xác định ld50 của cá tra (pangasianodon hypophthalmus) bị nhiễm vi khuẩn edwardsiella ictaluri

T R Ư Ờ NG ĐẠIHỌCC Ầ N TH Ơ KHOA THỦY SẢN 2009 LÊ THƯỢNG KHỞI XÁC ĐỊNH LD 50 CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) BỊ NHIỄM VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN T R Ư Ờ NG ĐẠIHỌCC Ầ N TH Ơ KHOA THỦY SẢN 2009 LÊ THƯỢNG KHỞI XÁC ĐỊNH LD 50 CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) BỊ NHIỄM VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH ĐẶNG THỤY MAI THY NGUYỄN TRÚC PHƯƠNG LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Thủy Sản đặc biệt là các thầy cô thuộc bộ môn Sinh học và Bệnh học Thủy sản đã truyền đạt những kiến thức, những kinh nghiệm quý báo trong suốt quá trình em học tập và nghiên cứu tại trường. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc cô Đặng Thị Hoàng Oanh, cô Đặng Thụy Mai Thy, chị Nguyễn Trúc Phương và các anh, chị trong bộ môn đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp. Đồng thời xin gởi lời cảm ơn đến cô cố vấn Bùi Thị Bích Hằng cùng các bạn lớp Bệnh Học Thủy Sản K31 đã động viên và hỗ trợ em trong thời gian học tập cũng như thực hiện đề tài tốt nghiệp. i TÓM TẮT Đề tài “Xác định LD 50 của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri” được thực hiện bằng phương pháp tiêm vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra giống. Nhằm so sánh độc lực của các chủng vi khuẩn E. ictaluri với nhau và khảo sát sự biến đổi mô học của gan và thận cá tra khi bị nhiễm vi khuẩn E. ictaluri. 4 chủng vi khuẩn E. ictaluri được phục hồi từ trong tủ âm 80 0 C (A1, T8, CAF258 và KSL103). Sau đó tiến hành tiêm cho cá gồm 6 nghiệm thức và 3 lần lặp lại với mật độ 10con/bể. Kết quả thu được chủng A1 với tỉ lệ chết cao nhất ở tất cả các nghiệm thức đều chết 100% không xác định được LD 50 , kế đến là chủng CAF258 ở nồng độ 0,8x10 7 CFU/ml chết cao nhất 100% và thấp nhất là nồng độ 0,8x10 2 CFU/ml tỉ lệ là 6% với giá trị LD 50 = 4,7x10 2 CFU/ml. Trong khi đó chủng T8 ở nồng độ cao nhất 0,4x10 7 CFU/ml chết với tỉ lệ 83% và nồng độ thấp nhất 0,4x10 2 CFU/ml tỉ lệ chết là 23% với giá trị LD 50 = 1,3x10 4 CFU/ml, còn chủng KSL103 ở nồng độ 0,5x10 7 CFU/ml chết 93% và nồng độ 0,5x10 3 CFU/ml chết 6% với giá trị LD 50 = 2,1x10 4 CFU/ml. Quan sát mô gan của cá gây cảm nhiễm có sự biến đổi, liên kết cấu trúc tế bào gan bị phá hủy, đảo tụy và tĩnh mạch gan xung huyết. Nhiều vùng tế bào có hiện tượng xuất huyết, bị biến đổi cấu trúc và họai tử hạt. Cấu trúc ống thận bị vỡ, nhiều vùng bị xuất huyết quản cầu thận bị mất cấu trúc. ii 1 PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ Nuôi trồng thủy sản đang ngày một phát triển và trở thành một ngành có đóng góp đáng kể trong kim ngạch xuất khẩu. Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có truyền thống nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) từ rất lâu đời, cá tra được nuôi phổ biến trong ao đất và trong bè. Hiện nay cá tra đã được nuôi ở hầu hết các tỉnh trong vùng. Những năm gần đây, việc nuôi cá tra phát triển mạnh nhằm ph ục vụ tiêu thụ nội địa và cung cấp nguyên liệu cho chế biến xuất khẩu. Đặc biệt từ khi giống nhân tạo hoàn toàn được chủ động thì nghề nuôi càng ổn định và có những bước phát triển vượt bậc (Dương Nhựt Long, 2003). Từ 1996-2006, diện tích nuôi cá tra, basa tăng gấp 7 lần, sản lượng tăng 36,2 lần, từ 22.000 tấn năm 1997 đã tăng lên 800.000 tấn vào năm 2006 (Nguyễn Trọng Bình, 2008). Sản ph ẩm thủy sản không chỉ đáp ứng nhu cầu trong nước mà còn xuất khẩu ra thế giới, năm 2004 cả nước xuất khẩu thủy sản thu về 240 triệu USD và năm 2006 là 661 triệu USD. Hiện nay cá tra đã được xuất khẩu sang 80 quốc gia và vùng lãnh thổ (Bộ Thủy Sản, 2007). Để có sản lượng như thế ngoài việc tăng diện tích nuôi thì người nuôi còn tăng mật độ làm xuất hiện nhi ều loại bệnh như bệnh mủ gan, bệnh đốm đỏ, bệnh nhiễm huyết, một số bệnh nấm, kí sinh trùng. Năm 2007 ở khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long tần suất xuất hiện bệnh đốm trắng 52,80%, xuất huyết 42,50%, phù đầu, phù mắt 20,70% và vàng da 21,60%. Trong đó bệnh đốm trắng xuất hiện trên nội tạng cá tra gây thiệt hại nghiêm trọng nhất cho ng ười nuôi, bệnh này thường xuất hiện ở các tỉnh như : An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ gây hậu quả rất nghiêm trọng. Khi cá nhiễm bệnh, tỷ lệ chết tăng cao từ 10-90% có thể lên tới 100% tùy thuộc vào cách quản lý và cỡ cá nuôi (Nguyễn Quốc Thịnh và ctv, 2003). Hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về đặc điểm sinh lý, sinh hóa, khả năng gây bệnh, độc lực của vi khuẩn E. ictaluri c ũng như sự biến đổi mô học do vi khuẩn này gây ra đã được nhiều tác giả công bố. Tuy nhiên thông tin về độc lực của vi khuẩn E. ictaluri ở cá tra còn hạn chế vì vậy đề tài:“Xác định LD 50 của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri” được thực hiện. Mục tiêu của đề tài nhằm: Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn E. ictaluri có nguồn gốc khác nhau nhằm góp phần cung cấp thông tin cho những nghiên cứu về huyết học, mô bệnh học của cá tra. Mặt khác đề tài cũng góp phần vào việc chuẩn hóa phương pháp nghiên cứu bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây ra trên cá tra. 2 Nội dung nghiên cứu: 1. Thực hiện thí nghiệm cảm nhiễm xác định LD 50 của các nhóm vi khuẩn E. ictaluri có nguồn gốc phân lập khác nhau. 2. Biến đổi về cấu trúc mô học ở gan và thận của cá tra gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri. 3 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình bệnh trên cá tra Cá tra Pangasianodon hypophthalmus là loài cá da trơn nước ngọt được nuôi phổ biến ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, đặc biệt ở các tỉnh An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ. Theo thống kê của Sở tài nguyên và môi trường An Giang toàn tỉnh có 750ha đất phát sinh nuôi thủy sản năm 2007. Năm 2008, diện tích nuôi cá tra tỉnh Đồng Tháp là 1.348ha và Đồng Tháp đề ra năm 2010 diện tích vùng nuôi cá tra trong toàn tỉnh là 2.309ha, còn Cần Thơ dự kiến năm 2010 đạt di ện tích 1.300ha (www.fistnet.gov.vn). Với tốc độ phát triển nghề nuôi cá tra nhanh chóng dẫn đến chất lượng nước ngày càng xấu, môi trường luôn tồn tại mầm bệnh và bốc phát bệnh khi đủ số lượng và điều kiện