xác định ld50 của cá tra (pangasianodon hypophthalmus) bị nhiễm vi khuẩn edwardsiella ictaluri

Trong đó bệnh đốm trắng xuất hiện trên nội tạng cá tra gây thiệt hại nghiêm trọng nhất cho người nuôi, bệnh này thường xuất hiện ở các tỉnh như : An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ gây hậu q

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

BỊ NHIỄM VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

BỊ NHIỄM VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Ts ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH ĐẶNG THỤY MAI THY NGUYỄN TRÚC PHƯƠNG

LỜI CẢM TẠ

Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Thủy Sản đặc biệt là các thầy cô thuộc bộ môn Sinh học và Bệnh học Thủy sản đã truyền đạt những kiến thức, những kinh nghiệm quý báo trong suốt quá trình em học tập và nghiên cứu tại trường

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc cô Đặng Thị Hoàng Oanh, cô Đặng Thụy Mai Thy, chị Nguyễn Trúc Phương và các anh, chị trong bộ môn đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp Đồng thời xin gởi lời cảm ơn đến cô cố vấn Bùi Thị Bích Hằng cùng các bạn lớp Bệnh Học Thủy Sản K31 đã động viên và hỗ trợ em trong thời gian học tập cũng như thực hiện đề tài tốt nghiệp

i

TÓM TẮT

Đề tài “Xác định LD50 của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị nhiễm

vi khuẩn Edwardsiella ictaluri” được thực hiện bằng phương pháp tiêm vi

khuẩn E ictaluri trên cá tra giống Nhằm so sánh độc lực của các chủng vi khuẩn E ictaluri với nhau và khảo sát sự biến đổi mô học của gan và thận cá tra khi bị nhiễm vi khuẩn E ictaluri 4 chủng vi khuẩn E ictaluri được phục

hồi từ trong tủ âm 800C (A1, T8, CAF258 và KSL103) Sau đó tiến hành tiêm cho cá gồm 6 nghiệm thức và 3 lần lặp lại với mật độ 10con/bể Kết quả thu được chủng A1 với tỉ lệ chết cao nhất ở tất cả các nghiệm thức đều chết 100% không xác định được LD50, kế đến là chủng CAF258 ở nồng độ 0,8x107

CFU/ml chết cao nhất 100% và thấp nhất là nồng độ 0,8x102 CFU/ml tỉ lệ là 6% với giá trị LD50 = 4,7x102 CFU/ml Trong khi đó chủng T8 ở nồng độ cao nhất 0,4x107 CFU/ml chết với tỉ lệ 83% và nồng độ thấp nhất 0,4x102 CFU/ml

tỉ lệ chết là 23% với giá trị LD50 = 1,3x104 CFU/ml, còn chủng KSL103 ở nồng độ 0,5x107 CFU/ml chết 93% và nồng độ 0,5x103 CFU/ml chết 6% với giá trị LD50 = 2,1x104 CFU/ml

Quan sát mô gan của cá gây cảm nhiễm có sự biến đổi, liên kết cấu trúc tế bào gan bị phá hủy, đảo tụy và tĩnh mạch gan xung huyết Nhiều vùng tế bào có hiện tượng xuất huyết, bị biến đổi cấu trúc và họai tử hạt Cấu trúc ống thận bị

vỡ, nhiều vùng bị xuất huyết quản cầu thận bị mất cấu trúc

ii

PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ

Nuôi trồng thủy sản đang ngày một phát triển và trở thành một ngành có đóng góp đáng kể trong kim ngạch xuất khẩu Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL)

có truyền thống nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) từ rất lâu đời, cá

tra được nuôi phổ biến trong ao đất và trong bè Hiện nay cá tra đã được nuôi ở hầu hết các tỉnh trong vùng Những năm gần đây, việc nuôi cá tra phát triển mạnh nhằm phục vụ tiêu thụ nội địa và cung cấp nguyên liệu cho chế biến xuất khẩu Đặc biệt từ khi giống nhân tạo hoàn toàn được chủ động thì nghề nuôi càng ổn định và có những bước phát triển vượt bậc (Dương Nhựt Long, 2003)

