bài báo cáo công nghệ enzyme và protein

      !"#! ! $%&#' $&(  )*+, /0-123/44   MỤC LỤC Trang 2   4$5&67!!89 4 +:-+;-<+=>+?2@-AB2@<@CC:CDE@*+F a. Thực hành. - Cân 5 g CPE cho vào cốc và tách bằng nước với tỉ lệ là 1:5, tức 5 g + 25 ml nước cất. - Khuấy đều trong thời gian 30 phút. - Lọc lấy dịch chiết và được thể tích là 21 ml. - Tủa bằng cồn lạnh với tỷ lệ 1:3, tức 21 ml dịch chiết + 63 ml cồn lạnh. - Cho hỗn hợp dung dịch trên vào bình erlen và giữ lạnh 30 phút. - Tách lấy phần tủa ở phần dưới bình với thể tích là 25 ml và cho vào ống ly tâm 50 ml. - Đem cân phân tích được 33.4 g. - Ly tâm 3000 vòng trong 10 phút. - Tách lấy protein tủa, giữ lạnh để xác định hàm lượng protein và hoạt tính enzyme trước sắc ký. b. Kết quả. Hình 1: Dịch chiết trong bình erlen Trang 3   Hình 2: Dịch tủa protein trong ống ly tâm 50 ml 3 G HIJ >KD*@L-<+:?- a. Thực hành. • Hóa chất - Dung dịch mẫu protein, cụ thể trong bài này là mẫu enzyme cellulose cần xác định. - Dung dịch albumin 0.1mg/ml: Cân chính xác 10mg albumine pha trong 100ml nước cất. Lắc đều cho tan. Giữ ở 20 0 C. Khi dùng pha loãng 100 lần, được dung dich albumine có nồng độ 0,01mg/ml. - Dung dịch thuốc thử Bradford :  Coomassie Brilliant blue : 0,001g  Ethanl tuyệt đối 4,7g Trang 4    Acid photphoric 85%: 8,5g. - Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue được làm tan trong ethanol trong chai đựng có nắp, bổ sung acid photphoric 85% và chỉnh tới 100ml bằng nước cất. • Thiết bị : máy quang phổ. b. Lập đồ thị chuẩn. Để dung dich albumine chuẩn có các nồng độ từ 10-50 µg/ml ta thực hiện như sau: - Dựng đường chuẩn protein( Albumine): Số ống Đối chứng 1 2 3 4 5 Nồng độ albumin (µg) 0 10 20 30 40 50 V(ml) albumin 0 1 1 1 1 1 H 2 O (ml) 1 0 0 0 0 0 Thuốc thử Coomassie 2 2 2 2 2 2 c. Kết quả. • Quan sát bằng mắt thường, theo thứ tự từ phải sang trái ta thấy: ống đối chứng có màu xanh nhạt nhất, và các ống thí nghiệm từ ống số 1 đến ống số 5 có màu xanh đậm dần như hình 3. Hình 3: Kết quả so màu. • Kết quả đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 595 nm: Trang 5   Số ống Đối chứng 1 2 3 4 5 OD 0 0.088 0.131 0.161 0.188 0.209 • Dựng đường protein chuẩn. Dựa vào kết quả đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 595 nm, ta dựng được đường protein chuẩn như sau: d. Nhận xét kết quả: • Dựa vào kết quả so màu ta thấy, nồng độ albumin càng cao thì màu xanh càng đậm. • Dựa vào kết quả đo độ hấp thụ (OD) ta thấy, nồng độ albumin càng cao thì chỉ số OD càng cao. 3. G HIJ <+:?-<MNHIJ .C:<DE@. a. Thực hành. • Hóa chất - Cồn 96 0 C - Sodium acetate - Acid acetic 1M - Cơ chất - Dung dich cơ chất CMC pH5 Trang 6   - Dung dịch acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic (DNS) - Dung dịch lactose - Dung dịch DNS-lactose - Dung dịch enzyme • Dụng cụ và thiết bị - Máy ly tâm. - Bộ ổn nhiệt, máy đo quang phổ, máy Vortex, pH kế, cân phân tích. - Bếp điện. - Chậu nước lạnh. - Que khuấy thủy tinh. b. Lập đồ thị chuẩn • Hòa tan 100 ml glucose monohydrate với 80 ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều. • Thực hiện một loạt 6 ống nghiệm. Ống số ĐC 1 2 3 4 5 Nộng độ glucose (mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 ml dd glucose (1mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 ml nước cất 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 ml dd CMC pH5 1 1 1 1 1 1 ml dd DNS-lactose 2 2 2 2 2 2 • Lắc đều các ống nghiệm này, đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng bằng chậu nước lạnh. Đặt độ hấp thụ của ống đối chứng ở bước sóng 540 nm bằng 0. Đo độ hấp thụ của các ống còn lại ở bước sóng 540 nm và ghi lại kết quả. Trang 7   c. Kết quả: • Quan sát bằng mắt thường, theo thứ tự từ trái sang phải ta thấy: ống đối chứng có màu vàng, các ống thí nghiệm có màu đỏ và đậm dần từ ống thí nghiệm số 1 đến ống thí nghiệm số 5 như hình 4. Hình 4: Kết quả so màu. • Kết quả đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 540 nm Ống số ĐC 1 2 3 4 5 OD 0 0.149 0.253 0.392 0.504 0.675 • Dựng đường chuẩn đường glucose Dựa vào kết quả đo độ hấp thụ (OD) đo ở bước sóng 540 nm, ta dựng được đường chuẩn đường glucose như sau: Trang 8   d. Nhận xét kết quả: • Dựa vào kết quả so màu ta thấy, nồng độ đường glucose càng cao, đồng thời thể tích đường glucose càng cao và thể tích nước cất càng giảm thì màu đỏ càng đậm. • Dựa vào kết quả đo độ hấp thụ (OD) ta thấy, nồng độ đường glucose càng cao, đồng thời thể tích đường glucose càng cao và thể tích nước cất càng giảm thì chỉ số OD càng cao. Trang 9   OL3$#'PQR(S!"#! 4 Q-++IT UTL-+LV*HWH=-+DX**Y-+<MN@-AB2@Z[/ / \]/ / ^ a. Nguyên tắc - Dựa vào sự thủy phân cơ chất CMC của enzyme, ở những nhiệt độ khác nhau là 30 0 C, 40 0 C, 50 0 C, 60 0 C, và 70 0 C. Cho kết quả so màu và chỉ số OD, khác nhau ở bước sóng 540 nm. b. Thực hành - Chuẩn bị 7 ống nghiệm: 1 ống đối chứng, 1 ống không phản ứng với enzyme, 5 ống có phản ứng với enzyme. • Ống đối chứng : - Hút 1 ml H 2 O cho vào ống nghiệm. - Thêm 2ml dung dich DNS-Lastose và lắc đều. - Thêm 1 ml dung dịch CMC pH 5 vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều. - Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong chậu nước lạnh. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm. • Ống nghiệm không có phản ứng enzyme - Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm đun sôi 10 phút để bất hoạt enzyme. - Thêm 2 ml dung dịch DNS-lactose và lắc đều. - Thêm 1 ml dung dịch CMC pH 5 vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều. - Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước lạnh. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm. • 5 ống nghiệm có phản ứng enzyme, được đánh số từ 1 đến 5. - Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm 1 và ủ ở nhiệt độ phòng (30 0 C) trong 10 phút. Đồng thời, ta cũng để chai chứa dung dịch CMC pH 5 thích hợp ở nhiệt độ phòng. Trang 10 [...]... đều - Thêm 1 ml dung dịch CMC pH6 vào ống nghiệm 4 chứa enzyme và lắc đều - Thêm 1 ml dung dịch CMC pH7 vào ống nghiệm 5 chứa enzyme và lắc đều - Thêm 1 ml dung dịch CMC pH8 vào ống nghiệm 6 chứa enzyme và lắc đều - Để phản ứng ở 400C chính xác 10 phút - Thêm 2 ml dung dịch DNS-lastose vào 6 ống nghiệm và lắc đều để ngừng phản ứng enzyme Trang 15 Công nghệ enzyme và protein - GVHD: CN ĐỖ THỊ TUYẾN... dịch CMC pH3 vào ống nghiệm số 1 và lắc đều - Thêm 1ml dung dịch CMC pH4 vào ống nghiệm số 2 và lắc đều - Thêm 1ml dung dịch CMC pH5 vào ống nghiệm số 3 và lắc đều - Thêm 1ml dung dịch CMC pH6 vào ống nghiệm số 4 và lắc đều - Thêm 1ml dung dịch CMC pH7 vào ống nghiệm số 5 và lắc đều - Thêm 1ml dung dịch CMC pH8 vào ống nghiệm số 6 và lắc đều - • Thêm 2ml dung dịch DNS-lactose vào 6 ống nghiệm và lắc đều... phản ứng với enzyme và 6 ống có phản ứng với enzyme Ống đối chứng : - Thêm 2ml dung dich DNS-Lastose và lắc đều - Thêm 1ml CMC pH5 vào ống nghiệm và lắc đều • Hút 1 ml H2O cho vào ống nghiệm Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm 6 ống không phản ứng được đánh số thứ tự từ 1 đến 6 - Hút 1ml dung dịch enzyme cho vào 6 ống nghiệm và đun sôi 10 phút để bất hoạt enzyme Trang 14 Công nghệ enzyme và protein GVHD:... dung dich enzyme cho vào ống nghiệm và ủ ở nhiệt độ 400C trong 10 phút Đồng thời, ta cũng để chai chứa dung dịch: CMC pH3, CMC pH4, CMC pH5, CMC pH6, CMC pH7, CMC pH8, thích hợp ở 40 0C trong 10 phút - Thêm 1 ml dung dịch CMC pH3 vào ống nghiệm 1 chứa enzyme và lắc đều - Thêm 1 ml dung dịch CMC pH4 vào ống nghiệm 2 chứa enzyme và lắc đều - Thêm 1 ml dung dịch CMC pH5 vào ống nghiệm 3 chứa enzyme và lắc... màu vàng và 6 ống nghiệm không phản ứng với enzyme, từ ống số 1 đến ống số 2 có màu vàng đậm dần Từ ống số 3 đến ống số 6 màu vàng nhạt dần như hình 6 Hình 6: Kết quả so màu của ống ĐC và 6 ống nghiệm không phản ứng • Quan sát bằng mắt thường, theo thứ tự từ trái sang phải ta thấy: ống đối chứng có màu vàng và 6 ống nghiệm có phản ứng với enzyme có màu đỏ Từ ống số 1 ở Trang 16 Công nghệ enzyme và protein. .. DNS-lastose và lắc đều - Thêm 1 ml dung dịch CMC pH5 vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều • Hút 1 ml nước cho vào ống nghiệm Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong cốc nước mát Đo độ hấp thụ ở bước song 540 nm Ống nghiệm không có phản ứng enzyme - Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm đun sôi 10 phút để bất hoạt enzyme Trang 20 Công nghệ enzyme và protein GVHD:.. .Công nghệ enzyme và protein GVHD: CN ĐỖ THỊ TUYẾN - Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm 2 và ủ ở nhiệt độ 400C trong 10 phút Đồng thời, ta cũng để chai chứa dung dịch CMC pH5 thích hợp ở nhiệt độ 400C - Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm 3 và ủ ở nhiệt độ 500C trong 10 phút Đồng thời, ta cũng để chai chứa dung dịch CMC pH5 thích hợp ở nhiệt độ 500C - Hút 1 ml dung dịch enzyme. .. pha loãng với 1 ml nước cất Ống không có phản ứng có màu vàng là màu vàng của DNS-lastose, chứng tỏ ở đây enzyme bị bất hoạt nên không xảy ra quá trình thủy phân giữa enzyme và dung dịch CMC pH5 Ống có phản ứng có màu đỏ, chứng tỏ ở đây có xảy ra quá trình thủy phân giữa enzyme và dung dịch CMC pH5, như hình 9 Trang 21 Công nghệ enzyme và protein GVHD: CN ĐỖ THỊ TUYẾN Hình 9: Kết quả so màu -... * 2 Công nghệ enzyme và protein GVHD: CN ĐỖ THỊ TUYẾN Tính F: Vẽ đồ thị: F= = 0.75 Thay vào phương trình ta có: x= = 1.17 Thế vào phương trình u ta được: * U = 1.17 * 0.75 * * 20 * 2 = 19.5 Vậy tổng hoạt tính của enzyme là: Ta có hoạt tính riêng là: Trang 31 = 19.5 Công nghệ enzyme và protein Hoạt tính riêng = GVHD: CN ĐỖ THỊ TUYẾN = 11.04 =  Kết quả chung sau khi xác định hàm lượng protein. .. 10.52 Công nghệ enzyme và protein GVHD: CN ĐỖ THỊ TUYẾN Trang 24 Công nghệ enzyme và protein GVHD: CN ĐỖ THỊ TUYẾN Bài 3: SẮC KÝ LỌC GEL SEPHADAX_G50 1 Bước đầu tinh sạch enzyme cellulose bằng sắc ký lọc gel a Nguyên tắc Kỷ thuật sắc ký lọc gel dùng để tách những phân tử có kích thước, trọng lượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để lọt vào . pH 3 vào ống nghiệm 1 chứa enzyme và lắc đều. - Thêm 1 ml dung dịch CMC pH 4 vào ống nghiệm 2 chứa enzyme và lắc đều. - Thêm 1 ml dung dịch CMC pH 5 vào. chứa enzyme và lắc đều. - Thêm 1 ml dung dịch CMC pH 6 vào ống nghiệm 4 chứa enzyme và lắc đều. - Thêm 1 ml dung dịch CMC pH 7 vào ống nghiệm 5 chứa enzyme