thuận lợi. Theo Lê Phú Khởi (2006) tại An Giang đã ghi nhận được một số bệnh xuất hiện trên cá tra với tần suất khác nhau từ năm 2004 trở lại đây là: bệnh đốm đỏ, bệnh mủ gan, ký sinh trùng, thối đuôi, vàng da, đường ruột, nổ mắt, tuột nhớt, bỏ ăn, sưng thận, nấm, thối mang. Trong 3 bệnh đó bệnh mủ gan, đốm đỏ và kí sinh trùng xảy ra với tần suất cao nhất. Còn theo Từ Thanh Dung (2005) thì tần xuất hiện bệnh trên động vật thủy sản với vi khuẩn (50,9%), virut (24,6%), kí sinh trùng (21,1%), nấm (3,4%). Năm 2002 tỉ lệ sống của cá tra trong ao khoảng 90% năm 2004 giảm còn 85%. Nguyên nhân làm giảm tỉ lệ sống là do nguồn nước bị ô nhiễm, có nhiều bùn bã hữu cơ, nền đáy không nạo vét và nước quá bẩn dẫn đến dịch bệnh xãy ra. Bệnh xãy ra trên cá tra chủ yếu là bệnh phù đầu, xuất huyết, đỏ mỏ đỏ kỳ, mủ gan và vàng da trong đó gây thiệt hại nhiều nhất cho nghề nuôi là bệnh đốm đỏ, đỏ mỏ đỏ kỳ, xuất huyết và bệnh mủ gan. Đặc biệt là bệnh mủ gan xuất hiện quanh năm và xuất hiện nhiều vào mùa lũ. Tỉ lệ hao hút của bệnh này cũng rất cao (Nguyễn Thanh Phương và ctv, 2004). 2.2 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ở cá tra. 2.1.1 Nguyên nhân gây bệnh Bệnh mủ gan (bệnh đốm trắng trên gan, thận) xuất hiện lần đầu tiên trên cá tra nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long vào cuối năm 1998 do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra và có tên là BNP (bacillary necrosis of Pangasius) (Ferguson et al., 2001). Vi khuẩn E. ictaluri thuộc họ Enterbacteriaceae là vi khuẩn gram âm, hình que mảnh, kích thước 1x2-3µm, không sinh bào tử, là vi khuẩn yếm khí tùy tiện, phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, không [...]... tạng cá tra bị nhiễm E ictaluri 4.4 Kết quả tái phân lập và định danh vi khuẩn E ictaluri Sau khi gây cảm nhiễm, vi khuẩn được phân lập từ gan, thận và tỳ tạng của cá bệnh, sau đó vi khuẩn đã tái phân lập được tiến hành tái định danh vi khuẩn trở lại (Bảng 4.4) Vi c tái phân lập và định danh vi khuẩn là hết sức cần thiết đối với lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng Nó giúp xác định chính xác tác nhân gây bệnh... sức khỏe cá tra (Pangasius hypophthalmus) ở tỉnh An Giang Luận văn đại học, khoa thủy sản, Đại học Cần thơ 16 Lê Thị Bé Năm, 2002 Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh đốm trắng ở nội tạng cá tra Pangasianodon hypophthamus Luận văn tốt nghiệp đại học 17 Lương Trần Thục Đoan, 2006 Khảo sát sự xuất hiện của vi khuẩn gây bệnh mủ gan (Edwardsiella ictaluri) trên các cơ quan khác nhau của cá tra (Pangasianodon. .. thức 3: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 105 CFU/ml) 6 Nghiệm thức 4: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 104 CFU/ml) 7 Nghiệm thức 5: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 103 CFU/ml) 8 Nghiệm thức 6: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 102 CFU/ml) Thí nghiệm xác định LD50 được tiêm với 6 mật độ từ 103 - 108 CFU/ml đối với chủng A1 3 chủng còn lại tiêm từ 102 - 107 CFU/ml (Bảng 3.2) Bảng 3.2: Mật độ vi khuẩn E ictaluri. .. ngực của cá - Cá được kiểm tra kí sinh trùng và vi sinh trước khi tiến