Tom tat luận án: Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.

Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI NGU N THỊ THÙ VÂN NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VÀ SINH TỔNG HỢP CYCLOOLIGOMER DEPSIPEPTIDE CỦA NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG TẠI KHU BẢO TỒN THIÊN NHIÊN COPIA VÀ VƢỜN QUỐC GIA XUÂN SƠN Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9.42.01.07 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2022 Cơng trình hoàn thành tại: TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Dƣơng Minh Lam GS.TS Ngô Sỹ Hiền Phản biện 1: PGS TS Lê Thanh Bình Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam Phản biện 2: PGS TS Vũ Nguyên Thành Viện Công nghệ thực phẩm Phản biện 3: PGS TS Trần Văn Tuấn Đại học Quốc gia Hà Nội Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường họp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội vào hồi … … ngày … tháng… năm 2022 Có thể tìm hiểu luận án thƣ viện: Thư viện Quốc Gia, Hà Nội Thư viện Trường Đại học Sư phạm Hà Nội MỞ ĐẦU Nấm ký sinh côn trùng (Entomopathogenic fungi - EPF) hay nấm côn trùng (Insect fungi) nhóm nấm gây bệnh cho trùng Đây nhóm nấm có vai trị quan trọng hệ sinh thái Cho đến có gần 2000 lồi nấm ký sinh trùng ghi nhận Nấm ký sinh trùng có khả sinh tổng hợp đa dạng chất chuyển hóa thứ cấp như: Cyclic depsipeptide, peptide, dẫn xuất amino acid, polyketide, peptide hybrid, terpenoid Các chất chuyển hóa thứ cấp từ nấm ký sinh trùng có phổ hoạt tính mạnh thu hút quan tâm nhà nghiên cứu Trong đáng ý nhóm hoạt chất cyclooligomer depsipeptide Cyclooligomer depsipeptide (COD) nhóm đặc biệt nonribosomal peptid gồm 2, đơn phân Trong đơn phân cấu tạo 2-hydroxycarboxylic acid 2-amino acid COD sinh tổng hợp nhờ hệ enzyme non-ribosomal peptide synthetase (NRPSs) COD hoạt chất tự nhiên tìm thấy vi khuẩn, nấm, thực vật, tảo, hải miên, số loại sinh vật biển khác Trong nhóm COD COD từ nấm ký sinh trùng nhóm quan trọng, chiếm tỷ lệ lớn Cyclooligomer depsipeptide từ nấm ký sinh côn trùng có phổ hoạt tính sinh học rộng, bao gồm khả gây độc thực vật, gây độc tế bào, kháng vi rút, diệt côn trùng, chống sốt rét, chống khối u, ức chế hoạt động số loại enzyme hạn chế hình thành amyloid bệnh Alzheimer Đặc biệt nghiên cứu gần cho thấy COD từ nấm ký sinh côn trùng có tiềm phịng chống ung thư, ức chế sinh trưởng số dòng ung thư khác người Hiện nay, hoạt chất COD từ nấm ký sinh côn trùng coi nguồn nguyên liệu tự nhiên tiềm ứng dụng y dược Trên giới việc nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng COD từ nấm ký sinh côn trùng sớm Điển nghiên cứu tách chiết enniatin A từ nấm Fusarium orthocera var enniatinum Gaumann (1947), nghiên cứu sinh tổng hợp cyclodepsipeptide D- D-, L-L-, D-LCyclodi- (β-seryloxy- propionyl) Hassal cộng (1967) hay nghiên cứu cấu trúc beauvericin từ nấm Hamill cộng (1969), Trải qua 70 năm, nấm ký sinh côn trùng COD từ nấm ký sinh côn trùng thu hút ý nhiều nhà khoa học giới Ở Việt Nam có số cơng trình nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng ứng dụng chúng công bố Các nghiên cứu tập trung chủ yếu