của cây con đã được ghi nhận ở một số loài cây gỗ

2/ Khử trùng mẫu cấy Các yếu tố gây nhiễm trong vi nhân giống bao gồm:

a/ Nhiễm nấm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn trên bề mặt mẫu cấy;

b/ Nhiễm virus và các cơ thể tương tự virus;

c/ Các nguồn bệnh bên trong

Trong một số trường hợp các yếu tố gây nhiễm không chỉ làm ức chế sinh trưởng và sự ra rễ của cây con thu nhận được trong vi nhân giống mà còn duy trì tác dụng ức chế này sau khi trồng cây con thu nhận được ra vườn ươm

Các yếu tố gây nhiễm hầu như có mặt khắp mọi nơi Để diệt trừ chúng thường

hay sử dụng các chất hóa học mà thông dụng nhất là Calcium hypochloride và Natrium hypochloride Những chất này gây tác dụng độc cho vi sinh vật gây

nhiễm nhưng ít độc đối với cây trồng được nhân giống trong ống nghiệm

3/ Điều kiện sinh lý là sự xử lý mẫu cấy để việc nuôi cấy dễ thành công hơn

Có 3 điều kiện sinh lý quan trọng là:

a/ Mẫu cấy lấy từ những cây trồng trong các thùng chứa nuôi trong nhà kính với sự kiểm tra môi trường chặt chẽ;

b/ Phải tạo được những cây giống khỏe mạnh;

c/ Xử lý phytohormone

4/ Môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy thường dùng là môi trường nửa

rắn có chứa agar hoặc các sản phẩm thương mại tương tự, các muối khoáng dinh dưỡng đa lượng và vi lượng, nguồn năng lượng mà chủ yếu là đường saccharose và một số vitamin cần thiết Ngoài ra, trong phần lớn môi trường còn có chứa các loại phytohormone thuộc hai nhóm auxin và cytokinin với tỷ lệ thích hợp đối với từng loại cây Tốc độ tái sinh cây con trong các môi trường này tùy thuộc vào từng loại cây trồng

5/ Dịch rỉ trong vi nhân giống Một hiện tượng không mong muốn thường xảy

hại nhiều nhất là các hợp chất phenol khác nhau Khi chúng bị oxy hóa sẽ làm cho môi trường ngã sang màu nâu, ức chế sự tái sinh và sinh trưởng của cây con Để hạn chế tác hại của loại dịch rỉ này cần phải có biện pháp xử lý mà chủ yếu là sử dụng các chất chống oxy hóa, kể cả bổ sung các chất hấp phụ vào môi trường như polyvinylpyrrolidone hoặc than hoạt tính

6/ Làm ổn định mẫu cấy Các mẫu cấy đòi hỏi phải được cắt và cấy chuyền

nhiều lần để tạo ra những cây con đồng nhất và sinh trưởng tốt Phần lớn cây một năm và cây thảo mộc được ổn định nhanh chóng sau một số lần cấy, trong khi đó cây gỗ đòi hỏi nhiều lần cấy hơn, thậm chí rất khó đạt được tính ổn định Sự khó khăn trong việc làm ổn định mẫu cấy thường gằn liền với trạng thái sinh trưởng của mẫu cấy: mẫu cấy còn non dễ được ổn định hơn Mùa vụ sinh trưởng của mẫu cấy cũng liên quan với sự ổn định này

2.Giai đoạn 2: nhân giống

Mục đích của giai đoạn 2 là duy trì việc vi nhân giống ở trạng thái ổn định và nhân được nhiều cây con theo yêu cầu Môi trường cơ bản của giai đoạn 2 cũng giống như giai đoạn 1.Tốc độ vi nhân giống nhanh chóng sản phẩm thương mại có thể đòi hỏi sự tối ưu hóa không những các nguyên tố vô cơ mà cả các yếu tố khác của môi trường Điều này có thể thực hiện được bằng cách thử một cách hệ thống các nồng độ khác nhau của các nguyên tố sử dụng trong sự phối hợp với các yếu tố khác

Các chất điều hòa sinh trưởng được dùng để duy trì mức độ sinh trưởng cơ bản cũng như phản ứng phát triển của cây nhân giống Cytokinin ở một số nồng độ có tác dụng khá mạnh trong việc kích thích tạo chồi Nói chung, nồng độ tối thiểu của cytokinin kích thích tạo chồi được lựa chọn trong quá trình nhân giống Nồng độ cao của cytokinin vẫn kích thích tạo chồi nhưng có thể ức chế quá trình sinh trưởng của chồi theo chiều dài Vì vậy, xác định chính xác nồng độ cytokinin là rất cần thiết Auxin thường được dùng với nồng độ thấp hoặc không được sử dụng ở giai đoạn 2

Tỉ lệ nhân giống là số cây thu được trong một lần vi nhân giống Nói chung, tỉ

lệ nhân giống từ chối bất định lớn hơn so với từ chồi nách Tuy nhiên, tỉ lệ nhân giống từ một số loại chồi đặc biệt thường có thể cao hơn chồi bất định Vì vậy, tỉ lệ nhân giống cao nhất không nhất thiết phải là đáng ao ước nhất để duy trì chất lượng của cây con thu được.Tần số nhân giống có thể kéo dài từ hai đến tám tuần Kỹ thuật cấy chuyền cần được tối ưu hoá đối với từng loại cây trồng, bao gồm kích thước và tính mùa vụ của mẫu cấy, phương pháp cắt và hướng đặt mẫu cấy lên môi trường

3.Giai đoạn 3: hình thành rễ

Chức năng của giai đoạn này là tạo rễ cho mẫu cấy chuyền để sau đó mang chúng ra trồng trên môi trường vô trùng của vườn ươm Việc tạo rễ có thể được thực hiện bên trong hoặc bên ngoài ống nghiệm và bao gồm các cách sau:

Tạo rễ trong ống nghiệm

a/ Cấy chuyền các đốt cấy sang môi trường tạo rễ có tỉ lệ phytohormone thay đổi bằng cách giảm hoặc hoàn toàn không chứa cytokinin và tăng auxin Hàm lượng muối khoáng thường giảm đi một nửa

b/ Cấy chuyền các đốt cấy sang môi trường tạo rễ (thường là môi trường nước) trong một vài ngày và sau đó cấy chuyền chúng sang môi trường không chứa auxin để tạo rễ Mẫu cấy có thể được đặt dưới ánh sáng hoặc trong tối đối với vài loài, trong môi trường có thể chứa các yếu tố bổ sung hữu ích, ví dụ phloroglucinol

Tạo rễ bên ngoài ống nghiệm

Nhiều hệ thống vi nhân giống thương mại hoặc thực nghiệm tránh tạo rễ

trong ống nghiệm bằng cách xử lý mẫu cấy bằng auxin mà đặt chúng trực tiếp vào môi trường tạo rễ trong điều kiện sương mù hoặc có độ ẩm cao để cho chúng ra rễ Phương pháp này không những tạo ra sự di chuyển tốt đẹp mẫu cấy từ môi trường ống nghiệm ra điều kiện bên ngoài mà còn giúp tiết kiệm thiết bị nuôi cấy Có hai cách thực hiện:

a/ Xử lý mẫu cấy bằng auxin (thường dùng IBA) bằng cách nhúng nhanh chúng vào dung dịch phytohormone và gắn chúng vào môi trường trong vườn ươm có độ ẩm cao;

b/ Xử lý mẫu cấy bằng auxin từ 5 đến 15 ngày như xử lý trong ống nghiệm trên agar hoặc trong môi trường nước, sau đó rửa sạch agar và đặt chúng vào môi trường ngoài ống nghiệm

Có sự khác biệt rõ ràng về hình thái giữa sự hình thành rễ trong ống nghiệm và ngoài ống nghiệm Các mẫu cấy ngoài ống nghiệm có xu hướng tạo rễ “bình thường” hơn cá mẫu cấy trong ồng nghiệm Sau khi chuyển ra trồng ở vườn ươm những cây tạo rễ trong ống nghiệm có thể bị chết, trong khi những cây tạo rễ ngoài ống nghiệm dễ thích nghi với điều kiện môi trường hơ và có tỉ lệ sống sót cao Một khía cạnh tốt của nhân giống trong ống nghiệm là nhiều loại thực vật thông thường khó ra rễ bằng cách giâm cành ngoài ống nghiệm lại có thể ra rễ khi tiến hành vi nghân giống trong ống nghiệm Điều này chủ yếu liên quan với trạng thái trưởng thành của cây dùng làm mẫu cấy, bới vì những mẫu cấy lấy từ khu vực còn non của cây thường dễ nhân giống hơn

4.Giai đoạn 4 Làm cho các cây tái sinh thích nghi khí hậu

Giai đoạn này bao gồm sự di chuyển từ đặc điểm dị dưỡng (cần cung cấp đường) sang đặc điểm tự dưỡng (có khả năng quang hợp) và sự thích nghi của cây con mới tái sinh với môi trường ngoài ống nghiệm Giữ cho số cây con này tiếp tục sinh trưởng là rất quan trọng vì sự thích nghi với khí hậu và phát triển trong điều kiện tự dưỡng rất phụ thuộc vào khả năng sinh trưởng tiếp tục của cây con từ sau khi đưa chúng ra khỏi ống nghiệm Những cây con tái sinh trong ống nghiệm cần phải giữ trong điều kiện có độ ẩm cao để thích nghi dần với điều kiện môi trường, đặc biệt là làm cho chúng tránh bị mất nước

Những chồi con hình thành trong quá trình vi nhân giống có hình thái lá khá đặc biệt Kích thước lá và số lớp tế bào tạo ra lá thấp hơn đáng kể so với những là hình thành sau khi chuyển cây con ra vườn ươm Do độ ẩm cao trong ống nghiệm trên lá không phát triển lớp sáp bảo vệ với số lượng và chất lượng cần thiết Kết quả là những lá hình thành trong vi nhân giống bị khô rất nhanh sau khi được rút ra khỏi ống nghiệm

Xử lý để thúc đẩy tốc độ thích nghi với khí hậu

Trước khi đưa cây ra khỏi ống nghiệm:

a/ Làm giảm độâ ẩm (khoảng 35%) của môi trường trong ống nghiệm trước khi đưa cây con ra ngoài Công việc này có thể được thực hiện bằng cách đặt chất hút ẩm vào ống nghiệm hoặc làm lạnh đáy ống nghiệm Mở nắp ống nghiệm từ 5 đến