Từ 1996-2006, diện tích nuôi cá tra, basa tăng gấp 7 lần, sản lượng tăng 36,2 lần, từ 22.000 tấn năm 1997 đã tăng lên 800.000 tấn vào năm 2006 (Nguyễn Trọng Bình, 2008) Sản phẩm thủy sản không chỉ đáp ứng nhu cầu trong nước

mà còn xuất khẩu ra thế giới, năm 2004 cả nước xuất khẩu thủy sản thu về 240 triệu USD và năm 2006 là 661 triệu USD Hiện nay cá tra đã được xuất khẩu

thế ngoài việc tăng diện tích nuôi thì người nuôi còn tăng mật độ làm xuất hiện

nhiều loại bệnh như bệnh mủ gan, bệnh đốm đỏ, bệnh nhiễm huyết, một số

bệnh nấm, kí sinh trùng

trắng 52,80%, xuất huyết 42,50%, phù đầu, phù mắt 20,70% và vàng da 21,60% Trong đó bệnh đốm trắng xuất hiện trên nội tạng cá tra gây thiệt hại nghiêm trọng nhất cho người nuôi, bệnh này thường xuất hiện ở các tỉnh như :

An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ gây hậu quả rất nghiêm trọng Khi cá nhiễm bệnh, tỷ lệ chết tăng cao từ 10-90% có thể lên tới 100% tùy thuộc vào cách

công trình nghiên cứu về đặc điểm sinh lý, sinh hóa, khả năng gây bệnh, độc

lực của vi khuẩn E ictaluri cũng như sự biến đổi mô học do vi khuẩn này gây

ra đã được nhiều tác giả công bố Tuy nhiên thông tin về độc lực của vi khuẩn

E ictaluri ở cá tra còn hạn chế vì vậy đề tài:“Xác định LD50 của cá tra

(Pangasianodon hypophthalmus) bị nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri”

được thực hiện

Mục tiêu của đề tài nhằm: Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn E

ictaluri có nguồn gốc khác nhau nhằm góp phần cung cấp thông tin cho những

nghiên cứu về huyết học, mô bệnh học của cá tra Mặt khác đề tài cũng góp

phần vào việc chuẩn hóa phương pháp nghiên cứu bệnh do vi khuẩn E ictaluri

gây ra trên cá tra

Nội dung nghiên cứu:

E ictaluri có nguồn gốc phân lập khác nhau

2 Biến đổi về cấu trúc mô học ở gan và thận của cá tra gây cảm nhiễm vi

khuẩn E ictaluri

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình bệnh trên cá tra

Cá tra Pangasianodon hypophthalmus là loài cá da trơn nước ngọt được nuôi

phổ biến ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, đặc biệt ở các tỉnh An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ Theo thống kê của Sở tài nguyên và môi trường An Giang toàn tỉnh có 750ha đất phát sinh nuôi thủy sản năm 2007 Năm 2008, diện tích nuôi cá tra tỉnh Đồng Tháp là 1.348ha và Đồng Tháp đề ra năm 2010 diện tích vùng nuôi cá tra trong toàn tỉnh là 2.309ha, còn Cần Thơ dự kiến năm 2010 đạt

diện tích 1.300ha (www.fistnet.gov.vn)

Với tốc độ phát triển nghề nuôi cá tra nhanh chóng dẫn đến chất lượng nước ngày càng xấu, môi trường luôn tồn tại mầm bệnh và bốc phát bệnh khi đủ số lượng và điều kiện thuận lợi Theo Lê Phú Khởi (2006) tại An Giang đã ghi nhận được một số bệnh xuất hiện trên cá tra với tần suất khác nhau từ năm

2004 trở lại đây là: bệnh đốm đỏ, bệnh mủ gan, ký sinh trùng, thối đuôi, vàng

da, đường ruột, nổ mắt, tuột nhớt, bỏ ăn, sưng thận, nấm, thối mang Trong 3 bệnh đó bệnh mủ gan, đốm đỏ và kí sinh trùng xảy ra với tần suất cao nhất Còn theo Từ Thanh Dung (2005) thì tần xuất hiện bệnh trên động vật thủy sản với vi khuẩn (50,9%), virut (24,6%), kí sinh trùng (21,1%), nấm (3,4%)

Năm 2002 tỉ lệ sống của cá tra trong ao khoảng 90% năm 2004 giảm còn 85% Nguyên nhân làm giảm tỉ lệ sống là do nguồn nước bị ô nhiễm, có nhiều bùn bã hữu cơ, nền đáy không nạo vét và nước quá bẩn dẫn đến dịch bệnh xãy ra Bệnh xãy ra trên cá tra chủ yếu là bệnh phù đầu, xuất huyết, đỏ mỏ đỏ kỳ, mủ gan và vàng da trong đó gây thiệt hại nhiều nhất cho nghề nuôi là bệnh đốm đỏ,

đỏ mỏ đỏ kỳ, xuất huyết và bệnh mủ gan Đặc biệt là bệnh mủ gan xuất hiện quanh năm và xuất hiện nhiều vào mùa lũ Tỉ lệ hao hút của bệnh này cũng rất

cao (Nguyễn Thanh Phương và ctv, 2004)

2.2 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ở cá tra

2.1.1 Nguyên nhân gây bệnh

Bệnh mủ gan (bệnh đốm trắng trên gan, thận) xuất hiện lần đầu tiên trên cá tra nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long vào cuối năm 1998 do vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri gây ra và có tên là BNP (bacillary necrosis of Pangasius)

(Ferguson et al., 2001) Vi khuẩn E ictaluri thuộc họ Enterbacteriaceae là vi

khuẩn gram âm, hình que mảnh, kích thước 1x2-3µm, không sinh bào tử, là vi khuẩn yếm khí tùy tiện, phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, không

oxy hóa, lên men trong môi trường O/F glucose Thường gặp hai loài là E

ictaluri và E tarda (Bùi Quang Tề và ctv, 2004)

E ictaluri tăng trưởng chậm trên môi trường nuôi cấy, cần từ 36-48 giờ ở

1999) Vi khuẩn có thể phân lập từ mẫu cá bệnh (gan, thận, tỳ tạng) trên môi trường Trytone Soya Agar (TSA) hoặc Eosine Methylene blue lactase Agar

rìa có dạng không đồng nhất (Từ Thanh Dung và ctv, 2004)

2.1.2 Đường lây lan

Bệnh thường xảy ra nhiều vào mùa mưa lũ kéo dài đến mùa khô Thời điểm phát triển bệnh và mức độ thiệt hại khác nhau theo từng năm (Nguyễn Quốc

Thịnh và ctv, 2003)

E ictaluri có thể nhiễm cho cá bằng 2 đường khác nhau Vi khuẩn trong nước

có thể qua đường mũi của cá xâm nhập vào cơ quan khứu giác và di chuyển vào dây thần kinh khứu giác, sau đó vào não Bệnh lan rộng từ màng não đến

sọ và da E ictaluri cũng có thể xâm nhiễm qua đường tiêu hóa qua niêm mạc

ruột vào máu gây nhiễm trùng máu Bằng đường này thì vi khuẩn vào mao

mạch trong biểu bì gây hoại tử và mất sắc tố của da Cá da trơn còn nhiễm E

ictaluri qua đường miệng gây nhiễm khuẩn ruột Bệnh tiến triển gây viêm ruột,

viêm gan và viêm cầu thận trong vòng 2 tuần sau khi nhiễm bệnh (Shotts et al., 1986) Vi khuẩn E.ictaluri có thể tồn tại trong môi trường nước một tuần và

trong bùn đáy khoảng một tháng (Francis-Floyd, 1996)

thuộc vào cách quản lý và cỡ cá nuôi (Từ Thanh Dung và ctv, 2004).