vào đa dạng nấm ký sinh côn trùng sử dụng sinh khối nấm để sản xuất chế phẩm ứng dụng làm thuốc trừ sâu, tiêu biểu nghiên cứu tác giả Nguyễn Thị Lộc (2006), Phạm Thị Thùy (2010), Phạm Văn Nhạ (2013),… Nghiên cứu COD từ nấm ký sinh côn trùng vấn đề mẻ, chưa có cơng trình nghiên cứu Việt Nam đề cập tới vấn đề Khu bảo tồn thiên nhiên Copia (Sơn La) Vườn Quốc gia Xuân Sơn (Phú Thọ) hai khu vực có độ đa dạng sinh học bật miền Bắc Việt Nam Được thiên nhiên ưu đãi điều kiện tự nhiên hệ động thực vật hai khu vực phong phú, khơng có giá trị nghiên cứu khoa học, bảo tồn nguồn gen mà cịn có ý nghĩa phát triển kinh tế, khai thác tài nguyên thiên nhiên (đặc biệt tài nguyên sinh vật) Với khu rừng nhiệt đới cận nhiệt đới, có nhiều loài động thực vật quý hữu đặc trưng cho vùng núi phía Bắc Tuy nhiên khu hệ nấm Khu bảo tồn thiên nhiên Copia Vườn Quốc gia Xn Sơn cịn chưa có nhiều nghiên cứu Những hiểu biết đa dạng thành phần loài, đặc điểm sinh học giá trị sử dụng cịn hạn chế Đặc biệt, khơng có nghiên cứu nấm gây bệnh côn trùng hai khu vực Nhằm bổ sung hiểu biết nấm ký sinh côn trùng COD từ nấm ký sinh trùng góp phần xây dựng danh mục nguồn gen, bảo tồn đa dạng sinh học lồi nấm ký sinh trùng Khu bảo tồn thiên nhiên Copia Vườn Quốc gia Xuân Sơn, lựa chọn nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đa dạng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide nấm ký sinh côn trùng Khu bảo tồn thiên nhiên Copia Vườn Quốc gia Xuân Sơn” Mục tiêu đề tài Đánh giá thành phần loài khả sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide số chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập Khu bảo tồn thiên nhiên Copia (Sơn La) Vườn quốc gia Xuân Sơn (Phú Thọ) Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Nấm phân lập từ mẫu côn trùng thu thập Khu bảo tồn thiên nhiên Copia (Sơn La) Vườn quốc gia Xuân Sơn (Phú Thọ) - Phạm vi nghiên cứu: Phân lập, tuyển chọn, nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh học phân tử chủng nấm có khả sinh tổng hợp COD Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường điều kiện nuôi cấy thu nhận COD, tách chiết, tinh khảo sát hoạt tính sinh học COD từ chủng nấm tuyển chọn Nội dung nghiên cứu - Phân lập nghiên cứu đa dạng nấm ký sinh côn trùng từ mẫu thu Khu bảo tồn thiên nhiên Copia Vườn quốc gia Xuân Sơn - Tuyển chọn chủng nấm ký sinh trùng có khả sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide - Nghiên cứu định loại chủng nấm tuyển chọn phương pháp hình thái sinh học phân tử - Nghiên cứu lựa chọn môi trường điều kiện nuôi cấy, sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide cho chủng nấm tuyển chọn quy mơ phịng thí nghiệm - Nghiên cứu thu hồi, tinh xác định cấu trúc hóa học cyclooligomer depsipeptide - Nghiên cứu khảo sát số hoạt tính sinh học phân đoạn trình tách chiết cyclooligomer depsipeptide Những đóng góp luận án - Là luận án nghiên cứu cách toàn diện (từ khâu phân lập, tuyển chọn, định loại, nghiên cứu đặc điểm lên men thu nhận, tách chiết, tinh sạch, khảo sát hoạt tính sinh học COD) chủng nấm ký sinh côn trùng thuộc chi Cordyceps có khả sinh tổng hợp COD có tiềm ứng