7 ngày trước khi đem cây con ra ngoài có thể là một biện pháp hiệu quả

b/ Làm tăng khả năng thẩm thấu của môi trường (thường được thực hiện bằng cách bổ sung thêm đường saccharose)

c/ Sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng trước khi đưa cây con ra ngoài có thể mang lại các kết quả khả quan khác nhau

Sau khi đưa cây ra khỏi ống nghiệm:

a/ Giảm từ từ độ ẩm là biện pháp xử lý thông dụng nhất để làm cho cây con thích nghi với khí hậu Độ ẩm có thể duy trì bằng cách xử lý sương mù gián độn hoặc đặt cây con trong màng polyethylene Đây là bước rất quan trọng trong quá trình cho cây làm quen với khí hậu

b/ Chống thoát hơi nước bằng các độc tố thực vật Công việc này không được sử dụng rộng rãi với mục đích thương nghiệp

IV SƠ LƯỢC LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

Sau khi học thuyết tế bào của Schwan và Schleiden ra đời năm 1838 nhiều nhà sinh học tin tưởng rằng bằng cách nuôi cấy người ta có thể tạo thành công các phôi nhân tạo, và từ đó tạo các cây con hoàn chỉnh, từ các tế bào sinh dưỡng

Giai đoạn đầu tiên của lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể được đánh dấu bằng những thí nghiệm đầu tiên của Kotte và Robbins Năm

1922 hai nhà khoa học này đã bước đầu thành công trong việc dùng đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy rễ của một cây hòa thảo trong môi trường lỏng có chứa muối khoáng và glucose

Giai đoạn thứ hai được bắt đầu năm 1934 khi White, một nhà sinh học người Mỹ, đã nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculenttum) trong một môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và nước chiết nấm men, và sau đó thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 loại vitamin nhóm B là vitamin B1, vitamin B6 và vitamin PP

Sau khi Went và Thimann pháp hiện chất kích thích sinh trưởng thực vật đầu tiên là IAA, năm 1939 Gautheret đã sử dụng thành công chất này và các vitamin

nhóm B nói trên để kích thích sinh trưởng mô sẹo của cây cà rốt và duy trì sinh trưởng của mô sẹo này trong thời gian vô hạn trên môi trường thạch

Năm 1941 Overbeck chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trong nuôi cấy phôi cây họ cà (Dacura); và sau đó, năm 1948, Steward xác nhận tác dụng của nước dừa trên mô sẹo cà rốt Trong thời gian này cùng với IAA một số auxin khác đã được phát hiện và tổng hợp thành công, như NAA và 2,4D Nhiều tác giả nhận thấy cùng với nước dừa 2,4D và NAA đã giúp tạo mô sẹo và phân chia tế bào ở nhiều thực vật rất khó nuôi cấy

Năm 1954 Skook phát hiện một loại phytohormone đầu tiên thuộc nhóm cytokinin là 6-furfuryllaminopurin (kinetin) từ dịch thủy phân ADN và tác dụng kích thích sinh trưởng của nó đối với mô thân cây thuốc lá

Việc phát hiện vai trò của IAA, NAA, 2,4D, và kinnetin cùng với phát hiện vai trò của nước dừa và vitamin là những bước tiến rất quan trọng trong quá trình phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật Đó là tiền đề kỹ thuật cho việc xây dựng các môi trường nuôi cấy ổn định về mặt hóa học để thực hiện các thí nghiệm và nghiên cứu khác nhau, dẫn đến sự phát triển nhanh chóng của kỹ thuật nuôi cấy mô trong giai đoạn tiếp theo

Đặc biệt quan trọng là phát hiện của Skoog và Miller năm 1957 về ảnh hưởng của tỉ lệ cytokinin/auxin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan của mô sẹo thuốc lá Khi tỉ lệ này thấp mô sẹo có khuynh hướng phát triển rễ; ngược lại, khi tỉ lệ này cao thì mô sẹo có khuynh hướng tạo chồi Hiện tượng này được xác nhận ở nhiều cây khác nhau và đóng góp rất lớn vào việc điều khiển sinh trưởng, phát triển, phát sinh cơ quan của mô tế bào nuôi cấy Thành công của Skoog và Miller dẫn đến nhiều phát hiện quan trọng khác, mở đầu cho giai đoạn thứ ba của nuôi cấy mô thực vật

Giai đoạn này được đánh dấu bằng những thành công sau đây:

- Tách và nuôi cấy thành công các tế bào đơn ở dạng huyền phù và nuôi cấy chúng trong thời gian dài (Muir, Hildebrandt và Riker, 1954 – 1959;, Nickell, 1956; Bergman, 1960 ) Nhiều tác giả đã thành công trong việc tạo được cây hoàn chỉnh từ một tế bào, chứng minh cho tính toàn thể của tế bào thực vật Thành công này mở ra những triển vọng mới trong việc tạo ra các dòng tế bào đột biến, các dòng tế bào siêu sản xuất (over-production) một sản phẩm thứ cấp nào đó và khả năng tần số đột biến trong di truyền đột biến ở thực vật bậc cao;

- Thành công trong nuôi cấy túi phấn để tạo cây đơn bội (Guha và Maheswari, 1966 đối với cây cà độc dược; Bourgin và Nitsch 1967 đối với cây thuốc lá ) Ngày nay việc tạo cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn đã thành công ở rất nhiều cây và đã đóng góp vô cùng to lớn vào việc tăng thêm kiến thức di truyền thực vật và thực tiễn chọn giống

- Phát hiện của Cooking (1960) trong việc phân hủy vỏ cellulose của vách tế bào thực vật, tạo ra các tế bào trần (protoplast) Sau đó (1970) Nagata vàTakebe

nuôi cấy và tái sinh các cây hoàn chỉnh từ protoplast Do protoplast có khả năng dung hợp với nhau và hấp thu các phân tử lớn hoặc thậm chí các cơ quan từ bên ngoài nên việc nuôi cấy thành công protoplast và tái sinh cây hoàn chỉnh từ chúng mở ra triễn vọng ứng dụng thành công này trong công tác tạo giống, chọn giống Ngày nay hy vọng này đã được thực hiện, khi nhiều nhóm nghiên cứu khác nhau trên thế giới công bố lai thành công giữa loài nhờ kỹ thuật protoplast, một việc không thể thực hiện được bằng lai hữu tính cổ điển Về mặt lý luận, protoplast là công cụ không thay thế được để nghiên cứu hiện tượng nhiễm sắc thể hòa hợp của các tế bào khác loài sau khi dung hợp và vai trò của ADN trong các cơ quan tử và quan hệ của chúng với ADN của nhân tế bào

- Thành công trong công nghệ chuyển gen từ những năm 1980-1982 Người ta sử dụng các plasmid, tức các phân tử ADN vòng thường có trong các tế bào vi khuẩn để chuyển tải các gen từ protoplast này đến protoplast khác Bằng cách đó người ta đã đưa được các gen ngoại lai vào tế bào thực vật Tiếp sau đó người ta còn sử dụng các biện pháp khác để chuyển gen trong nuôi cấy protoplast như kỹ thuật sử dụng thiết bị xung điện (electroprorator), kỹ thuật vi tiêm ( microinjection), kỹ thuật siêu âm (ultrasonic gen transfer), kỹ thuật bắn gen (gene gun)

- Thành công trong công tác nhân giống và phục tráng giống bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Ngay từ 1969 Morel đã nhận thấy đỉnh sinh trưởng của các loài địa lan (Cymbidium) khi đem nuôi cấy sẽ hình thành các protocorm Khi chia cắt những protocorm này để tiếp tục nuôi cấy sẽ hình thành những protocorm mới Khi để trong những điều kiện nhất định, những protocorm này sẽ tái sinh thành những cây hoàn chỉnh Hơn nữa, các tế bào ở đỉnh sinh trưởng của thực vật chứa rất ít hoặc hoàn toàn không chứa virus, do đó, với phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Morel có thể phục tráng, tạo các dòng vô tính không bị nhiễm virus

Việc ứng dụng nuôi cấy mô thực vật trong nhân giống được Nozeran nâng lên một mức mới khi ông nhận thấy sự hóa trẻ của các chồi nách cây nho và cây khoai tây đem nuôi cấy và cấy chuyền nhiều lần trong ống nghiệm

Việc ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân giống và phục tráng giống ngày nay không còn hạn chế ở một vài loại cây mà đã được thực hiện ở quy mô thương mại đối với hàng loạt cây trồng có ý nghĩa kinh tế như chuối, cà phê, cọ dầu, sắn, khoai lang, khoai tây, mía, cây ăn quả có múi v.v và đã có những đóng góp to lớn cho nông nghiệp thế giới

Ngày nay chúng ta đang bước vào giai đoạn phát triển thứ tư của nuôi cấy mô tế bào thực vật Đó là giai đoạn nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, vào việc sản xuất các chất có hoạt tính sinh học và vào nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao Những hiểu biết cơ bản về đời sống của mô, của tế bào tách rời trong môi trường nhân tạo, về nhu cầu của chúng đối với nguồn carbon, dinh dưỡng khoáng, vitamin, phytohormone những kỹ thuật cơ bản để tách, nuôi cấy, điều khiển sự phân hóa từ các bộ phận khác nhau

của cây trồng là những tiền đề đã được chuẩn bị từ những giai đoạn trước Đồng thời, nhiều công nghệ mới, nhiều trang thiết bị hiện đại đã được phát minh để phục vụ cho việc ứng dụng các thành tựu của nuôi cấy mô tế bào thực vật vào thực tiễn sản xuất

CHƯƠNG II PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

THỰC VẬT

Ở các cơ sở nghiên cứu và sản xuất có sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô khác nhau tùy thuộc vào hoàn cảnh thực tế người ta có thể xây dựng các phòng thí nghiệm với các trang thiết bị với mức độ hiện đại khác nhau Tuy nhiên, tất cả các phòng thí nghiệm này đều phải đảm bảo được ba yêu cầu sau đây:

- Bảo đảm điều kiện vô trùng;

- Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách;

- Chọn mô cấy thích hợp, xử lý mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy

I BẢO ĐẢM ĐIỀU KIỆN VÔ TRÙNG

1 Ý nghĩa cuả vô trùng trong nuôi cấy mô thực vật

Môi trường nuôi cấy mô thực vật rất thích hợp cho nấm và vi khuẩn phát triển Do tốc độ sinh trưởng của nấm và vi khuẩn rất nhanh so với tế bào thực vật, nên nếu trong thời gian nuôi cấy chỉ nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vài vi khuẩn thì chỉ sau vài ngày hoặc vài tuần toàn bộ bề mặt của môi trường nuôi cấy mô sẽ bị nấm hoặc vi khuẩn phủ đầy, làm cho mẫu mô cấy không thể tiếp tục sinh trưởng và chết dần