hành thí nghiệm - Tiêm 0,1ml cho mỗi con và không cho ăn trong suốt quá trình thí nghiệm - Thời gian theo dõi sau khi gây cảm nhiễm là 12 ngày 11 3.3.4.1 Xác định LD50 theo phương pháp của Reed và Muench (1938) Xác định LD50 để biết được khả năng gây bệnh của vi khuẩn và so sánh độc lực giữa các chủng vi khuẩn Log LD50 = Log A +... nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri trên những chủng khác nhau thì thời gian xuất hiện bệnh khác nhau Ở những nồng độ khác nhau thì tỉ lệ chết cũng khác nhau 4.1 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri 4.1.1 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri chủng A1 Sau khi gây cảm nhiễm, ở tất cả các nghiệm thức đều có cá chết với tỉ lệ rất cao và đều có dấu hiệu bệnh lý rất rõ Ở các nồng độ vi khuẩn khác... tiêm thì không có cá chết Kết quả cũng cho ta xác định được LD50 với giá trị LD50 = 2,1x104 CFU/ml Độc lực của chủng này cũng tương đối mạnh Đồ thị 4.1.4: Tỉ lệ cá chết (%) theo ngày cảm nhiễm của chủng KSL103 4.2 Thảo luận chung Sau khi gây cảm nhiễm các chủng vi khuẩn E ictaluri kết quả thu được ở những chủng vi khuẩn E ictaluri khác nhau thì thời gian xuất hiện bệnh khác nhau và ở các nồng độ khác... sọ và da E ictaluri cũng có thể xâm nhiễm qua đường tiêu hóa qua niêm mạc ruột vào máu gây nhiễm trùng máu Bằng đường này thì vi khuẩn vào mao mạch trong biểu bì gây hoại tử và mất sắc tố của da Cá da trơn còn nhiễm E ictaluri qua đường miệng gây nhiễm khuẩn ruột Bệnh tiến triển gây vi m ruột, vi m gan và vi m cầu thận trong vòng 2 tuần sau khi nhiễm bệnh (Shotts et al., 1986) Vi khuẩn E .ictaluri có... giá trị LD50 = 106,5 CFU/ml 2.5 Biến đổi mô học ở cá bệnh do vi khuẩn E ictaluri Khi cá tra bị bệnh mủ gan có nhiều biến đổi về cấu trúc mô học, gan, thận và tỳ tạng có hiện tượng xung huyết, xuất huyết và nhiều vùng hoại tử trầm trọng Vi khuẩn cũng được tìm thấy trên mẫu mô của các cơ quan này, những vi khuẩn này tạo thành bó ở rìa các vết hoại tử (Nguyễn Quốc Thịnh và ctv, 2003) Vi khuẩn E ictaluri. .. phòng bệnh nhiễm khuẩn cho cá tra, cá basa, cá mú, cá giò, cá hồng mỹ nuôi công 6 nghiệp, kết quả cho thấy ở các tỉnh như Vĩnh Long, An Giang, Đồng Tháp, đều có cá tra bi bệnh mủ gan đồng thời cũng xác định được liều gây chết 50% cá thí nghiệm (LD50) là 2,5x 104 tế bào/0,2ml /cá có trọng lượng trung bình khoảng 30gram (Bộ Thủy Sản, 2007) Trong khi đó Huỳnh Chí Thanh (2007) lại cho kết quả LD50 là 3,16x106... ngâm vi khuẩn E ictaluri với cùng một mật độ 1x108 CFU/ml thì cá nheo chết là 32%, 75% đối với cá hồi trắng và 5% đối với cá vược sọc, theo dõi trong 14 ngày Mà là vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể của ký chủ tạo bệnh hay không, ở mức nào còn tùy thuộc vào khả năng gây bệnh của vi khuẩn đối với ký chủ và điều kiện tác động Trong 4 chủng vi khuẩn đem gây cảm nhiễm thì có 3 chủng T8, CAF258, KSL103 là xác định . Xác định LD 50 của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri được thực hiện bằng phương pháp tiêm vi khuẩn E. ictaluri. khuẩn E. ictaluri ở cá tra còn hạn chế vì vậy đề tài: Xác định LD 50 của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri