các phương pháp tinh sach enzyme
Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau. . Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên . Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp… Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng Các phương pháp tinh sạch enzyme 1 Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất. Các chế phẩm thu được sau quá trình nuôi cấy sản xuất enzyme chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein chỉ chiếm 20-30% .Vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến phương pháp tách và tinh chế enzyme nhằm thu được chế phẩm có độ tinh khiết cao rất cần thiết. Để tách và tinh chế enzyme nói riêng và protein nói chung thường có một loạt phương pháp hóa-lý và hóa học khác nhau. Có thể chia làm năm nhóm phương pháp sau: - Phương pháp biến tính chọn lọc - Phương pháp kết tủa phân đọan - Phương pháp hấp thụ chọn lọc - Phương pháp sắc ký - Phương pháp tách hệ hai pha nước Cho đến nay không có phương pháp tách và làm sạch chung cho các enzyme. Để xây dựng phương pháp tách và làm sạch một enzyme nào dó cần biết lựa chọn và phối hợp một cách có hiệu quả nhất các biện pháp tách và làm sạch khác nhau. PHẦN I: TỔNG QUAN Các phương pháp tinh sạch enzyme 2 Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm I/Khái niệm enzyme - Enzyme là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hoá học với mức độ đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tương đối thấp. - Enzyme có trong tất cả các tế bào sống, là các chất xúc tác sinh học. - Enzyme có đầy đủ các tính chất của chất xúc tác, nhưng enzyme có hiệu suất xúc tác lớn hơn tất cả các chất xúc tác hữu cơ và vô cơ khác.Enzyme không những có thể xúc tác cho các phản ứng xảy ra trong cơ thể sống, mà sau khi tách khỏi hệ thống sống, ở những điều kiện nhất định chúng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác. Như vậy,có thể nói một cách khái quát, enzyme là những phân tử lớn tồn tại trong tự nhiên, hay được tổng hợp có khả năng xúc tác cho một hay nhiều phản ứng với mức độ đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ và áp suất bình thường. II/Những tiêu chuẩn tinh sạch của enzyme Để xác định xem protein được chiết tách ra có phải là enzyme tinh khiết không hay còn chứa những tạp chất protein không họat động, người ta sử dụng một số phương pháp chủ yếu dựa trên việc nghiên cứu những tính chất vật lý của protein. Các phương pháp tinh sạch enzyme 3 Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm - Làm lắng (kết tủa) dung dịch protein trong phần quay phân tích của máy siêu ly tâm: phát hiện một đỉnh của protein thì đó là protein thuần nhất. Tuy nhiên một số protein tuy khác nhau nhưng có cùng trọng lượng phân tử và có hình dạng tiểu phân ( hoặc có khi có sự bù phụ của các ảnh hưởng của khối lượng và hình dạng) thì có hằng số lắng trùng nhau. Vì thế khi siêu ly tâm, chúng có thể lắng với tốc độ như nhau và cho một đỉnh chung. - Điện li ( phương pháp ranh giới di động): phương pháp này rất hiệu quả. Tuy nhiên khó mà phân biệt được những protein giống nhau về trị số di động điện li. Dung dịch enzyme khi được điện li khu vực trong jela tinh bột hoặc thạch chỉ ra một đỉnh cân đối thì đó là dấu hiệu của enzyme thuần nhất. Thế nhưng khi hàm lượng những protein tạp nhỏ(<=1%) thì khó phát hiện ra đúng. - Xác định họat độ riêng, mật độ quang học riêng trong những đỉnh quang phổ đặc trưng cùng hàm lượng các nhóm ngọai đặc hiệu. - Biện pháp khá nhạy cảm để xác định mức độ thuần nhất của enzyme ( cũng như protein khác) là kết hợp sự phân tích điện li và những phản ứng miễn dịch hóa học đặc hiệu, đặc biệt điện di trên thạch theo grabar. Các phương pháp tinh sạch enzyme 4 Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm - Biện pháp nghiên cứu có triển vọng nhưng tương đối ít nhạy về độ thuần nhất của protein là sự xác định độ hòa tan của nó theo norchrop. Thường để xét độ thuần nhất của enzyme, người ta dựa trên sự so sánh những kết quả thu được từ một vài phương pháp khác nhau. Đặc biệt, những chế phẩm enzyme càng tinh khiết thì càng dễ hỏng và khi bảo quản trong các dung dịch ở 4 0 C đều nhanh chóng mất hoạt tính. Vì thế, khi tái kết tinh enzyme lặp lại ta thường thấy có sự giảm hoạt độ riêng vì các tinh thể đã bị ô nhiễm bởi phần enzyme bị ức chế. Các phương pháp tinh sạch enzyme 5 Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm PHẦN II TÁCH CHIẾT& TINH SẠCH ENZYME I. Các điều cần lưu ý khi tách chiết và tinh sạch enzyme Có 3 khó khăn trong khi tách enzyme khỏi tế bào cần phải hết sức lưu ý. - Enzyme có trong tế bào sinh vật với lượng không lớn so với các thành phần khác. - Enzyme là chất hữu cơ không bền, chúng rất dễ bị biến tính khi bị tác động của các yếu tố bên ngoài. - Enzyme là prôtêin. Prôtêin enzyme luôn luôn đi cùng những loại prôtêin không phải enzyme nhưng lại có tính chất lý hoá rất giống prôtêin enzyme. Do đó, rất dễ mất hoạt tính sinh học khi bị tách ra khỏi tế bào và cơ thề.Việc mất hoạt tính có thể do nhiệt độ cao, sự thuỷ phân bởi các enzyme proteolytic, tác dụng của pH thấp, các chất oxy hoá hay chất khử, các chất gây biến tính,các chất ức chế bất thuận nghịch…Tuy nhiên, các enzyme khác nhau có thể nhạy cảm với những tác nhân nêu trên ở các mức độ rất khác nhau. Trong sản xuất chế phẩm enzyme thì việc giữ được hoạt tính của enzyme là một trong những yêu cầu hàng đầu.Thông thường qua mỗi bước tinh sạch Các phương pháp tinh sạch enzyme 6 Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm thì một phần enzyme cũng như hoạt động của chế phẩmbị mất đi, giá thành cao lên do chiphí về thiết bị, nguyên liệu, công sức và do mất hoạt độ. Với enzyme dùng trong mục đích công nghiệp, không phải lúc nào cũng cần phế phẩm có độ tinh sạch cao,trong một số trường hợp có thể dùng phế phẩm enzyme ở dạng thô. Để hạn chế tối đa sự giảm hoạt độ enzyme trong quá trình tinh sạch thì thường cần chọn dung dịch chiết rút enzyme thích hợp, vừa cho hiệu suất chiết suất enzyme cao, vừa không làm biến tính enzyme. Các bước tinh sạch thường được tiến hành ở nhiệt độ thấp ( khoảng 40C hoặc thấp hơn, tuỳ yếu tố gây kết tủa) để vừa hạn chế sự biện tính enzyme cũng như tác dụng phân giải của các enzyme proteolytic có mặt trong dịch chiết.Đối với nhiều enzyme,có thể bổ sung các chất ức chế của enzyme proteolytic vào dịch chiết để hạn chế sự thuỷ phân đối với các enzyme quan tâm. Các enzyme proteolytic được phân thành 4 lớp là: + protease serine + protease cystein + protease axit + protease chứa kim loại. Trên cơ sở của 4 lớp protease này, nhười ta cũng cha các chất ức chế của các enzyme này theo 4 lớp tưong ứng. Tuy vậy, do sự phổ biến của 2 loại Các phương pháp tinh sạch enzyme 7 Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm protease serine và protease cystein, nên việc bổ sung vào dịch chiết protein enzyme các chất ức chế của hai loại protease này là phổ biến. Trong một số trường hợp, đối với các enzyme nhạy cảm với các phân cắt proteolytic, thì cả 4 loại chất ức chế đều được sử dụng. Bổ sung các yếu tố làm bền ( như CaCl 2 , hay MgCl 2 ở nồng độ 2-5mM, glycerol 10-20% ) chất chống oxy hoá, xây dựng quy trình tinh sạch đơn giản ít bước nhất cũng là những cách để hạn chế sự giảm hoạt động của enzyme. Đối với một số enzyme bền nhiệt thì có thể dùng bước xử lý nhiệt ( 70-80 0 C, trong vòng 15-30 phút) ở ngay giai doạn đầu để vừa hạn chế tác dụng phân cắt proteolytic, vừa loại bỏ một số protein không monh muốn khác. Tương tự có thể dùng bước xử lý axit 9 đưa pH xuống 3-4) ở giai đoạn đầu đối với các enzyme bền ở pH thấp. I II. Thu nhận chế phẩm enzyme thô Ngoài trừ một số trường hợp enzyme quan tâm là enzyme ngoại bào từ vi sinh vật ( enzyme được tiết vào môi trường trong quá trình nuôi cấy tế bào) và các enzyme ngoại bào từ các dịch của động vật và thực vật, các trường hợp còn lại, bước đầu tiên trong nghiên cứu enzyme là phải thu nhận dịch chiết enzyme từ nguyên liệu.