Thông thường một chu kỳ nuôi cấy mô thực vật kéo dài từ 1 đến 5 tháng, khác với thí nghiệm vi sinh vật, có thể kết thúc trong vài ngày Như vậy, mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đòi hỏi rất nghiêm khắc

2 Nguồn nhiễm tạp

Có ba nguồn nhiễm tạp chính là:

- Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không được vô trùng tuyệt đối;

- Trên bề mặt hoặc bên trong mô cấy tồn tại các sợi nấm, bào tử nấm hoặc

vi khuẩn;

- Trong khi thao tác làm rơi nấm hoặc vi khuẩn theo bụi lên bề mặt môi trường

3 Vô trùng dụng cu ïthủy tinh, nút đậy và môi trường

Dụng cụ thủy tinh dùng trong nuôi cấy mô thực vật cần phải chịu được nhiệt

độ 160-180oC khi vô trùng khô và 120oC khi vô trùng ướt Trước khi sử dụng, dụng cụ thủy tinh cần được rửa sạch, để ráo nước và khử trùng khô trong tủ sấy ở 160oC trong 1 giờ Sau khi để nguội được lấy ra để vào các hộp giấy kín cất vào chỗ ít bụi

Nút đậy: thường dùng nhất là bông không thấm nước Nút phải tương đối chặt

để không cho bụi đi qua, đồng thời nước từ môi trường không bị bốc hơi quá dễ dàng trong quá trình nuôi cấy

Gần đây người ta dùng nhiều loại nút đậy khác thay thế nút bông, như nút nhựa (và cả bình cấy) chịu nhiệt, nút cao su, nút kim loại rất thuận tiện cho việc khử trùng khô hay ướt

Môi trường: Nói chung, môi trường được pha chế trong điều kiện không vô

trùng và đem hấp vô trùng khi đã phân phối vào các bình cấy và đã đậy nút hoặc nắp Thời gian vô trùng từ 20 đến 45 phút ở 120oC Sau khi vô trùng cần phải làm khô nút bông hoặc nắp đậy Các dung dịch mẹ dùng để pha môi trường (như dung dịch muối khoáng, vitamin, phytohormone v.v không nên pha nhiều (100-200ml)

và cần được bảo quản trong ngăn đá của tủ lạnh Đối với các chất không chịu nhiệt,

có thể bị phân hủy ở nhiệt độ 120oC cần tiến hành lọc vô trùng (ví dụ lọc qua phễu lọc thủy tinh số 5 hay qua các loại màng lọc vô trùng) trước khi được đưa vào môi trường đã hấp vô trùng

4 Vô trùng mô cấy

Mô cấy có thể là tất cả các bộ phận khác nhau của thực vật Tùy theo sự tiếp xúc với môi trường, các bộ phận này đều chứa nhiều hay ít vi khuẩn và nấm Đòng lúa non khi còn trong bẹ hay mô thịt quả thường ít nhiễm vi sinh vật, ngược lại, lá, thân, đặc biệt là rễ do nằm trong đất nên có độ nhiễm vi sinh vật rất cao Vì vậy đối với các loại mô cấy khác nhau người ta khử trùng bằng các phương pháp khác nhau

Phương pháp vô trùng mô cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm diệt khuẩn Hiệu lực diệt nấm, khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mô cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô cấy Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lý mô cấy trong vòng 30 giây trong rượu ethylic 70%, sau đó mới xử lý dung dịch diệt khuẩn Đồng thời, người ta thêm các chất giảm sức căng bề mặt như Tween 80, fotoflo, teepol vào dung dịch diệt nấm khuẩn

Các chất diệt nấm khuẩn thường dùng và cho kết quả rất tốt là calcium hypochloride 9-10% xử lý trong thời gian 5-30 phút, natrium hypochloride 9-10% xử lý trong thời gian 5-30 phút và nước brôm 1-2% xử lý từ 2-10 phút Ngoài ra, hydro peroxide 10-12% xử lý trong 5-10 phút và chlorua thủy ngân 0,1-1,0% xử lý trong 2-10 phút cũng cho kết quả tốt đối với từng loại mô cấy

Trong thời gian xử lý mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn Các bộ phận có nhiều bụi đất, trước khi xử lý cần được rửa sạch bằng nước máy Khi xử lý xong, mẫu cấy cần được rửa sạch (ít nhất 3 lần) bằng nước cất vô trùng Những phần trên mô cấy bị dung dịch khử trùng làm cho trắng ra cần được cắt bỏ trước khi đặt mô cấy lên môi trường

Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên Vì vậy, cần phải kiên trì tìm cho được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp cho từng loại mô cấy

5 Vô trùng nơi thao tác cấy và tủ cấy vô trùng

Một trong những nguồn nhiễm tạp quan trọng và thường xuyên nhất là bụi rơi vào dụng cụ nuôi cấy chứa môi trường trong khi mở nắp hoặc nút bông trong khi thao tác cấy Cần áp dụng nhiều biện pháp khác nhau để tránh sự nhiễm tạp này

Buồng cấy: thường là các buồng có diện tích hẹp, rộng từ 10-15 m2, có hai lớp cửa để tránh không khí chuyển động từ bên ngoài trực tiếp đưa bụi vào Buồng cấy cần có sàn lát gạch tráng men, tường sơn để có thể lau rửa thường xuyên Mặt bàn làm việc cũng cần lát gạch tráng men hay phủ kính để tiện làm vệ sinh hàng ngày Trước khi làm việc phải lau mặt bàn bằng cồn 90%

Trước khi đưa vào sử dụng, buồng cấy cần được xử lý hơi formol bằng cách rót formol 40% ra một số nắp đĩa petri để rãi rác vài nơi trong phòng cho bay hơi tự

do Đóng kín cửa phòng cấy trong 24 giờ, sau đó bỏ formol đi và khử hơi formol thừa bằng dung dịch ammoniac 25% cũng trong 24 giờ

Các dụng cụ mang vào buồng cấy đều phải được khử trùng trước: từ quần áo choàng, mũ vải, khẩu trang của người cấy đến dao kéo, kẹp, giấy bọc, bông, ống nghiệm, bình đừng nước cất v.v Trên bàn cấy thường xuyên có một đèn cồn để sử dụng trong khi cấy và một số cốc đựng cồn 90% để nhúng các dụng cụ làm việc Trước khi cấy, người cấy cần lau tay kỹ đến khuỷu tay bằng cồn 90% Để đảm bảo mức độ vô trùng cao, trong phòng cấy cần có một đèn tử ngoại 40W treo trên trần Chỉ bật sáng đèn này khi không có người trong phòng cấy Cần giảm sự chuyển động không khí ở trong buồng cấy đến mức tối thiểu, vì vậy cần tránh ra vào buồng cấy nhiều lần

Để tránh sự ngột ngạt trong buồng cấy, có thể quạt không khí qua các lớp bông thủy tinh ngăn bụi với tốc độ nhỏ vào buồng cấy

Tủ cấy: Trong một số trường hợp người ta sử dụng các tủ cấy đóng bằng gỗ

hoặc ghép bằng kính Tuy nhiên, ngày nay các loại tủ cấy vô trùng lamine (laminar-aie-flow cabinet) được dùng khá phổ biến Đó là loại tủ cấy có thiết bị thổi không khí đã lọc vô trùng vào chỗ thao tác cấy Nhờ có hệ thống màng lọc, tủ cấy lamine loại trừ một cách có hiệu quả nguồn nhiễm tạp từ bên ngoài và tạo điều kiện thoải mái cho người cấy

II CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG

Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tuỳ thuộc loài, bộ phận nuôi cấy, mục đích nuôi cấy và nhiều yếu tố khác Tuy vậy, tất cả các môi trường nuôi cấy bao giờ cũng gồm 3 thành phần:

- Đường làm nguồn carbon,

- Các muối khoáng đa lượng,

- Các muối khoáng vi lượng

- Các vitamin,

- Các phytohormone

Ngoài ra, người ta còn thường thêm vào môi trường nuôi cấy một số chất hữu

cơ thành phần hóa học xác định (aminoacid, EDTA ) hoặc không xác định (nước dừa, nước chiết nấm men )

1 Đường

Trong nuôi cấy mô, nguồn carbon để mô, tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối của mô không phải do quang hợp cung cấp mà do đường trong môi trường Hai dạng đường thường sử dụng nhất là saccharose và gucose, nhưng saccharose được dùng phổ biến hơn

Tùy theo mục đích nuôi cấy, nồng độ saccharose biến đổi từ 1-6% (w/v), thông dụng nhất là 2%, tương ứng với 58,4mM

Trong trường hợp nuôi cấy tế bào quang hợp nồng độ đường có thể giảm xuống hoặc bỏhẵn

2 Các muối khoáng đa lượng

Nhu cầu muối khoáng của mô tế bào tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là nitơ, phospho, kali, magiê, sắt

Nguồn nitơ: Mô tế bào thực vật trong nuôi cấy có thể sử dụng các dạng nitơ

khoáng như amôn và nitrat, đồng thời có thể sử dụng các dạng nitơ hữu cơ như aminoacid Tỷ lệ giũa nitơ dạng amôn và nitrat thích hợp tùy theo loài cây và trạng thái phát triển của mô

Nitrat được cung cấp dưới dạng muối canxi nitrat (Ca(NO3)2,4H2O), kali nitrat (KNO3), natri nitrat (NaNO3) hoặc amôn nitrat (NH4NO3) Amôn cung cấp dưới dạng muối amôn sulphat (NH4)2SO4 hoặc amôn nitrat NH4NO3 Trong một số ít trường hợp có thể được cung cấp ở dạng urê Tổng nồng độ của NO3- và NH4+ trong môi trường thay đổi từ 3 đến 6mM, thông thường khoảng 2mM

Nguồn phospho: Hai dạng phospho thường dùng nhất là NaH2PO4.7H2O và

KH2PO4 Nồng độ phospho trong môi trường biến thiên từ 0,15 đến 4,00mM, thường dùng khoảng 1,00mM

Nguồn kali: Người ta thường cung cấp kali cho mô nuôi cấy dưới dạng kali

nitrat KNO3, kali chlorua KCl,kali phosphat KH2PO4 Nồng độ K+ trong môi trường biến thiên từ 2 đến 25 mM, trung bình khoảng 10mM