2.3 Lịch sử bệnh mủ gan trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

Bệnh mủ gan xuất hiện lần đầu tiên ở đồng bằng sông Cửu Long vào cuối năm

1998 trên cá tra nuôi và có tên la Bacillary necrosis of Pangasius – BNB với

dấu hiệu bệnh có nhiều nốt trắng trên gan (Ferguson et al., 2001) Trong 10

năm gần đây đã trở thành một bệnh phổ biến, gây thiệt hại lớn về kinh tế ở các vùng nuôi cá tra thâm canh

Theo nghiên cứu trước đây cho rằng bệnh mủ gan không tìm thấy trên đối

tượng cá basa mà chỉ xuất hiện trên cá tra, theo Ferguson et al., (2001) giải

thích nguyên nhân có thể là kết quả của sự khác biệt về tính nhạy cảm của loài (trích dẫn bởi Phan Thị Mỹ Hạnh, 2004; Lê Thị Bé Năm, 2002) Nhưng kết quả nghiên cứu gần đây cho rằng bệnh mủ gan, thỉnh thoảng xuất hiện trên cá basa bệnh xuất hiện tất cả các giai đoạn của cá tra (Từ Thanh Dung, 2005) Tỉ lệ hao hụt lớn ở cá tra giống nhưng gây thiệt hại kinh tế lớn nhất ở giai đoạn cá đạt trọng lượng khoảng 300-500g

Hiện nay bệnh mủ gan thường lây lan theo chiều ngang trực tiếp từ cá bệnh

sang cá khỏe, qua phân và qua môi trường nước Vi khuẩn E ictaluri sống

trong môi trường nước ao từ 1-2 tuần, trong bùn đáy ao và cây cỏ thủy sinh, vi

dài, chi phí điều trị tốn kém và lưu giữ mầm bệnh trong bùn đến vụ sau, nếu không cải tạo ao đúng các bệnh sẽ dễ dàng tái phát trở lại khi gặp điều kiện thuận lợi (Từ Thanh Dung, 2005)

Hiện nay phương pháp xác định vi khuẩn E ictaluri gây bệnh trên cá tra phổ

biến là phương pháp truyền thống, sử dụng bộ kit API 20E, phương pháp PCR Trong đó phương pháp truyền thống đã được ứng dụng từ rất lâu có thể kiểm tra đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn nhưng cần thời gian khá lâu để đọc kết quả Trong khi đó bộ kit API 20E lại cho kết quả nhanh chóng và dễ thực hiện nhưng nhược điểm là chỉ định danh được vi khuẩn gram âm, hình que (Từ

Thanh Dung và ctv, 2004) Ứng dụng PCR để định danh vi khuẩn E ictaluri là

một trong những phương pháp hiện đại giúp phát hiện nhanh ADN của vi khuẩn nhưng không phát hiện sự tạp nhiễm trong mẫu phân tích Đặng Thị

Hoàng Oanh và ctv (2008) đã ứng dụng thành công phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn E ictaluri gây bệnh trên cá tra cho kết quả dương tính ở 407 bp

2.4 Một số thí nghiệm gây cảm nhiễm Edwardsiella ictaluri

Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri đã được nhiều tác giả nghiên cứu

cũng như công bố không chỉ trên cá tra mà còn trên nhiều đối tượng khác Có nhiều phương pháp gây cảm nhiễm như: tiêm, tắm, ngâm

Baxa et al (1990) cho rằng vi khuẩn E ictaluri gây chết ở các loài cá khác

nhau thì tỉ lệ chết khác nhau: cá nheo là 32%, cá hồi trắng 75% và 5% đối với

là 14 ngày

Francis – Floyed (1996) thì cho rằng vi khuẩn E ictaluri nhiễm trên cá nheo

bị sốc do nuôi trong bể trước khi tiếp xúc E ictaluri, tỉ lệ chết là 97% ở lô cá bị

sốc và 77% ở lô cá không có sốc

Theo Lương Trần Thục Đoan (2006) khi gây cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri

đó bệnh do vi khuẩn này xảy ra trên cá da trơn thường rơi vào mùa có nhiệt độ thấp

Thí nghiệm của Phan Thị Mỹ Hạnh (2004) khi tiến hành ngâm vi khuẩn E

ictaluri ở mật độ 1,5x102 và 1,5x103 CFU/ml thì tỉ lệ cá chết dao động từ 56,6% đến 96,7% Bên cạnh đó Tiết Ngọc Trân (2007) cũng ngâm với 2 dòng

phân tích thì ruột là cơ quan cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn E ictaluri cao

nhất, kế đến là thận, tỳ tạng, gan

Năm 2007, Lê Minh Đương cũng tiến hành thí nghiệm trên cá tra bằng phương pháp ngâm với 2 dòng vi khuẩn EH02 & E223 kết quả cho thấy tỉ lệ nhiễm của dòng vi khuẩn EHO2 cao nhất là ở tỳ tạng (92,5%), thấp nhất là não (27,5%) Trong khi đó, lô E223 thì tỉ lệ cảm nhiễm cao nhất là lớp nhớt trên da (80%) và thấp nhất là mang (2,5%) Nghiên cứu này cũng xác định được tỉ lệ cá chết dao

CFU/ml thì cá chết vào ngày thứ 2 và tỉ lệ chết dao động từ 66,7-100%

Gần đây Viện nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II đã kết hợp với công ty thuốc thú y TW (Navetco) thực hiện đề tài cấp nhà nước nghiên cứu vaccine phòng

nghiệp, kết quả cho thấy ở các tỉnh như Vĩnh Long, An Giang, Đồng Tháp, đều

có cá tra bi bệnh mủ gan đồng thời cũng xác định được liều gây chết 50% cá

30gram (Bộ Thủy Sản, 2007) Trong khi đó Huỳnh Chí Thanh (2007) lại cho

(cá tra bệnh mủ gan ở An Giang) sau đó gây cảm nhiễm trở lại với 4 mật độ

vào ngày thứ 2 và thứ 3 với tỉ lệ chết 91,66%

Theo Ngô Minh Dung (2007) khi tiêm E ictaluri với 4 mật độ khác nhau, kết

2.5 Biến đổi mô học ở cá bệnh do vi khuẩn E ictaluri

Khi cá tra bị bệnh mủ gan có nhiều biến đổi về cấu trúc mô học, gan, thận và tỳ tạng có hiện tượng xung huyết, xuất huyết và nhiều vùng hoại tử trầm trọng Vi khuẩn cũng được tìm thấy trên mẫu mô của các cơ quan này, những vi khuẩn

này tạo thành bó ở rìa các vết hoại tử (Nguyễn Quốc Thịnh và ctv, 2003)

Vi khuẩn E ictaluri đã được Hawke et al (1981) phân lập từ cơ quan thận sau

và tỳ tạng của cá nheo Mỹ có dấu hiệu nhiễm bệnh nhiễm trùng máu cấp tính (ESC) Cá nheo Mỹ bị bệnh này thường có vết loét trên đầu, bị sưng viêm và xuất huyết trong da ở phần mõm Bên cạnh dó còn xuất hiện dấu hiệu hoại tử tạo thành những đốm hình cầu màu trắng và hiện tượng xuất huyết trên gan

Ngoài ra, Ferguson et al (2001) cũng cho thấy có sự tổn thương trên gan, thận,

tỳ tạng và một vài vùng trên cơ của cá tra P hypophthalmus Tỳ tạng có nhiều

vùng hoại tử lan rộng ở nhu mô

PHẦN 3:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm

- Thời gian: tháng 01/2009 đến 06/2009

Bệnh Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, trường Đại Học Cần Thơ

3.2 Vật liệu nghiên cứu

Dụng cụ thí nghiệm

Que cấy, đèn cồn, hộp quẹt, ống nghiệm, đĩa petri thủy tinh, micropipet 1ml, 5ml, hộp đầu col 1ml, 5ml, chai 100ml, 250ml, 500ml, lame, lamen, viết lông dầu, viết chì, bình xịt cồn, sổ ghi chép…

Hóa chất thí nghiệm

KOH, amyl alcohol, ethanol, axit sulphanilic, axit acetic, dầu paraffin, oxidase

Môi trường

Tryptic soy agar (TSA), Nutrient agar (NA), Nutrient broth (NB)

Thiết bị

thống thí nghiệm), máy sục khí, ống sục khí, đá bọt, tủ ấm, nồi thanh trùng, máy ly tâm, máy so màu quang phổ, máy trộn mẫu (vortex) Các dụng cụ và thiết bị cần thiết cho nghiên cứu…

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Chuẩn bị hệ thống bể

Bể Composite được vệ sinh kỹ bằng xà phòng và chlorin 200ppm, phơi khô Sau đó cấp nước vào:

trước khi thí nghiệm Bể được đặt ngoài trời có mái che (tránh mưa)

- Đối với bể thí nghiệm 35L thì cấp khoảng nước, sục khí Bể được đặt

- Nguồn nước sử dụng là nguồn nước máy

- Các dụng cụ thí nghiệm như: xô, dợt, ống sục khí, đá bọt…cũng được vệ sinh kỹ

Thủy sản, Khoa thủy sản, Trường Đại học Cần thơ (Bảng 3.1)

Bảng 3.1: Các chủng vi khuẩn sử dụng gây cảm nhiễm

STT Chủng vi khuẩn Năm thu mẫu Nguồn gốc

4 CAF258 2006 Châu Phú - An Giang

Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn

sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, nhuộm gram kiểm tra tính thuần của vi khuẩn

Chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm

Nuôi tăng sinh vi khuẩn: sau khi có được đĩa vi khuẩn thuần, dùng que cấy tiệt trùng lấy khoảng 2 đến 3 khuẩn lạc cho vào chai chứa khoảng 30ml NB đã tiệt trùng, đặt lên máy lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ

Sau 24 giờ chuyển vi khuẩn sang ống falcol 50ml tiệt trùng, đem ly tâm 4000

dùng nước muối sinh lý tiệt trùng để rửa vi khuẩn (lặp lại 2-3 lần)

Lần ly tâm cuối, loại bỏ phần dung dịch phía trên và cho vào khoảng 25ml dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng, sau đó trộn đều mẫu bằng máy vortex Tiến hành xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ với bước sóng 610nm và điều chỉnh OD tương ứng để xác định mật độ vi khuẩn

Hình 3.1: Sơ đồ chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm

3.3.4 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri ở cá tra

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức và nghiệm thức đối chứng không tiêm và tiêm nước muối sinh lý, mỗi nghiệm thức lặp lại

3 lần với mật độ 10 con/bể

1 Nghiệm thức không tiêm

2 Nghiệm thức đối chứng: Tiêm nước muối sinh lý

Bảng 3.2: Mật độ vi khuẩn E ictaluri (CFU/ml) gây cảm nhiễm

- Cá mua về được thuần hóa 1 tuần thì tiến hành tiêm vi khuẩn cho cá ở các mật

độ vi khuẩn và tiêm ở gốc vi ngực của cá

- Cá được kiểm tra kí sinh trùng và vi sinh trước khi tiến hành thí nghiệm

- Tiêm 0,1ml cho mỗi con và không cho ăn trong suốt quá trình thí nghiệm

- Thời gian theo dõi sau khi gây cảm nhiễm là 12 ngày

3.3.4.1 Xác định LD 50 theo phương pháp của Reed và Muench (1938)

- Phân lập vi khuẩn ở 3 cơ quan: gan, thận và tỳ tạng

trên môi trường TSA/NA, nhuộm gram, xác định hình dạng vi khuẩn, khả năng

di động của vi khuẩn

Các chỉ tiêu sinh lý

Kiểm tra phản ứng oxidase, catalase

Các chỉ tiêu sinh hóa

Khả năng lên men và oxy hóa đường glucose (O/F), khả năng tạo acid từ các loại đường: mannose, glucose, sucrose, galactose, mannitol, maltose, sorbitol,

dụng citrate, sử dụng urea, khả năng thủy phân gelatine, thủy phân starch, thủy phân Tween 80 Phản ứng tạo nitrite từ nitrate, phản ứng VP, MR, khả năng kết hợp crystal violet và khả năng phát triển ở các nồng độ muối khác nhau

50% - %d

%t - %d

3.3.5 Mô học

Cố định mẫu: Mẫu gan và thận được cố định trong dung dịch formol trung

70% để bảo quản và xử lý mẫu

Cắt tỉa và định hướng: Mẫu trước khi đưa vào qui trình xử lý mẫu phải cắt tỉa

và định hướng cho mẫu đạt kích cỡ phù hợp, cắt mẫu với độ dày từ 5-7mm Đưa mẫu vào catsset và tiến hành xử lý

Qui trình xử lý mẫu: Qui trình xử lý mẫu được thực hiện trên máy Tisue

processing (phụ lục 4)

Loại nước: Mục đích của lọai nước nhằm đảm bảo loại hết nước trong mẫu mô

mà không làm tế bào bị biến dạng hoặc không làm vị trí thành phần cấu tạo tế bào trong mẫu mô không bị thay đổi Qúa trình loại nước được thực hiện bằng cách cho mẫu qua nhiều dung dịch cồn với nồng độ gia tăng từ 70% đến 100% Thời gian khử nước phụ thuộc vào độ dày của mẫu mô

Làm trong mẫu: Vì cồn không thể hòa lẫn với paraffin nên sau khi khử nước

thì cồn cũng được loại ra khỏi mẫu Nếu không loại bỏ hết cồn, phần mô đó sẽ

bị co rút lại, khối mẫu đúc trong paraffin sẽ không đồng nhất, tạo nên những lổ hỗng trên lát cắt Do đó làm ngấm vào trong mẫu mô dung môi trung gian (xylen) có thể hòa tan được cồn và paraffin

Tẩm paraffin: Paraffin là chất nền để bảo đảm cho tế bào giữ nguyên được

hình dạng khi cắt Sau khi làm trong, mẫu mô sẽ được ngấm paraffin nóng chảy (57- 600C)

Đúc khối: Mục đích của việc đúc khuôn là làm cho mẫu mô nằm trong khối

rắn để cắt lát mỏng Chất nền để đúc khuôn là paraffin: sáp ong nóng chảy với

tỉ lệ 7:3 Sau khi mẫu mô đã vùi vững chắc vào paraffin làm rắn paraffin lại bằng cách đặt khuôn trong tủ lạnh, sau đó tách khối paraffin ra khỏi khuôn

Cắt mẫu: Sử dụng máy microtome để cắt mẫu, lát cắt có độ dày là 2 µm Mẫu

ra, dùng kim mũi giáo nhẹ nhàng tách riêng từng đoạn mẫu đạt yêu cầu

Dán mẫu lên lame: Dung dịch keo để dán mẫu là Mayer's albumin Thoa dung

nâng từ từ lên, lát cắt sẽ được dán chặt vào phiến kính Sau khi dán, làm khô

Nhuộm mẫu (Harris's Haematoxylin & Eosin): mẫu được nhuộm theo qui

trình trình bày trong phụ lục 4

Dán lamelle vào lame: Để đảm bảo mẫu được giữ lâu và tăng tính chiết quang

của mẫu, dùng keo Enterlan phủ lên mẫu và dán lamelle lên mẫu Nhỏ một giọt

từ từ để tránh bọt khí

Đọc kết quả: Tiêu bản được quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 10x để quan

sát tổng quát tiêu bản nếu tiêu bản đẹp đạt yêu cầu có nhân bắt màu tím xanh của Hematoxylin, phần còn lại bắt màu hồng Eosin Các tiêu bản đẹp sẽ được quan sát lần lượt ở độ phóng đại 40x,100x (nhỏ giọt dầu) và chụp hình tiêu bản đặc trưng

3.3.6 Xử lý số liệu

Các số liệu được thu thập và xử lý bằng phần mềm Excel

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Sau khi thực hiện thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri trên những

chủng khác nhau thì thời gian xuất hiện bệnh khác nhau Ở những nồng độ

khác nhau thì tỉ lệ chết cũng khác nhau

4.1 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri

4.1.1 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri chủng A1

Sau khi gây cảm nhiễm, ở tất cả các nghiệm thức đều có cá chết với tỉ lệ rất cao

và đều có dấu hiệu bệnh lý rất rõ Ở các nồng độ vi khuẩn khác nhau thì thời

điểm xuất hiện bệnh cũng khác nhau (Đồ thị 4.1.1)

Đồ thị 4.1.1: Tỉ lệ cá chết (%) theo ngày cảm nhiễm của chủng A1

Qua đồ thị 4.1.1 cho thấy vào ngày thứ 2 ở tất cả các nghiệm thức đều có cá

chết ngoại trừ bể đối chứng tiêm nước muối sinh lý Sau 12 ngày thí nghiệm tất

cả các nghiệm thức đều chết (100%), bể đối chứng tiêm nước muối sinh lý chết

(39%) riêng bể đối chứng không tiêm thì không có cá chết Do chủng A1 tỉ lệ

4.1.2 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri chủng T8

Đồ thị 4.1.2: Biểu hiện tỉ lệ cá chết (%) theo ngày cảm nhiễm của chủng T8

Kết quả Đồ thị 4.1.2 cho thấy cá bắt đầu chết vào ngày thứ 3 ở nghiệm thức

các nghiệm thức đều có cá chết ngoại trừ bể đối chứng Sau 12 ngày thí nghiệm

chết với tỉ lệ lần lượt là 67%; 57%; 43% và 37% Riêng bể tiêm nước muối sinh lý cũng có cá chết nhưng tỉ lệ không cao 17%, bể không tiêm thì không có

cá chết

4.1.3 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri chủng CAF258

Sau khi gây cảm nhiễm chủng CAF258 cho kết quả rất tốt giữa các nghiệm thức khác nhau thì tỉ lệ chết khác nhau (Đồ thị 4.1.3)

Đồ thị 4.1.3: Tỉ lệ cá chết (%) theo ngày cảm nhiễm của chủng CAF258

tỉ lệ chết lần lượt là 63% và 73% Bể đối chứng tiêm nước muối và bể không tiêm đều không có cá chết trong suốt qua trình thí nghiệm

Cũng như chủng T8 sau khi gây cảm nhiễm chủng CAF258 cho kết quả xác

có động lực khá mạnh

4.1.4 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri chủng KSL103

Cũng giống như chủng CAF258 chủng KSL103 sau khi gây cảm nhiễm ở các nghiệm thức khác nhau tỉ lệ chết khác nhau (Đồ thị 4.1.4) Đồ thị trên cho thấy

CFU/ml nhưng sự chênh lệch cũng không lớn có thể chấp nhận được Sau khi

gây cảm nhiễm cá chết tập trung vào ngày 3 và 4 riêng bể đối chúng tiêm nước

muối và không tiêm thì không có cá chết

Độc lực của chủng này cũng tương đối mạnh

Đồ thị 4.1.4: Tỉ lệ cá chết (%) theo ngày cảm nhiễm của chủng KSL103

4.2 Thảo luận chung

Sau khi gây cảm nhiễm các chủng vi khuẩn E ictaluri kết quả thu được ở

những chủng vi khuẩn E ictaluri khác nhau thì thời gian xuất hiện bệnh khác

nhau và ở các nồng độ khác nhau tỉ lệ chết cũng khác nhau

E ictaluri chủng A1 vào ngày thứ 2 ở tất cả các nồng độ vi khuẩn đều có cá

thí nghiệm gây cảm nhiễm tiêm vi khuẩn này trên cá tra giống của Lương Trần

CFU/ml là ngày thứ 3 Trong khi đó Ngô Minh Dung (2007) cũng sử dụng E

ictaluri tiêm cho cá tra thì cho kết quả cá bắt đầu chết vào ngày thứ 2 ở 108