Để thu dịch chiết mô hoặc tế bào chứa enzyme, trước hết phải phá vỡ tế bào. Các phương pháp tinh sạch enzyme 8 Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm Để thu nhận enzyme nội bào, người ta phải phá vỡ tế bào bằng nhiều phương pháp.Các phương pháp phá vỡ tế bào thường được sử dụng để phá vỡ tế bào như: + Phương pháp cơ học. Nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền như bột thuỷ tinh, cát thạch anh, đồng hoá bằng thiết bị đồng hoá… + Phương pháp vật lý như dùng sóng siêu âm … + Phương pháp hoá học như dùng các loại dung môi, butylic, aceton, glycerol, ethylacetate. Sau khi phá vỡ tế bào, người ta thường sử dụng nước, dung dịch đệm, dung dịch muối trung tính để tách enzyme ra khỏi sinh khối đã xử lý theo những phương pháp trên. Dịch chiết thu được,người ta gọi là chế phẩm enzyme thô. Sở dĩ gọi là chế phẩm enzyme thô vì trong chế phẩm này,ngoài enzyme ra còn có nước, protein không phải enzyme các thành phần của tế bào. Chế phẩm thu được ở các bước ban đầu này thường chứa rất nhiều protein và các hợp chất không mong muốn, nồng độ enzyme quan tâm thấp. Dịch chiết có thể được cô đặc ở nhiệt độ thấp để làm tăng nồng độ enzyme, hoặc được bổ sung tác nhân gây kết tủa protein enzyme để loại bỏ một số chất không mong muốn, sau đó hoà tan enzyme trong một thể tích nhỏ dung dịch đệm thích hợp. Các phương pháp tinh sạch enzyme 9 Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm Để kết tủa protein cho mục đích tinh sạch, người ta thường dùng dung môi hữu cơ như ethanol hay aceton hoặc muối trung tính. Các dung môi hữu cơ khi thêm vào dung dịch nước sẽ làm giảm hằng số điện môi của dung dịch, do đó làm thay đổi tính tan của protein và dẫn đến làm kết tủa protein. Nồng độ của các dung môi gây kết tủa protein thường từ 80% (V/V) trở lên. Sự kết tủa có thể có tính chọn lọcmột phần, nghĩa là các protein khác nhau có thể được kết tủa bằng các nồng độ khác nhau của dung môi. Dung môi hữu cơ sau đó có thể được loại bằng cách cho bay hoi trong chân không, hay thậm chí trong hkông khí. Để kết tủa enzyme từ dịch chiết thô, người ta cũng có thể dùng một số muối trung tính, thường dùng nhất là ammonium sulfatese, do muối này có mức độ hoà tan rất cao trong nước, ít làm mất hoạt tính enzyme, thậm chí còn có tác dụng làm bền enzyme. Một số ưư điểm nữa của muối ammonium sulfate là khả năng kết tủa chọn lọc protein, do đó sẽ loại bỏ được nhiều protein không mong muốn trong dịch chiết. Lưu ý khi sử dụng muối ammonium sulfate là phải bổ sung vào dung dịch enzyme một cách từ từ, kết hợp khuấy đều để tránh khả năng tăng quá nhanh cục bộ của nồng độ muối, làm mất di tính kết tủa chọn lọc của nó, thậm chí có thể làm biến tính một số enzyme kém bền. Hạn chế của phương pháp sử dụng ammonium sulfate chính là mất nhiều thời gian, do nồng độ ammonium sulfate cao nên tỷ trọng của Các phương pháp tinh sạch enzyme 10 [...]... ta xác định rằng những tinh thể đầu tinh của protein hay enzyme thường có độ tinh khiết không quá 50% và có thể chứa nhiều loại enzyme khác nhau Họat độ riêng của tinh thể tăng khi các enzyme tái kết tinh và quá trình tái kết tinh cần được lập lại nhiều lần cho đến khi họat độ riêng tăng đến một giá tri cao nhất Phương pháp kết tinh và tái kết tinh được ứng dụng khi tinh chế enzyme như là một phương... xuất sơ bộ và tinh khiết enzyme Điều kiện cần thiết để tiến hành điện di: pH, nồng độ dung dịch đệm, điện thế của dòng điện và thời gian thí nghiệm được lựa chọn qua thực nghiệm và tính chất của enzyme nghiên cứu * Phương pháp kết tinh Khi enzyme đã đạt đến độ ting khiết phù hợp nó có thể kết tinh. Tuy nhiên kết tinh không có nghĩa là chế phẩn enzyme tinh Các phương pháp tinh sạch enzyme 29 Gvhd :Ths Đặng... muối khỏi chế phẩm khi chuyển sang bước tinh sạch tiếp theo IV/Các phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme *Khái niệm Việc làm sạch enzyme chính là việc loại protêin không phải là enzyme, nước,các thành phần khác của tế bào khỏi enzyme Công vịêc này hoàn toàn không dễ dàng Do đó, việc làm sạch enzyme đòi hỏi người làm nghiên cứu về enzyme, ngoài sự hiểu biết về enzyme ra còn phải nắm vững rất nhiều... Trong quá trình thẩm tích, để làm giảm sự biến tính của enzyme do nhiệt, người ta thường tiến hành tinh sạch enzyme ở nhiệt độ thấp Các phương pháp tinh sạch enzyme 22 Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm * Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex - Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-50 - Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-10 * Tinh sạch bromelin bằng phương pháp sắc ký Bromelin thân... dứa Các phương pháp tinh sạch enzyme 18 Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm Việc thu nhận và tinh sạch bromelin có thể thực hiện theo sơ đồ sau: Quả/thân/chồi dứa Xay nhuyễn, lọc Dịch lọc Ly tâm Bã Dịch ly tâm Kết tủa Chế phẩm brommeli n Sấy khô Tinh sạch Sản phẩm enzym tinh khiết Các phương pháp tinh sạch enzyme 19 Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm Thu dịch enzyme thô Quả dứa... đọan tinh chế enzyme cuối cùng Nguyên tắc: Có nhiều phương pháp điện ly khác nhau.Trong tinh chế enzyme có hai phương được áp dụng: Phương pháp rang giới chuyển động: được áp dụng chủ yếu để xác định điểm đẳng điện và độ tinh khiết cùng tính thuần nhất của chế phẩm enzyme Phương pháp điện di khu vực trên giấy và trong khối hoặc trong cột có chứa các chất làm đầy: được áp dụng để chiết xuất sơ bộ và tinh. .. cao, thời gain nhanh và đơn giản hơn so với các phương pháp khác Phương pháp tinh sạch enzyme bromelin Enzyme bromelin được tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích, lọc qua sephadex, phương pháp sắc ký * Tinh sạch bằng phươg pháp thẩm tích Cân 1g enzyme thô, pha trong 10ml dung dịch đệm sodium phosphate 0,03M có pH7,2 Sau khi tất cả enzyme đã hoà tan thì cho hỗn hợp vào túi cellophane rồi đặt túi vào cốc... hấp phụ thường dùng để làm đặc dung dịch enzyme Có thể hấp phụ chọn lọc các enzyme theo 2 cách: Các phương pháp tinh sạch enzyme 25 Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm - Hấp phụ âm tính: nếu enzyme không được hấp thụ, phương pháp xử lý này có thể xem như là dùng chất hấp thụ để tách những hợp chất tạp ra khỏi dung dịch enzyme -Hấp phụ dương tính: nếu enzyme được hấp phụ, nó sẽ được tách ra... Vì thế tốt nhất nên xem quá trình kết tinh như là một phương pháp cụ thể của quá trình phân đọan, và được sử dụng ở những giai đọan tinh chế cuối cùng Sự kết tinh enzyme thường được tiến hành từ các ammonium sulfate Enzyme thường được kết tinh theo nhiều phương pháp khác nhau.Ví dụ: như từ các dung môi hữư cơ Khi những phương pháp này thất bại người ta có thể kết tinh muối kim lọai nặng của enzym Chẳng... đoạn Độn với tinh bột Sấy khô ở 400C Chế phẩm enzyme Bảo quản nhiệt độ lạnh 0-40C Các phương pháp tinh sạch enzyme 33 Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm Các phương pháp tinh sạch enzyme Ficin: * Phương pháp lọc gel: Cách làm: + Nhồi cột: ngâm gel sephadex G75 trong dung dịch NaN3 0,02% trong 24 giờ để gel trương nở hòan toàn - Cho dung dịch đệm vào cột - Cho một lớp gòn thủy tinh vào cột,