Nguồn canxi: Canxi được cung cấp dưới dạng muối canxi nitrat

Ca(NO3)2.4H2O), canxi chlorua CaCl2.6H2O hoặc CaCl2.2H2O Nồng độ Ca2+ trong môi trường tứ 1,0 đến 3,5mM, trung bình là 2,0mM

Nguồn magiê: Magiê được cung cấp dưới dạng magiê sunphat MgSO4.7H2O, với nồng độ trong môi trường khoảng 0,5 – 3,0mM

Nguồn sắt: Những môi trường cổ điển dùng sắt ở dạng chlorua sắt

FeCl2.FeCl3.6H2O, sulphat sắt FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3, citrat sắt Fe(C4H4O6) Hiện nay hầu hết các phòng thí nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelat kết hợp với Na2-ethylen diamintetraacetat (EDTA) Ở dạng này sắt không bị kết tủa và giải phóng

dần ra môi trường theo nhu cầu của mô thực vật

3 Các muối khoáng vi lượng

Nhu cầu muối khoáng vi lượng của mô thực vật trong nuôi cấy mô là lĩnh vực còn ít được nghiên cứu Để an toàn, người ta cung cấp hầu hết các nguyên tố vi lượng cần thiết đối với cây cho mô nuôi cấy trong môi trường nhân tạo, vì vậy sự cung cấp này có tính chất kinh nghiệm chủ nghĩa, trong những trường hợp cụ thể có thể là không cần thiết

Các vi lượng thông dụng được giới thiệu trong bảng 1

Bảng 1 Các vi lượng thông dụng

Tên vi lượng Dạng sử dụng Nồng độ µM

KI

15 – 100

6 – 100

15 – 30 0,04 – 0,08 0,007 – 1,0 0,1 – 0,4 2,5 – 20,0

4.Các vitamin

Các vitamin sau đây thường được dùng trong các môi trường nuôi cấy (bảng 2)

Bảng 2 Các vitamin thường được dùng trong các môi trường nuôi cấy mô

Tên vitamin Nồng độ sử dụng (mg/l)

10 - 50

1 – 5

Riboflavine (vitamin B2)

Biotin

Acid folic

1 – 5 0,1 – 1,0 0,1 – 1,0 Các vitamin thường dùng được pha trong hỗn hợp các dung dịch mẹ có nồng độ cao gấp 500 hoặc 1000 lần dung dịch làm việc và được bảo quản ở nhiệt độ dưới

0oC Nên chia sẵn dung dịch mẹ vitamin ra nhiều lọ nhỏ, mỗi lọ đủ dùng cho một hoặc vài lít môi trường và bảo quản trong ngăn đá tủ lạnh

5 Các chất kích thích sinh trưởng (phytohormone)

Các phytohormone thường dùng trong nuôi cấy mô được trình bày trong bảng

3

Tên phytohormone Nồng độ sử dụng (mg/l)

2,4D (Dichlorophenoxyacetic acid

α- NAA (α- Naphtylacetic acid)

β-IAA (β-Indolacetic acid)

IBA (Indolbutyric acid)

5 – 20

1 – 5 0,1 – 2,0 0,1 – 2,0 0,1 – 2,0 0,1 – 2,0 Thường người ta pha các dung dịch mẹ phytohormone có nồng độ cao gấp

1000 lần dung dịch làm việc Do một số phytohormone ít tan trong nước nên cần phải pha như sau: Cân lượng phytohormone đủ pha 100 ml dung dịch mẹ vào một

ly khô Đối với 2,4D, NAA, IAA, IBA, GA, trước hết thêm 2 – 3 ml rượu ethylic 90% và lắc đến khi tan hết, sau đó thêm nước cất đến 100 ml Đối với BA và 2-iP trước hết thêm 2 – 3 ml nước cất và vài giọt HCl 1N, lắc cho tan, sau đó lên thể tích đến 100ml

Bảo quản dung dịch mẹ phytohormone trong lọ kín (riêng IAA trong lọ màu nâu), cất giữ trong tủ lạnh, 2,4D, NAA tương đối bền, có thể bảo quản như vậy trong một năm 2-iP, IBA, kinetin, GA bảo quản được từ 2 đến 3 tháng IAA cần pha lại hàng tháng để đảm bảo hoạt tính

Cần chú ý, phytohormone có thể tác động lên mô nuôi cấy ở nồng độ rất thấp,

vì vậy cần dùng pipet riêng cho từng loại phytohormone và chú ý rửa cẩn thận các dụng cụ thủy tinh đã dùng để đựng và pha chế các phytohormone ở nồng độ cao Trừ IAA và GA, các phytohormone còn lại được coi là bền vững trong quá trình hấp vô trùng

6 Các chất hữu cơ khác

Nước dừa: chất có hoạt tính trong nước dừa đã được chứng minh là

myo-inozitol và một số aminoacid Lượng nước dừa dùng trong môi trường nuôi cấy thường khá lớn, từ 15 đến 20% thể tích môi trường

Lấy nước dừa ở trái dừa già, lọc trong và bảo quản trong lạnh sâu cho đến khi dùng Thời gian bảo quản không quá vài tháng, tốt nhất là sử dụng tươi

Nước chiết nấm men: là các chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật,

mô tế bào động vật, đã được tiêu chuẩn hóa và bán dưới dạng thương phẩm Thành phần hóa học không rõ, trừ một số aminoacid Lượng thường dùng là 1 gam cho 1 lít môi trường

7 Chuẩn bị các dung dịch đậm đặc và dung dịch làm việc

Để thuận tiện cho việc pha các môi trường nuôi cấy (môi trường làm việc) người ta pha trước các dung dịch đậm đặc, sau đó chỉ cần pha loãng khi sử dụng Các dung dịch đậm đặc được bảo quản dài ngày trong tủ lạnh thường hoặc tủ lạnh sâu

Hiện nay một số hãng sản xuất hóa chất đã có bán loại môi trường chuẩn bị sẵn thành gói gồm đủ các thành phần thích hợp với một mục đích nhất định, ví dụ, môi trường MS để nhân giống một số cây cảnh Khi dùng chỉ cần hòa một gói vào một lít nước cất, đun sôi là có ngay một môi trường làm việc

Sau đây chúng ta sẽ làm quen với công việc pha chế môi trường qua ví dụ với các môi trường MS và White

Trước hết chúng ta pha các dung dịch đậm đặc (thường gọi là dung dịch mẹ)

A, B, C, D, E, F, G và H với thành phần và nồng độ theo bảng 1 (môi trường MS) hoặc bảng 2 (môi trường White)

Bảng 1 Thành phần các dung dịch mẹ MS

Dung

dịch

mẹ Hóa chất Nồng độ (g/l)

Số ml dung dịch mẹ cần cho 1000ml dung dịch làm việc

Fe2(SO4)3

0,8 0,38

28

B NH4NO3

KNO3

82,5 95,0

5

Sau đó, để pha 1 lít môi trường làm việc cần thực hiện các động tác sau:

- Cho khoảng 800ml nước cất vào một cái bình có dunh tích 2 lít;

- Dùng pipet cho 28ml dung dịch mẹ A, 20ml dung dịch mẹ B, 5ml mỗi

dung dịch mẹ C, D,E, F, 1 ml dung dịch mẹ G và 0,5ml dung dịch mẹ H

Trong khi trộn lẫn các dung dịch cần luôn luôn khuấy đều;

- Thêm 100 ml mezo-inozitol;

- Đo pH và dùng HCl 0,1N và NaOH 0,1N để chỉnh pH đến 6,5;

- Thêm 20g saccharose và khuấy cho tan

- Thêm 6-8g aga-aga;

- Đun sôi cho đến khi tan hết thạch, vừa đun vừa khuấy đều để aga-aga

không bị cháy;

- Chia hỗn hợp dung dịch này vào các ống nghiệm hay bình nón khi còn

đang nóng trong khi aga-aga chưa đông lại

Bảng 2 Thành phần các dung dịch mẹ White

Dung

dịch

mẹ Hóa chất Nồng độ (g/l)

Số ml dung dịch mẹ cần cho 1000ml dung dịch làm việc

100

10

8 Vấn đề lựa chọn môi trường

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật có hàng trăm loại môi trường khác nhau

Tuy nhiên có thể chia chúng thành 3 nhóm:

- Môi trường nghèo dinh dưỡng: điển hình là môi trường Knop, môi trường

Knudson C;

- Môi trường trung bình: điển hình là môi trường môi trường White; môi

trườnng B5 của Gamborg;

- Môi trường giàu dinh dưỡng: điển hình là môi trường Murashige – Skoog

(môi trường MS)

Vì vậy khi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô một đối tượng nào đó mà chưa có

tài liệu tham khảo về môi trường để nuôi cấy đối tượng đó thì trước hết cần tiến

hành thí nghiệm thăm dò một trong 3 loại môi trường nói trên để tìm môi trường

thích hợp Sau khi đã tìm thấy môi trường thích hợp chúng ta có thể từng bước cải

tiến để tự tìm cho mình môi trường thích hợp nhất cho mục đích, đối tượng và nội

dung nghiên cứu Ví dụ, chúng ta có thể thử tìm tỷ lệ NO3-/NH4+ cho từng loại đối

tượng Với các cây trồng trên cạn người ta thường không dùng NH4+ nhưng đối với

một số cây khác có khả năng hấp thu mạnh NH4+ như cây lúa thì sử dụng ion này

trong nuôi cấy mô chắc chắn sẽ đem lại kết quả tốt

Do môi trường MS được xem là môi trường giàu và cân bằng về chất dung

dịch, thích hợp cho nhiều loại cây nên những người tập sự làm nuôi cấy mô thường

bắt đầu bằng môi trường này trước khi tìm ra môi trường riêng của mình

III CHỌN VÀ XỬ LÝ MÔ CẤY

Về nguyên tắc, trừ những mô đã hóa gỗ các mô khác ttrong cơ thể thực vật

đều có thể dùng làm mô cấy Tuy vậy, các mô còn non như mô phân sinh ngọn,

tượng tầng, chóp rễ, phôi đang phát triển, thịt quả non, lá non, cuống hoa, đế hoa,

mô phân sinh đốt khi nuôi cấy trong môi trường chứa một lượng phytohormone

thích hợp đều có khả năng tạo mô sẹo hoặc tái sinh cây con Thông thường, để bắt

đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nào đó người ta thường dùng chồi nách hoặc mô phân sinh ngọn

Cần chú ý rằng tuy mang một lượng thông tin di truyền như nhau, các mô khác nhau trên cùng một cây có thể cho các mô sẹo phát triển hoàn toàn khác nhau với khả năng tái sinh chồi, rễ hay toàn cây rất khác nhau Vì vậy, khi bắt đầu một chương trình sử dụng phương pháp nuôi cấy mô để chọn giống và nhân giống một cây nào đó, trước hết cần thí nghiệm tìm hiểu phản ứng của các bộ phận khác nhau của cây trong nuôi cấy ở các nồng độ phytohormone khác nhau Ví dụ, đối với cây mía, kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy lá non đang còn bọc trong bẹ và đòng hoa non là mô cấy thích hợp hơn cả cho việc tạo mô sẹo và tái sinh cây hoàn chỉnh

Sau khi cấy, mô cấy cần được đặt trong các điều kiện nhiệt độ và ánh sáng ổn định phù hợp với nhu cầu của từng loại mô cấy nhờ các máy điều hoà tự động

IV PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

Nuôi cấy mô thực vật không cần nhiều máy móc đắc tiền Có thể bắt đầu hoạt động nuôi cấy với các thiết bị tối thiểu gồm nồi hấp vô trùng và buồng cấy vô trùng hoặc tủ cấy bằng gỗ có trang bị đèn tử ngoại

1.Cách bố trí phòng thí nghiệm nuôi cấy mô

Một phòng thí nghiệm nuôi cấy mô hiện đại được thiết kế phù hợp với tính

chất dây chuyền của công việc như mô tả trong hình 1

1 2 3 4 5

6

Hình 1 Sơ đồ một phòng thí nghiệm nuôi cấy mô hoàn chỉnh:

1: Phòng rửa và sản xuất nước cất; 2: phòng sấy, hấp, kho thủy tinh sạch;

3: phòng chuẩn bị môi trường; 4: phòng chuẩn bị mẫu; 5: phòng cấy vô

trùng; 6: phòng ảnh; 7: phòng kính hiển vi; 8,9: phòng sáng; 10: phòng

sinh hóa

Bên cạnh phòng thí nghiệm phải có hệ thống nhà kính, vườm ươm để trồng cây lấy nguyên liệu nuôi cấy và cây tái sinh trong ống nghiệm

2 Các thiết bị chủ yếu của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật

Một phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật cần có các trang thiết bị chủ yếu

Rất cần Tùy theo nhu cầu

PHÒNG RỬA VÀ NƯỚC CẤT:

+ Máy cất nước một lần 12-20l/h + Máy cất nước hai lần 5l/h

+ Máy sản xuất nước khử ion

PHÒNG SẤY HẤP

+ Tủ sấy 60 – 600oC

+ Nồi hấp dung tích 70 -100 lít

+Nồi hấp loại nhỏ 20-30-lít

PHÒNG CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG

+ Máy đo pH chính xác 0,1 đơn vị

+ Cân phân tích độ chính xác 0,1mg

+ Cân kỹ thuật

+ Bếp điện, bếp gas hoặc bếp dầu hỏa

+ Tủ lạnh thường dung tích 200-400 lít

+Giấy đo pH + Máy khuấy từ + Máy rót môi trường + Tủ lạnh sâu (-20oC)

BUỒNG CẤY VÔ TRÙNG

+ Đèn tử ngoại treo trần hoặc treo tường

+ Tủ cấy lamine hoặc tủ cấy đóng bằng gỗ

+ Thiết bị lọc không khí

PHÒNG ẢNH

+ Máy ảnh và thiết bị chụp gần + Các dụng cụ in ảnh đen trắng hoặc màu

+ Máy chiếu

PHÒNG KÍNH HIỂN VI

+ Kính hiển vi hai mắt

+ Kính lúp hai mắt

+ Thiết bị chụp ảnh trên kính hiển vi + Microtome và các dụng cụ để quan sát tế bào học

PHÒNG SÁNG

+ các giàn đèn huỳnh quang 3000-4000

lux

+ Máy điều hòa nhiệt độ

+ Máy lắc ngang khoảng 100 vòng/phút + Các dụng cụ nuôi cấy tế bào đơn

CHƯƠNG III CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ

I NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG

Mô phân sinh đỉnh chứa những tế bào đỉnh sinh trưởng và được bao bọc bởi một lớp vỏ có cấu tạo cutin hạn chế thấp nhất quá trình mất nước

Ở thực vật sự hình thành mới các cơ quan bắt đầu trong các mô phân sinh đỉnh Các mô mày phân hóa ngay từ những giai đoạn phát triển đầu của phôi và giữ lại trong suốt đời sống của cây Điều này xảy ra là do trong mô phân sinh có sự phân hóa của các tế bào khởi sinh Tất cả các tế bào còn lại đều xuất phát từ những tế bào khởi sinh này

Vì mô phân sinh có thể tích tương đối ổn định nên các tế bào sinh ra từ các tế bào khởi sinh sau một vài lần phân chia sẽ rời khỏi mô phân sinh (hình 2)

Hình 2 Đỉnh sinh trưởng

Quá trình sinh trưởng của cơ quan diễn ra theo 3 giai đoạn Trong giai đoạn thứ nhất, thường được gọi là giai đoạn phôi sinh, trong các điểm sinh trưởng (trong các mô phân sinh đỉnh) xảy ra sự hình thành mầm cơ quan và sự phân chia đầu tiên của nó thành các mô riêng biệt Trong giai đoạn thứ hai do sự sinh trưởng nhanh chóng, mầm cơ quan đạt đến kích thước tối đa và trở nên có hình dạng xác định Cuối cùng, trong giai đoạn thứ ba kết thúc sự phân hóa tế bào, bắt đầu sự hóa gỗ các vách tế bào, kết quả là tế bào không còn khả năng tiếp tục sinh trưởng Trước hết các u lá xuất hiện Thể tích của u lá tăng rất nhanh và kéo theo nó một phần lớn của đỉnh sinh trưởng Dần dần u lá chuyển thành mầm lá (thể nguyên thủy) Mầm lá sinh trưởng nhanh theo chiều dài Do sự sinh trưởng xảy ra không đều nên lá mầm tự cong lên phía đỉnh Sau khi lá được tách ra lại xảy ra sự phân phối lại sự phân chia tế bào, kết quả là thể tích của đỉnh sinh trưởng được khôi phục nhanh chóng và sự hình thành lá mới lại bắt đầu

Ở mỗi nách lá đều có chồi nách Chồi nách thực chất có cấu tạo không khác đỉnh sinh trưởng của thân Do hiện tượng ức chế ưu thế ngọn nên chồi nách không phát triển, nhưng khi được đánh thức và bắt đầu sinh trưởng chúng có cấu tạo giống như đỉnh sinh trưởng ngọn

Quá trình tổng hợp ADN của virus thực vật không xảy ra trong đỉnh sinh trưởng do một cơ chế hiện nay không rõ Vì vậy mô đỉnh sinh trưởng là mô duy nhất sạch virus trong một cây nhiễm virus Do đó trong kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào đỉnh sinh trưởng được sử dụng để tái sinh những cây con sạch virus

Do vùng mô phân sinh quá nhỏ, kỹ thuật tách đỉnh sinh trưởng được thực hiện dưới kính lúp Các đỉnh sinh trưởng kích thước 0,1 – 0,15 mm sẽ tạo ra được 100% số cây con sạch bệnh và tỉ lệ này giảm dần đến kích thước 1 mm Mặt khác, mẫu cấy càng nhỏ càng khó tái sinh cây con và khả năng sống sót của mẫu cấy càng giảm Vì vậy, nói chung, kích thước tương đối thường sử dụng là dài từ 0,25 đến 1,0

mm Xử lý nhiệt (Thermotherapy) các cây trước khi từ đó lấy đỉnh sinh trưởng có

thể làm tăng khả năng loại trừ virus Một số hóa chất loại trừ virus, như ribavirein, được bổ sung vào môi trường nuôi cấy sẽ làm tăng khả năng tái sinh cây con sạch virus

Khi đã tạo được cây con có đủ rễ, nó có thể được sử dụng làm nguyên liệu để tạo dòng sạch bệnh phục vụ sản xuất

Cây con nhân giống từ đỉnh sinh trưởng được sử dụng rất có hiệu quả đối với nhiều loại cây thảo mộc Các vật liệu thu được từ chương trình này đã trở thành hướng sản xuất cây giống rất quan trọng đối với nhiều loại cây thương phẩm như cẩm chướng, cúc, hoa lan, phong lữ, khoai tây, khoai lang, sắn, chuối và nhiều cây khác Chương trình này phức tạp hơn đối với các loài cây gỗ Đối với nhóm cây này phương pháp vi ghép là một giải pháp thay thế Cải thiện các phương pháp vi nhân giống cây gỗ có thể làm mở rộng tính hiệu quả của việc nhân giống nhóm cây này

Chúng ta hãy làm quen với kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng qua việc nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây khoai tây và cây địa lan Cymbidium

1/ Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây khoai tây

Morel và Martin (1955) là những người đầu tiên dùng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để thu được cây khoai tây không chứa virus Ngày nay phương pháp này đã và đang được sử dụng ở nhiều nước trên thế giới

Phương pháp này bao gồm những nội dung cơ bản sau đây:

Lấy một củ khoai tây trồng vào một chậu đất trong điều kiện nhiệt độ và ánh sáng bình thường Khi mầm cao 15cm, lấy phần ngọn dài 6-8 , cắt bỏ 2 lá dưới, cắm vào một cái ly đựng đất mùn đã vô trùng, đậy một ly khác để tránh bị héo trong vòng 10 ngày cho ra rễ

Sau 3-4 tuần chuyển ly có cây vào điều kiện chiếu sáng 3000-4000 lux với chế độ chiếu sáng 16h/ngày, nhiệt độ không khí 36oC ban ngày và 33oC ban đêm Sau đó 2 tuần cắt bỏ ngọn mầm để thúc các chồi nách phát triển Sau khi xử lý nhiệt 6 tuần, lấy phần ngọn chồi nách để tách đỉnh sinh trưởng Cắt bỏ bớt lá và đặt chồi trên một tờ giấy lọc ẩm trong một hộp lồng để tránh bị héo Không cần thiết phải vô trùng chồi nách trước khi làm thao tác tách đỉnh sinh trưởng, nhưng cần tách trong điều kiện vô trùng và dụng cụ tách phải được vô trùng bằng cồn và nước cất vô trùng Dưới kính lúp có độ phóng đại X 25 dùng kim nhọn để gạt bỏ các lá ngoài, để lộ đỉnh sinh trưởng với hai lá nguyên thủy Dùng một mảnh dao cạo gắn lên đầu một que sắt để cắt lấy mô đỉnh sinh trưởng có chiều dài khoảng 0,6mm Dùng kim nhọn đưa đỉnh sinh trưởng lên mặt môi trường thạch, giữ ở 23oC trong điều kiện chiếu sáng16 giớ/ngày đêm Sau vài tuần, khi cây đã lớn được 3 cm và có rễ, có thể chuyển qua môi trường mới Khi cây có nhiều lá, cắt đoạn và nhân lên nhiều cây, đồng thời đưa chẩn đoán virus trên các cây chỉ thị như Gompherena globa (virus X), Chenopodium amaraticolor (virus S và X), Solanum demisum (virus Y)

Môi trường dùng để cấy đỉnh sinh trưởng của khoai tây là môi trường MS có bổ sung 0,5mg/l IAA, 0,1mg/l GA và 100mg/l inozitol Nếu thấy cây khoai tây khó

ra rễ, cần thêm 10mg than hoạt tính vào một ống nghiệm trước khi vô trùng Dùng ống nghiệm nhỏ 12 x 100mm, mỗi ống nghiệm 3,5ml môi trường

Sau khi đã chắc chắn không còn virus trong cây khoai tây, các ống nghiệm được đưa vào nhân giống và bảo quản

Khi đã có được các dòng khoai tây không chứa virus, vấn đề đặt ra là phải duy trì, bảo vệ được các dòng này không bị tái nhiễm Phương pháp duy nhất có thể duy trì được giống khoai tây sạch bệnh trong điều kiện ở nước ta là bảo quản trong ống nghiệm bằng phương pháp nuôi cấy mô Hơn thế nữa, nhân giống khoai tây bằng phương pháp nuôi cấy mô là phương pháp nhân giống cực nhanh Toàn bộ quy trình nhân giống khoai tây bằng phương pháp nuôi cấy mô phục vụ sản xuất bao gồm các bước sau đây:

Bước 1: Nhân giống trong ống nghiệm; Tùy theo diện tích gieo trồng, mỗi ha

cbỉ cần 50 ống nghiệm

Bước 2: Khay mẹ: cắt và cắm các đoạn thân cây khoai tây từ ống nghiệm trên

cát ẩm trong một khay gỗ 40 x 60 cm.Mỗi đoạn thân có một lá, một chồi nách Khoảng cách cắm 3 x 3 cm Che nắng, giữ ẩm 7 ngày đầu Khi đoạn thân ra rễ tưới dung dịch NPK loãng mỗi ngày một lần Thường xuyên phun thuốc phòng trừ sâu, bệnh Sau một tháng cắt ngọn để nhân tiếp ở trên đất như mô tả ở bước 3 Sau khi cắt ngọn 5-7 ngày, các chồi nách bật lên cũng được cắt tiếp để nhân trên đất Khay mẹ được sử dụng liên tiếp trên 12 tháng để cắt chồi ngọn

Bước 3: Nhân trên luống mạ: Ngọn chính và các chồi thu trên luống cát được

cắm vào đất ẩm giàu dinh dưỡng (tỷ lệ 3 phần đất, 1 phần phân đã hoai) gọi là luống mạ khoai tây Hỗn hợp đất phân cần được vô trùng sơ bộ để trừ sâu bệnh và

được trải thành luống rộng 80 cm, dài 5 – 10 m Bề dày lớp đất 6 – 8 cm Khoảng cách cắm ngọn 5 x 5 cm sau khoảng 20 ngày lại tiếp tục cắt ngọn để tiếp tục nhân sang luống mạ khác Cứ như vậy các luống mạ khoai tây có thể khai thác liên tục trong vòng 6 – 7 tháng

Bước 4: Nhân giống trong bầu đất: Bầu đất làm bằng lá chuối cuộn tròn, kích

thước khoảng 3 x 8 cm, bên trong chứa đất giàu mùn như đối với khay mạ ở bước 3 Ngọn và chồi thu hái ở bước ba được cắm vào bầu đất, mỗi bầu đất một ngọn Che nắng và giữ ẩm 4 – 5 ngày đầu Khi cây đã ra rễ và vươn ngọn thì thì bỏ che và tưới hàng ngày bằng dung dịch NPK loãng 15 – 20 ngày sau khi cấy cây khoai tây có bộ rễ phát triển mạnh, thân mập, ngọn vươn cao trên 10 cm, có thêm nhiều lá mới Lúc này có thể đem trồng ngoài đồng ruộng

Bước 5: Cây khoai tây bầu đất được trồng với mật độ cao (100 ngàn cây/ha)

để hạn chế hình thành củ lớn, tạo nhiều củ nhỏ 15-50 gam

Bước 6: Trồng củ nhỏ đã nẩy mầm với mật độ 30.000 cây/ha để sản xuất củ

giống Khi thu hoạch, sau khi loại bỏ củ lớn để làm khoai thương phẩm, củ nhỏ và trung bình dung làm giống cho thế hệ tiếp theo

2/ Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây địa lan

Năm 1962 George Morel lần đầu tiên thành công trong việc nuôi cấy mô địa lan Cymbidium

Ngày nay, kỹ thuật nhân giống Cymbidium bằng phương pháp nuôi cấy mô đã được phổ biến rộng rãi Ở nhiều nước bên cạnh việc sản xuất cây giống trên qui mô công nghiệp còn sản xuất cây giống ở qui mô gia đình

Kỹ thuật nhân giống Cymbidium bằng phương pháp nuôi cấy mô được thực hiện qua các bước cơ bản như sau:

+ Chọn cây giống và mô phân sinh:

- Chọn cây lan có nhiều đặc điểm tốt đáp ứng được mục tiêu kinh doanh;

- Lấy tế bào phân sinh từ các đọt cây, chồi ngủ và những chồi phát hoa còn non Nhưng đọt cây là tốt nhất cho việc nhân giống

+ Chuẩn bị mô để nuôi cấy

- Cắt các đỉnh sinh trưởng, bóc các lá bao, rửa sạch phần thân còn lại;

- Khử trùng bằng các chất diệt nấm khuẩn thường dùng như calcium hypochloride 9-10%, natrium hypochloride 9-10% trong 5-30 phút và nước brôm 1-2% từ 2-10 phút Ngoài ra, hydro peroxide 10-12% trong 5-10 phút và chlorua thủy ngân 0,1-1,0% trong 2-10 phút cũng cho kết quả tốt đối với từng loại mô cấy

- Bóc nhẹ nhàng các lá non đến khi nhìn thấy mầm nhỏ bên trong;

- Dùng dao nhọn lấy mầm đưa vào môi trường nuôi cấy

Tất cả các thao tác trên đều phải tiến hành trong điều kiện vô trùng

+ Môi trường nuôi cấy:

Môi trường thường dùng là môi trường MS, Vacin-Went hoặc Knudson C Sau khoảng 30 ngày từ đỉnh sinh trưởng hình thành các thể chồi (protocorm) nhỏ li ti Chia nhỏ các thể chồi này để cấy chuyền sẽ tạo ra được một số lượng lớn thể chồi Khi cấy chuyền sang môi trường thích hợp từ những thể chồi này sẽ hình thành các cây con hoàn chỉnh

Nhân giống hoa lan bằng phương pháp cấy mô trong một thời gian ngắn có thể tạo ra một số lượng cây giống lớn cung cấp cho các cơ sở nuôi trồng tạo nguồn hàng xuất khẩu

Nuôi trồng, chăm sóc cây giống sau ống nghiệm

Cây con trong các bình cấy khi mọc được 2 rễ tốt có thể chuyển ra ngoài trồng vào chậu chung hoặc trồng thành luống Trước khi trồng cây lan con từ trong bình lấy ra cần được bỏ vào chậu nước để rửa sạch agar và vết tích môi trường bám vào rễ Chậu trồng lan và các dụng cụ để trồng lan con phải được khử trùng, sau đó cho than củi hoặc gạch vụn vào khoảng nửa chậu rồi tuỳ thuộc loại lan cần trồng mà thêm vào một lớp than, gạch nhuyễn hoặc dớn, xơ dừa cho gần đầy chậu

Đặt các cây lan con vào chậu để rễ xen kẽ vào các lớp than, gạch và cọng dớn Mỗi chậu chung trồng khoảng 30-40 cây con Dùng vỏ thông đặt chung quanh chậu và giữa các cây để bảo vệ bộ rễ, không cho chúng lay động khi gió mạnh hoặc khi tưới nước

Sau khi trồng lan vào chậu chung, cần phải phun thuốc phòng trừ bệnh hại như dung dịch captan hoặc thiuran pha một thìa cà phê trong ¼ lít nước Các chậu chung phải để ở nơi có mái che tránh nước mưa và ánh sáng mặt trời trực tiếp chiếu vào cây con

Cây lan con nuôi trồng trong chậu chung 4 tháng thì bắt đầu chuyển sang chậu riêng kích thước nhỏ 8cm Ngâm chậu chung vào nước 1 giờ để gỡ lan con ra khỏi chất trồng, tránh tổn thương rễ của cây Môi trường trồng cây lan ở giai đoạn này cũng giống như giai đoạn chậu chung Khi cây lan đã có 4-6 lá thì chuyển sang chậu cỡ 11-12cm Trồng và chăm, sóc lan con trong chậu vừa cho đến khi rễ phát triển ra ngoài chậu; cây có khoảng 6-8 lá thì chuyển sang chậu cỡ lớn 15-17cm và chăm ssóc cho đến khi ra hoa

Toàn bộ lan con trồng trong chậu chung, chậu riêng, chậu vừa được đặt lên sạp cao 50cm, trên sạp có giàn che nắng bằng lưới polyethylen màu xanh hoặc màu đen cao 2,5-3m so với mặt đất Tưới nước và bón phân theo yêu cầu đối với từng loại lan

Để tạo điều kiện cho cây lan sinh trưởng và phát triển tốt cần phải sử dụng chế độ bón phân hợp lý

Cây lan con sau khi ra khỏi bình cấy từ giai đoạn lúc trồng ở chậu chung cần

trưởng mạnh nên cần bón phân đạm với tỷ lệ cao hơn lân và kali Tốt nhất là bón phân NPK với tỷ lệ 30-10-10 năm ngày một lần vào mùa nắng và 10-15 ngày một lần vào mùa mưa

Ở giai đoạn cây lớn cần phải cung cấp dinh dưỡng đảm bảo cho cây sinh trưởng và phát triển mạnh Nếu chế độ dinh dưỡng và chăm sóc không tốt sẽ ảnh hưởng lớn đến sự ra hoa và chất lượng hoa

Mỗi giống lan, mỗi loài lan có những yêu cầu chăm sóc khác nhau Nhưng đối với giai đoạn này có thể áp dụng chế độ phân bón như sau:

Cứ 5 ngày tưới phân một lần:

Lần 1 dùng loại phân 20-20-20 và vi lượng hoặc pha chế NPK theo tỷ lệ trên; Lần 2 dùng nước tiểu người hoặc phân heo, phân bò, bột cá

- Nước tiểu: pha 1 pnần nước tiểu + 30 phần nước;

- Phân heo: pha 1 phần phân + 100 phần nước;

- Phân bò: pha 1 phần phân + 30 phần nước

Lần 3 dùng loại phân tương tự như lần 1

Sau đó lần 4 lặp lại như lần 2, lần 5 lặp lại như lần 1, lần 6 lặp lại như lần 2 Giai đoạn ra hoa là giai đoạn cuối cùng của quá trình nuôi trồng và có ý nghĩa quyết định đến kết quả thu hoạch sản phẩm Về chế độ dinh dưỡng, khi vườn lan gần đến thời kỳ ra hoa phải tăng cường tưới bón tỉ lệ lân cao cho cây Phân hỗn hợp dùng tưới bón trong giai đoạn này là loại phân:

- 6-30-30 và vi lượng;

- 6-30-20 và vi lượng;

- Hoặc pha chế các loại phân N-P-K theo các tỉ lệ trên

Trên cơ sở nghiên cứu sinh học phát triển của Cymbidium người ta đã ghi nhận được rằng từ tháng 6 đến tháng 8 bắt đầu hình thành cơ quan sinh sản Để thúc đẩy sự phát triển của cơ quan này cần bón nhiều các loại phân phospho và kẽm, đồng thời cần nâng cao nhiệt độ của môi trường

Một phát hiện lý thú khác là để tăng số lượng hoa cần tạo ra pH-stress vào 10 ngày thứ hai của tháng bảy bằng cách trong vòng một tuần cần thay đổi pH môi trường 1,5-2,0 đơn vị bằng cách bón cacbonat canxi 0,8% Sau đó giảm từ từ pH của môi trường cùng với tăng cường đột ngột việc bón phospho cho cây Việc tạo pH-stress để kích thích cây ra nhiều hoa chỉ đem lại kết quả tốt nếu đảm bảo chế đô dinh dưỡng cho cây như đã giới thiệu ở trên

II NHÂN GIỐNG BẰNG CON ĐƯỜNG PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH

Ở thực vật bậc cao phôi là sản phẩm tự nhiên của quá trình thụ tinh trong sinh sản hữu tính Tuy nhiên, phôi cũng có thể hình thành từ các tế bào soma qua quá trình nuôi cấy in vitro Phôi loại này được gọi là phôi vô tính (somatic embryos) Phát sinh phôi vô tính là sự phát triển phôi từ các tế bào và mô soma trong các hệ thống nuôi cấy in vitro Đầu tiên, trong nghiên cứu các hệ thống huyền phù Steward đã phát hiện được rằng các tế bào cà rốt khi xử lý bằng sữa dừa sẽ ngừng

phân chia và phân hóa thành các cấu trúc tương tự như phôi có tên gọi là embryoid

Cũng vào thời gian này Reinert độc lập phát hiện hiện tượng như vậy ở cà rốt nuôi trên thạch có sử dụng các nồng độ auxin như yếu tố gây cảm ứng Từ đó các mô đặc trưng thuộc các loài khác nhau được tìm thấy có khả năng tạo phôi vô tính trong các hệ thống nuôi cấy hoặc có thể được cảm ứng tạo phôi vô tính bằng cách xử lý đặc biệt đối với môi trường Phôi vô tính phát triển thông qua các giai đoạn tương tự như phôi hình thành từ hợp tử Tuy nhiên, kích thước cuối cùng của lá mầm thường nhỏ và không có sự phát triển của phôi nhũ hoặc vỏ hạt Các gen kéo theo khả năng tạo phôi vô tính và sự điều hòa hoạt động của các gen là như nhau ở phôi vô tính và phôi hữu tính

Phôi vô tính tạo ra tiềm năng sản xuất hàng loạt cây con như những cây sinh

ra từ hạt giống Cây giống được tạo ra bằng phương pháp này bao gồm các loại cây trồng ngoài đồng (lúa, cỏ linh lăng, đậu tương, cây ăn quả), các loại rau (cà rốt, cần tây, xà lách), Cây trồng trên đồn điền (cọ dầu, cà phê) và các loại cây rừng Để biến khả năng này thành hiện thực phải giải quyết toàn bộ các vấn đề kỹ thuật và chế tạo các phương tiện nuôi trồng Vấn đề biến đổi tính di truyền trong số cây con tạo ra cần phải có sự hiểu biết sâu sắc và có biện pháp kiểm tra cẩn thận Dù sao, sử dụng quy trình này là rất hứa hẹn đối với nhiều loại cây trồng

Phát sinh phôi vô tính có thể hữu ích đối với việc tách các biến đổi tính di

truyền của các dòng vô tính bên trong tập đoàn các tế bào nhằm mục đính hoàn thiện tính di truyền của cây giống Công việc này có thể thực hiện được do nguồn

gốc tế bào đơn của phôi vô tính Tính biến đổi của các dòng vô tính đôi khi được di truyền bên trong cây nguồn xuất phát từ các hệ thống sinh callus, được cảm ứng bởi các mutagent hoặc được tạo ra bằng công nghệ gen

Phôi vô tính phát triển từ một số tế bào Điều này làm cho chúng trở thành mục tiêu hấp dẫn để thực hiện biến đổi tính di truyền Một trong những phương pháp biến đổi tính di truyền của những tế bào này là phương pháp sử dụng súng bắn gen Sự tái sinh các phôi vô tính từ những tế bào này sẽ tạo ra được những cây

có tính di truyền đã biến đổi

Quy trình tạo phôi vô tính được xác lập đối với từng kiểu gen Thông thường,

quy trình này bao gồm các giai đoạn sau đây:

+ Giai đoạn 1: Chọn cây giống có vật liệu nuôi cấy thích hợp: Việc chọn

nguồn vật liệu nuôi cấy là quyết định quan trọng nhất và đòi hỏi sự phân tích chu đáo khả năng tạo phôi của các nguồn mẫu cấy khác nhau trong cây làm giống Giai đoạn này bao gồm các công việc tạo callus, tạo huyền phù tế bào hoặc tạo protoplast bằng các phương pháp mô tả trong giáo trình này

+ Giai đoạn 2: Cảm ứng khả năng tạo phôi trong các tế bào nuôi cấy Việc

cảm ứng là rất cần thiết đối với nhóm tế bào và mẫu cấy không có khả năng tạo phôi Sự cảm ứng được thực hiện bằng cách chuyển các tế bào cần cảm ứng sang môi trường cơ bản có nồng độ auxin cao Loại auxin có hiệu quả nhất là 2,4-D hoặc hỗn hợp sữa dừa với nồng độ thấp của NAA Sau một hoặc hai tuần một số tế bào tiền phôi có thể xuất hiện Những khối tế bào và tiền phôi lớn có thể được tách

ra dựa vào sự khác biệt về kích thước để chuyển sang môi trường phân hóa Những tế bào nhỏ hơn có thể được cấy chuyền để tiếp tục sản xuất phôi vô tính

+ Giai đoạn 3:Phân hóa và sự thành thục của phôi vô tính Sau khi cảm ứng

khả năng tạo phôi vô tính trong môi trường chứa auxin, khối tế bào tiền phôi được chuyển sang môi trường cơ bản có hàm lượng nitơ cao và không chứa auxin Phôi vô tính xuất hiện từ các tế bào đơn trong khối tế bào nuôi cấy, phát triển tính phân cực và tiếp theo là quá trình giống như tạo phôi bình thường Sự phát triển có thể thay đổi về tốc độ và mức độ xuất hiện các biểu hiện không bình thường với các phôi thứ cấp hình thành trên phôi sơ cấp Tính đồng bộ và sự phát triển bình thường có thể đạt được bằng cách ly tâm theo tỷ trọng để tách các khối tiền phôi theo các kích thước khác nhau Bổ sung acid abscisic vào môi trường sẽ làm tăng tính đồng nhất và đẩy mạnh sự phát triển bình thường của phôi

+ Giai đoạn 4: Tạo cây con Các phôi vô tính thành thục có kích thước bình

thường có thể được đặt lên môi trường thạch không có bất kỳ loại auxin nào nhưng chứa cytokinin nồng đôï thấp để tái sinh cây con hoàn chỉnh

+ Giai đoạn 5:Đưa cây con ra vườn ươm Sau khi lá và rễ đã hình thành cây

con cần được đưa ra vườn ươm và chăm sóc như mọi cây con khác

Một sự tiến bộ đáng kể đã được thực hiện nhờ sáng chế và sử dụng các bình phản ứng kích thước lớn để tái sinh phôi tương tự như các thiết bị lên men hoặc thiết bị nuôi cấy số lượng lớn vi sinh vật và tế bào để tạo ra các sản phẩm công nghiệp hoặc dược liệu

Chúng ta sẽ làm quen với phương pháp nhân giống bằng cách tạo phôi vô tính trong ống nghiệm qua ví dụ đối với cây cà phê

Các phôi vô tính cà phê có màu trắng, ban đầu hình cầu nhỏ, sau đó biến đổi thành dạng tim, thủy lôi, và cuối cùng là sự xuất hiện hai lá sò xanh và hệ rễ Sự phát triển của phôi vô tính cà phê rất giống với sự phát triển của phôi hữu tính từ hạt

Phương pháp nhân giống cà phê bằng cách tạo phôi vô tính trong ống nghiệm được thực hiện như sau:

Lá cà phê từ các cây nuôi cấy in vitro được cắt thành các mảnh có kích thước 1cm2, không chứa gân chính Đặt những mẫu lá này lên trên môi trường MS, vitamin Morel, 30g/l saccharose, 10% nước dừa, 10mg/l BA ,0,1mg/l IBA và 40 mg/l adenine

Sau 50 – 60 ngày ở mép cắt xung quanh các mảnh lá xuất hiện các đốm trắng hình cầu nhỏ li ti Các lát cắt của các khối cầu này với 200-300 tế bào nhìn dưới kính hiển vi có thể thấy rõ chúng gồm các tế bào đặc trưng cho phôi (tế bào chất đậm đặc, không có không bào,nhân to)

Các phôi hình cầu có kích thước từ 1 – 2 mm được cấy vào môi trường nhân phôi với 5mg/l BA, 0,1mg/l IBA và 40ng/l adenine

Nếu nhân phôi trên môi trường rắn với 8g/l aga, số lượng phôi tăng lên khoảng 2,5 lần sau một tháng nuôi cấy

Nếu nhân phôi trong môi trường lỏng trên máy lắc 50 vòng/phút số lượng phôi tăng 7 – 8 lần sau một tháng nuôi cấy

Các phôi phát triển rễ và lá sò sẽ được cấy chuyền sang môi trường nhân giống không có chất sinh trưởng Sau 50 – 60 ngày, khi cây có 5 – 6 cặp lá có thể đưa ra vườn ươm

Do sự phát triển của phôi vô tính giống hệt như phôi hữu tính nên đã có nhiều công trình nghiên cứu tạo hạt nhân tạo từ phôi vô tính Thành tựu của công nghệ này sẽ cung cấp cho sản xuất nông nghiệp một số lượng hạt giống thuần chủng vô cùng to lớn trong một thời gian ngắn, đồng thời sẽ cho phép nhà nông gieo thẳng hạt trong vườn ươm hay trên đồng ruộng, giảm nhẹ được chi phí nhân giống trong ống nghiệm và chi phí vận chuyển Cho đến nay một số công ty đa quốc gia đã đưa thành công hạt nhân tạo của một số giống rau lai ra thị trường

Đối với cây cà phê, các nhà khoa học tại Trung tâm Công nghệ sinh học TP Hồ Chí Minh đã thành công bước đầu trong việc tạo hạt nhân tạo từ phôi vô tính của cà phê lai Arabusta bằng cách bọc phôi bằng alginate trong dung dịch CaCl2.2H2O Một tính chất quý giá của alginate là dễ dàng tạo gen Tuy nhiên vì gel alginate có tính ưa nước nên sau khi dùng nó làm vỏ bọc thì cần phải bọc tiếp bên ngoài một lớp vỏ kỵ nườc để hạt dễ bảo quản Lớp kỵ nước này được phủ bằng chitosan vốn cũng có tính tương hợp sinh học như alginate Với điện tích dương của mình, chitosan khi được sử dụng làm lớp vỏ ngoài sẽ làm cho vỏ bọc mềm khi có mặt của nước Tính bền vững của lớp vỏ bọc có thể được tăng cường bằng cách trung hòa số điện tích dương dư thừa của chitosan

III NHÂN GIỐNG BẰNG CÁCH TẠO MÔ SẸO (CALLUS)

Callus được tạo ra trên mẫu cấy in vitro để đáp lại tác dụng của các chất tạo vết thương và các chất kích thích sinh trưởng nội sinh hoặc được bổ sung vào môi trường Các mẫu cấy từ hầu như tất cả các cấu trúc hoặc bộ phận của thực vật:

chuyền liên tục với khoảng cách ba hoặc bốn tuần từ các đám tế bào nhỏ lấy từ khối callus này có thể duy trì callus trong thời gian dài

Môi trường nuôi cấy phổ biến là môi trường MS chứa một tổ hợp cân bằng các hợp chất vô cơ được pha bổ sung với môi trường Linsmaier và Skoog có thành phần hữu cơ cân đối Cả hai môi trường này đều giàu nguyên tố đa lượng, đặc biệt là nitơ, bao gồm các ion nitrate NO3- và ion ammon NH4+, saccharose và các vitamin Để bắt đầu phân chia tế bào và tạo callus tiếp theo đòi hỏi phải cung cấp cytokinin và auxin cho môi trường với tỉ lệ thích hợp Auxin với nồng độ trung bình và cao là yếu tố sinh trưởng đầu tiên được sử dụng để tạo callus Các auxin chủ yếu được sử dụng là IAA, NAA và 2,4-D theo trật tự tăng dần tính hiệu quả Cytokinin (như kinetin hoặc benzyladenine) được cung cấp với nồng độ thấp hơn nếu chúng có quá ít trong mẫu cấy

Mặc dù khối callus có bề ngoài như một khối tế bào đồng nhất, nhưng trên thực tế cấu trúc của chúng tương đối phức tạp về các bản chất hình thái, sinh lý và

di truyền Sinh trưởng của chúng tuân thủ đường cong logarit điển hình:

- Tốc độ phân chia tế bào ban đầu rất chậm, đòi hỏi phải có auxin;

- Phase phân chia tế bào rất nhanh cùng với sinh tổng hợp nhanh chóng ADN, ARN và protein;

- Tiếp theo là sự ngừng từ từ tốc độ phân chia tế bào ;

- Cuối cùng là phase phân hóa thành các nhóm tế bào nhu mô và tế bào mô dẫn

Phân chia tế bào không xảy ra với toàn bộ khối tế bào nuôi cấy mà chỉ xảy ra ban đầu ở khối tế bào sinh trưởng nằm tại lớp tế bào mặt ngoài Bộ phận bên trong của callus vẫn duy trì trạng thái không phân chia và duy trì đặc điểm sinh lý, di truyền khác với khối tế bào mặt ngoài Tốc độ phân chia của lớp tế bào bên ngoài giảm xuống và trên khối callus xuất hiện các u nhỏ do sự phân chia tế bào bị hạn chế ở những khu vực tế bào nhất định Như vậy, sự biến động về tuổi và kiểu tế bào có thể xảy ra bên trong khối callus nuôi cấy Các tế bào bên trong già hơn, các tế bào bên ngoài trẻ hơn và vẫn duy trì khả năng sinh trưởng

Sự tái sinh cây con từ callus phụ thuộc nhiều vào tỉ lệ cytokinin/auxin bổ sung vào môi trường nuôi cấy Nếu tỉ lệ này cao sẽ tạo chồi là chính, nếu ngược lại rễ sẽ hình thành, nếu tỉ lệ này cân bằng sẽ vừa tạo chồi vừa tạo rễ Trên cơ sở nguyên tắc chung này cần phải chọn tỉ lệ hai nhóm phytohormon này thích hợp cho từng loại cây trồng

Callus có tiềm năng bổ ích đối với các phương pháp nhân giống thương mại

do có tốc độ tái sinh cây con cao ở quy mô công nghiệp Tuy nhiên, trong thực tế các phương pháp này chưa được sử dụng một cách trực tiếp do trong quá trình nhân giống rất thường xảy ra hiện tượng sai lệch di truyền và biến đổi kiểu hình Vì vậy, kiểu hệ thống nuôi cấy này chủ yếu được sử dụng để tạo ra các genotype mới Sự

biến đổi tính di truyền xảy ra trong thực vật được tạo ra từ khối tế bào hoặc callus

được gọi là sự biến đổi dòng vô tính (somaclonal variation) Những biến đổi này có

thể xảy ra một cách tự nhiên hoặc được tạo ra bằng cách xử lý các tác nhân gây đột biến hoăïc bằng các kỹ thuật công nghệ gen đặc biệt

Tuy nhiên, đối với hàng loạt cây trồng việc nhân giống thông qua tạo mô sẹo đem lại kết quả rất tốt Có thể tìm hiểu kỹ thuật này qua ví dụ đối với cây mía đường

Lấy phần ngọn mía 3 – 4 tháng tuổi, bóc bỏ các bẹ già và xử lý vô trùng mẫu bằng hypochlorit canxi 5% trong 20 phút Cắt phần lá non thành từng mảnh có kích thước 0,5 x 2 cm và cấy vào môi trường MS có bổ sung 2,4D Sau 2 tuần mô sẹo sẽ hình thành

Khi đã có mô sẹo, đem cấy chuyền để mô sẹo đạt kích thước 15 – 16 mm Chọn các mô sẹo khô và chặt chuyển sang môi trường MS có bổ sung IBA và BA, đặt dưới ánh sáng huỳnh quang 2000-3000 lux Sau 1 tuần các điểm xanh xuất hiện và sau 3 – 4 tuần cây mía con hình thành, cao 2 – 3 cm, đẻ nhánh rất mạnh tạo thành cụm chồi

Khi đã có cụm chồi, cấy chuyền nhiều lần vào môi trường MS có bổ sung phối hợp giữa BA với IBA hoặc NAA với kinetin Chồi mía tiếp tục đẻ nhánh mạnh; một số chồi vươn cao thành cây mía con Tách những cây này cấy sang môi trường tạo rễ và tiếp tục chia các cụm chồi để cấy chuyền nhiều lần

IV NHÂN GIỐNG BẰNG NUÔI CẤY LÁT MỎNG

Đối với nhiều lại cây trồng để nhân giống người ta sử dụng những lát mỏng cắt từ những mô còn non như đoạn thân non, thịt quả non, củ v.v

Thí nghiệm cho thấy trong nhiều trường hợp phương pháp này cho kết quả rất tốt Một trong những trường hợp như vậy là đối với vảy hành của cây Huệ tây, hay

cây Lys (Lilium longiflorum) Chúng ta hãy làm quen với phương pháp này

Vật liệu nuôi cấy là những củ lys đã thành thục thu từ những cây khỏe mạnh không có các triệu chứng nhiễm virus

Sau khi rửa sạch củ, tách các vảy lớp ngoài và khử trùng bằng chloramin 5%, HgCl2 0,1% hay một chất khử trùng bất kỳ thường được dùng trong kỹ thuật nuôi cấy mô Sau đó rửa lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng Mỗi vảy được đặt vào một đĩa Petri vô trùng trong tủ cấy đang hoạt động và cắt theo chiều ngang thành nhiều lát dày 1 – 3 mm và cấy vào môi trường với tư thế vảy nằm ngửa (mặt trong của vảy hướng lên trên) Cần lưu ý rằng tư thế của mẫu cấy ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tái sinh cây con của lát cắt Thí nghiệm cho thấy các tư thế khác của mẫu cấy có khả năng tái sinh cây con thấp hơn nhiều Mỗi mẫu được cấy vào một ống nghiệm Nếu dùng bình tam giác 250ml thì mỗi bình có thể cấy 10 – 15 mẫu

Có thể dùng các môi trường đa lượng với mức độ dinh dưỡng khác nhau như

trường MS Tất cả các môi trường đa lượng này đều cần được bổ sung vi lượng Heller, vitamin Morel, 100mg/l inositol, 20g/l saccharose và 10g/l agar Điều kiện thuận lợi nhất cho tái sinh và sinh trưởng của cây Lys trong ống nghiệm là nhiệt độ

18 – 20oC và chế độ chiếu sáng 2500 – 3000 lux 16 giờ mỗi ngày