dụng - Đây luận án công bố đa dạng nấm ký sinh côn trùng khả sinh tổng hợp COD chủng nấm phân lập từ mẫu côn trùng thu thập Khu bảo tồn thiên nhiên Copia (Sơn La) Vườn quốc gia Xuân Sơn (Phú Thọ) - Lần ghi nhận có mặt lồi nấm Cordyceps cateniannulata Việt Nam - Là công bố giới Cordyceps cateniannulata có khả sinh tổng hợp COD Cấu trúc luận án Luận án gồm 158 trang, bao gồm phần sau: Mở đầu: trang Chương Tổng quan vấn đề nghiên cứu: 37 trang Chương Nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu: 15 trang Chương Kết Thảo luận: 71 trang Kết luận Kiến nghị: trang Tài liệu tham khảo: Luận án tham khảo 12 tài liệu tiếng Việt, 209 tài liệu tiếng nước ngoài, 02 trang Web Phụ lục: Luận án có 11 phụ lục kết phân tích, trình tự ADN, phổ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU Trong chương này, sáu vấn đề liên quan đến nghiên cứu luận án tổng quan Đó là: (1.1) Nấm nấm ký sinh côn trùng; (1.2) Nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide; (1.3) Nhu cầu dinh dƣỡng điều kiện nuôi cấy nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide; (1.4) Tách chiết, tinh nghiên cứu cấu trúc cyclooligomer depsipeptide từ nấm ký sinh côn trùng; (1.5) Tình hình nghiên cứu giới Việt Nam Trong phần (1.1) Nấm nấm ký sinh côn trùng, giới thiệu nấm (mục 1.1.1), sơ lược nấm ký sinh côn trùng hoạt chất trao đổi chất thứ cấp từ nấm ký sinh trùng (mục 1.1.2) trình bày cụ thể Trong phần (1.2) Nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide, nội dung cấu trúc hóa học, dạng COD từ nấm hoạt tính COD tổng quan (mục 1.2.1) Đa dạng nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide (Một số chi nấm ký sinh côn trùng phổ biến sinh tổng hợp COD, Nấm Cordyceps spp sinh tổng hợp COD - mục 1.2.2) đường sinh tổng hợp COD nấm (mục 1.2.3) trình bày cụ thể từ trang 18 đến trang 25 Phần (1.3) Nhu cầu dinh dƣỡng điều kiện nuôi cấy nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide, tổng quan về: Lựa chọn môi trường nuôi cấy, độ pH, nguồn cacbon, nguồn nitơ Trong phần (1.4) Tách chiết, tinh nghiên cứu cấu trúc cyclooligomer depsipeptide từ nấm ký sinh côn trùng, bước tách chiết, tinh sạch, phương pháp nghiên cứu cấu trúc COD tổng quan mơ tả cụ thể Trong phần (1.5) Tình hình nghiên cứu giới Việt Nam, hướng nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp COD giới Việt Nam đặc biệt khu vực nghiên cứu tổng quan CHƢƠNG II: NGU ÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Trong chương này, Nguyên vật liệu đối tƣợng nghiên cứu trình bày mục (2.1) bao gồm: (2.1.1) Đối tượng nghiên cứu; (2.1.2) Hóa chất thiết bị; (2.1.3) Môi trường Các Phƣơng pháp nghiên cứu (mục 2.2) chia thành 05 nhóm sau: 2.2.1 Phương pháp vi sinh vật học gồm phương pháp: Phương pháp phân lập, Phương pháp giữ giống, Phương pháp ho t h h ng n m t y n h n, Phương pháp t y n h n h ng n m inh y looligom depsipeptide, Phương pháp ông khô, Phương pháp lự h n môi t ường dinh dưỡng iề kiện n ôi y phù hợp ho inh t ưởng tí h lũy COD h ng t y n h n, Đánh giá ho t tính gây ộ tế bào th o phương pháp MTT, Phương pháp ánh giá ho t tính kháng vi inh vật ki m ịnh, Đánh giá ho t tính hống oxi h 2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử gồm phương pháp: Tá h hiết ADN tổng ố, Nhân bội ADN, Phương pháp giải t ình tự 2.2.3 Phương pháp tách chiết tinh cyclooligomer depsipeptide gồm phương pháp: Phương pháp tá h hiết hợp h t từ inh khối n m, Phương pháp xá ịnh tú h h hợp h t h, Thự nghiệm tá h hiết, tinh h hợp h t COD từ inh khối n m C cateniannulata CPA14V 2.2.4 Phương pháp phân tích gồm phương pháp: Phương pháp xá ịnh inh khối khô (CDW), Phương pháp ịnh lượng COD t ong inh khối n m 2.2.5 Phương pháp toán học CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đa dạng nấm ký sinh côn trùng phân lập từ mẫu thu Khu bảo tồn thiên nhiên Copia Vƣờn quốc gia Xuân Sơn 3.1.1 Kết phân lập nghiên cứu đặc điểm nấm ký sinh côn trùng Khu bảo tồn thiên nhiên Copia Vườn quốc gia Xuân Sơn Kết từ 24 mẫu ký chủ thuộc côn trùng Blattodea, Hemiptera, Coleoptera, Hymenoptera Lepidoptera, 24 chủng nấm phân lập, khiết bảo quản cho nghiên cứu Ký hiệu chủng là: CPA1, CPA3, CPA5, CPA13V, CPA14V, CPA15, CPA16, CPA31, CPA40, CPA44, XS01, XS07, XS12, XS36, XS37, XS38, XS57, XS65, XS66, XS67, XS69, XS71, XS77, XS83 Tiến hành phân loại 24 chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập dựa đặc điểm hình thái mẫu vơ tính, hữu tính ngồi tự nhiên; đặc điểm ni cấy trình tự ITS số chủng chủng nấm Kết xác định chủng phân lập thuộc chi Aschersonia (01 mẫu), Purpureocillium (01 mẫu), Beauveria (08 mẫu), Cordyceps (06 mẫu), Isaria (05 mẫu), Ophiocordyceps (03 mẫu) Kết cụ thể thể bảng 3.1, hình 3.25 Bảng 3.1 Thành phần nấm ký sinh côn trùng phân lập đƣợc Họ nấm Chi Số Chủng Ký chủ mẫu Clavicipitaceae Aschersonia 01 XS01 Hemiptera Cordycipitaceae Beauveria 08 CPA5 Coleoptera CPA15 Coleoptera CPA16 Lepidoptera CPA44 Coleoptera XS36 Coleoptera XS37 Coleoptera XS38 Hymenoptera XS83 Lepidoptera Cordyceps 06 CPA3 Coleoptera CPA13V Lepidoptera CPA14V Blattodea CPA31 Lepidoptera XS57 Hymenoptera XS67 Hymenoptera Isaria 05 CPA40 Blattodea XS07 Lepidoptera XS66 Hymenoptera XS69 Lepidoptera XS71 Lepidoptera Ophiocodycipitaceae Ophiocordyceps 03 CPA1 Hymenoptera XS12 Hymenoptera XS65 Hymenoptera Purpureocillium 01 XS77 Coleoptera Hình 3.25 Mối quan hệ phát sinh chủng loại chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập khu vực nghiên cứu 3.1.2 Một số nhận xét đa dạng chủng nấm ký sinh côn trùng Khu bảo tồn thiên nhiên Copia Vườn quốc gia Xuân Sơn Kết 33,3% chủng phân lập thuộc chi Beauveria, chi Cordyceps (25%) Isaria (20,8%) Sự xuất loài thuộc chi Aschersonia ký sinh Hemiptera lần ghi nhận Việt Nam Trong ký chủ, Hymenoptera có số mẫu 07/24 mẫu thu thập ký chủ nhiều chi nấm nghiên cứu bao gồm Ophiocordyceps, Cordyceps, Beauveria, Isaria Tương tự ký chủ Coleoptera có số mẫu 07/24 mẫu thu thập ký chủ 3/6 chi nấm nghiên cứu (Beauveria, Cordyceps Purpureocillium) Trong nghiên cứu này, Cordyceps spp tìm thấy ký chủ khơng tìm thấy Hemiptera Chủng nấm Isaria tìm thấy côn trùng Blattodae nghiên cứu ghi nhận Có khác biệt nhỏ hai khu vực nghiên cứu Ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia, 10 mẫu nấm ký sinh côn trùng thu 02 đợt thu mẫu phân loại vào 4/6 chi nghiên cứu Trong Vườn quốc gia Xuân Sơn, 14 mẫu nấm thu 01 đợt thu mẫu phân loại vào 6/6 chi nghiên cứu 3.2 Khả sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập Kết cho thấy, 19/24 (79%) chủng nấm phân lập có khả sinh tổng hợp COD trung bình từ 0,11 - 4,98 mg/g Tất chủng thuộc chi Beauveria có khả sinh COD, 83.3% chủng Cordyceps 60% chủng Isaria có khả Phát chứng minh loài nấm thuộc họ Cordycipitaceae có tiềm sản xuất COD đáng để nghiên cứu Bốn chủng Isaria sp XS69, Isaria sp CPA40, Cordyceps sp CPA14V Beauveria sp CPA16 có khả sinh COD cao nhất, đạt 3,48, 3,88, 4,81, 4,98 mg/g, sinh khối CDW tích lũy đạt 9,38, 10,42, 9,84, 5,81 g/l Trong chủng chủng Cordyceps sp CPA14V tìm thấy ký chủ thuộc trùng Blattodea có khả sinh 47.29 mg/l sau ngày ni cấy Chủng nấm Cordyceps sp CPA14V có tiềm năng, cần phải có thêm nghiên cứu cơng nghệ nuôi cấy sản xuất COD từ chủng 11 Hình 3.28 Kết xây dựng phát sinh lồi dựa vùng gen ITS 12 Hình 3.29 Kết xây dựng phát sinh loài dựa vùng gen LSU 13 Hình 3.30 Kết xây dựng phát sinh loài dựa vùng gen ITS, LSU Rpb1 Qua phân tích phát sinh chủng loại sử dụng đơn lẻ vùng gen mục tiêu ITS, LSU, Rpb1 kết hợp ba vùng gen khẳng định chủng nấm CPA14V nghiên cứu thuộc lồi Cordyceps cateniannulata, chi Cordyceps, họ Cordycipitaceae Như vậy, thơng qua phân tích phát sinh chủng loại đặc điểm hình thái kết luận chủng CPA14V loài Cordyceps cateniannulata CPA14V Lần ghi nhận có mặt lồi nấm Việt Nam 3.4 Nghiên cứu môi trƣờng điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide chủng nấm C cateniannulata CPA14V Chúng tiến hành nghiên cứu môi trường điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide chủng nấm C cateniannulata CPA14V Các môi trường dinh dưỡng lựa chọn để nghiên cứu bao gồm 05: Môi trường PGB; môi trường Sabouraud (SBR); môi trường MM; môi trường Czapek-Dox (CzD); môi trường FDM Các yếu tố môi trường điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sinh trưởng sinh tổng hợp COD chủng nghiên cứu 14 bao gồm: pH môi trường, nguồn cacbon, nguồn nitơ Kết nghiên cứu trình bày cụ thể từ trang 99 đến 108 toàn văn luận án tiến sỹ a) Khả inh t ưởng c a ch ng n m C cateniannulata CPA14V 05 lo i môi t ường nghiên ứu b) Khả inh tổng hợp COD c a ch ng n m C cateniannulata CPA14V 05 lo i môi t ường nghiên ứu Hình 3.31 Khả sinh trƣởng sinh tổng hợp chủng nấm C cateniannulata CPA14V 05 loại mơi trƣờng nghiên cứu 15 Hình 3.32 Ảnh hƣởng pH đến sinh trƣởng sinh tổng hợp COD chủng C cateniannulata CPA14V Hình 3.33 Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến khả sinh trƣởng sinh tổng hợp COD chủng C cateniannulata CPA14V 16 Hình 3.34 Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến khả sinh trƣởng sinh tổng hợp COD chủng C cateniannulata CPA14V Kết nghiên cứu cho thấy môi trường Czapek-Dox (CzD) với độ pH môi trường 8, nguồn cacbon glucose, nguồn nitơ cao nấm men, phù hợp cho sinh trưởng sinh tổng hợp COD chủng nấm C cateniannulata CPA14V Khi sử dụng môi trường kết hợp với ni lắc 150 vịng/phút thời gian ngày nhiệt độ 25oC thu kết 65,789 ± 2,186g/l COD Kết cụ thể thể hình 3.31, 3.32, 3.33, 3.34 3.5 Nghiên cứu tách chiết, tinh xác định cấu trúc cyclooligomer depsipeptide từ C cateniannulata CPA14V 3.5.1 Tách chiết tinh cyclooligomer depsipeptide từ C cateniannulata CPA14V quy mơ phịng thí nghiệm Tiến hành tách chiết tinh COD từ chủng nấm nghiên cứu Các kết về: Chuẩn bị sinh khối mẫu, ngâm chiết tạo cặn chiết, phân lập chất từ cao chiết dichloromethane (CCD) sắc ký cột số yếu tố ảnh hưởng đến thu nhận COD trình bày cụ thể từ trang 108 đến trang 114 toàn văn luận án Kết nghiên cứu tách chiết tinh COD từ chủng C cateniannulata CPA14V cho thấy trình tự sử dụng dung mơi chiết phù hợp dichloromethane, nước, n-hexane kết hợp với hệ thống sắc kí mỏng, sắc kí cột thường với silicagel, sắc ký pha đảo với YMC RP 18 sắc ký ray phân tử với pha tĩnh sephadex LH-20 kết tinh axeton cho hiệu suất (0,37% CDW) tinh beauvericin cao (98,1%) Hiệu suất chiết tinh tốt điều kiện siêu âm sinh khối với dichloromethane giờ, nhiệt độ 50oC (xem hình 3.35, 3.36, 3.37, 3.38) 17 Hình 3.35 Qui trình thu nhận COD (CC1) qui mơ phịng thí nghiệm 18 Hình 3.36 Ảnh hƣởng dung mơi chiết đến hàm lƣợng CC1 Hình 3.37 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hàm lƣợng CC1 Hình 3.38 Ảnh hƣởng thời gian siêu âm đến hàm lƣợng CC1 19 3.5.2 Xác định cấu trúc hóa học cyclooligomer depsipeptide Để xác định cấu trúc hóa học COD từ chủng nghiên cứu, tiến hành đo phổ: Phổ LC/MS Q-TOF, phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR, phổ DEPT, phổ HSQC, phổ COSY, phổ NOESY, phổ HMBC Kết đo phổ trình bày cụ thể từ trang 114 đến trang 122 tồn văn luận án Các phân tích NMR (1H, 13C, DEPT135, COZY, NOESY, HMQC HMBC; MeOD) kết hợp với liệu phổ tài liệu tham khảo cho biết hợp chất CC1 gồm ba nhóm N-MePhe ba nhóm Hiv, có tên gọi (3S,6R,9S,12R,15S,18R)-3,9,15-tribenzyl-4,10,16-trimethyl-6,12,18tri(propan-2-yl)-1,7,13-trioxa-4,10,16-triazacyclooctadecane 2,5,8,11,14,17hexone hay gọi beauvericin Bảng 3.3 Dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR CC1 tài liệu tham khảo Hợp chất CC1 Beauvericin (tài liệu tham khảo) Vị trí δH (mult., J Hz) #δH (mult., J Hz) δC #δC Phe (3 đơn vị): CO 173,0 - 172,3 5,83 (1H, dd, J= 12,5; 5.82 (1H, dd, J= 12.7, Α 57,8 56.5 4,5) 4.5) 3.42 (1H, dd, J= 14.8, 3,40 (1H, dd, J= 14,5, 4.5) Β 35,5 4,5) 34.7 3.06 (1H, dd, J= 14.8, 3,05 (1H, m) 12.7) γ1 138,1 - 136.9 γ2 129,8 7.25-7.28 (1H, m) 128.3 7.26-7.30 (1H, m) γ3 129,7 7.25-7.28 (1H, m) 128.3 7.26-7.30 (1H, m) γ4 127,9 7.19 (1H, m) 126.2 7.20 (1H, tt, J= 6.0, 3.1) γ5 129,7 7.25-7.28 (1H, m) 128.3 7.26-7.30 (1H, m) γ6 129,8 7.25-7.28 (1H, m) 128.3 7.26-7.30 (1H, m) N32,2 3,16 (1H, s) 31.2 3.17 (1H, s) CH3 Hiv (3 đơn vị): CO 170,9 - 169,5 Α 77,2 4,88 (1H, d, J = 9,0) 75.5 4.86 (1H, s) Β 31,2 1,84 (1H, m) 29.8 1.83 (1H, dq, J= 8.8, 6.7) 0.87 (3H, d, J = γ1 17,2 0,88 (3H, d, J = 6,5 Hz) 17.8 6.6) 0.27 (3H, d, J = γ2 18,3 0,29 (3H, d, J = 7,0 Hz) 16.1 6.9) 13 #δH #δC beauvericin ( H: 300 MHz, C: 75 MHz, methanol-d4) 20 Hình 3.43 Cấu trúc hóa học, tƣơng tác 1H-1H COS HMBC (HC) CC1 3.6 Nghiên cứu khảo sát số hoạt tính sinh học của cao chiết tổng, phân đoạn chất beauvericin chủng nấm C cateniannulata CPA14V Nhằm bổ sung hiểu biết hoạt tính sinh học hoạt chất từ nấm C cateniannulata, chúng tơi tiến hành đánh giá hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính chống oxy hóa, hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định mẫu cao chiết etanol tổng (CCM), n-hexane (CCH), dichloromethane (CCD), ethyl acetate (CCE), nước (CCN) chất beauvericin (CC1) từ chủng nấm C Cateniannulata CPA14V Kết cụ thể trình bày bảng 3.4, 3.5, 3.6 21 Bảng 3.4 Hoạt tính gây độc tế bào in vitro cao chiết beauvericin từ chủng nấm C cateniannulata CPA14V TT Ký hiệu Tế bào HepG2 Tế bào PC3 Tế bào Vero mẫu Tỷ lệ ức Tỷ lệ ức Tỷ lệ ức IC50 IC50 IC50 chế tế bào chế tế bào chế tế bào (µg/mL) (µg/mL) (µg/mL) (%) (%) (%) 88,61 ± 80,97 22,86 ± 0,1 >100 CCM 80,55 ± 3,1 60,12 0,6 78,33 ± 69,37 31,31 ± 1,5 >100 CCH 53,17 ± 2,0 95,64 1,8 90,33 ± 45,29 26,25 ± 1,3 >100 CCD 96,56 ± 0,9 22,90 1,5 46,64 ± >100 35,43 ± 2,0 >100 CCE 56,49 ± 1,9 93,48 2,1 44,36 ± >100 40,75 ± 2,2 >100 CCN 42,25 ± 2,4 >100 2,3 95,16 ± 23,52 46,53 ± 1,8 >100 CC1 97,02 ± 1,8 19,17 0,8 Paclitaxel 47,2 64,09 ± 40,74 >100 54,2 ± 1,8 39,16 ± 2,6 50nM nM 2,4 nM Nm Bảng 3.5 Hoạt tính chống oxi hóa in vitro cao chiết beauvericin từ chủng nấm C cateniannulata CPA14V TT Ký hiệu mẫu Khả trung SC50 hòa gốc tự (SC, (μg/mL) %) Chứng (+) [axit ascorbic] 86,53 ± 0,3 12,6 μg/mL Chứng (-) [DPPH/EtOH+ 0,0 ± 0,0 DMSO] CCM 72,68 ± 2,8 102,95 CCH 1,54 ± 0,1 >200 CCD 79,07 ± 2,6 86,87 CCE 2,88 ± 1,5 >200 CCN 19,26 ± 1,8 >200 CC1 1,23 ± 0,6 >200 22 Bảng 3.6 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định in vitro cao chiết beauvericin từ chủng nấm C Cateniannulata CPA14V Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: g/ml), Ký Vi khuẩn Vi khuẩn Gr(-) Nấm mốc Nấm men hiệu Gr(+) mẫu E P B S A F S C coli aeruginosa subtilis aureus Niger oxysporum cerevisiae albicans >200 >200 >200 100 >200 >200 200 CCM 200 >200 >200 >200 200 >200 >200 >200 CCH >200 200 >200 200 100 100 >200 200 CCD 100 >200 >200 >200 >200 >200 >200 >200 CCE >200 >200 >200 >200 >200 >200 >200 >200 CCN >200 100 200 100 100 100 200 200 CC1 100 Kết cho thấy sản phẩm beauvericin thu từ chủng C cateniannulata CPA14V thể hoạt tính sinh học tốt Có khả gây độc dịng tế bào ung thư gan Hep-G2 (giá trị IC50=19,17 µg/mL), ung thư tuyến tiền liệt (PC-3) (giá trị IC50= 23,52 µg/mL), thể hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định tốt với tất chủng vi khuẩn nấm thử nghiệm bao gồm chủng E coli, P aeruginosa, B subtilis, S Cerevisiae, S aureus, A Niger, F Oxysporum, C albicans với giá trị MIC= 100- 200µg/ml Kết trình bày cụ thể luận án từ trang 122 đến trang 127 23 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1.1 Từ 24 mẫu ký chủ thuộc côn trùng Blattodea, Hemiptera, Coleoptera, Hymenoptera, Lepidoptera thu thập Khu bảo tồn thiên nhiên Copia Vườn Quốc gia Xuân Sơn, tiến hành phân lập 24 chủng nấm Các chủng nấm phân lập đa dạng phong phú phân loại vào chi bao gồm chi Aschersonia, Purpureocillium, Beauveria, Cordyceps, Isaria, Ophiocordyceps 1.2 Nghiên cứu sàng lọc khả sinh tổng hợp COD cuả chủng nấm ký sinh côn trùng khu vực nghiên cứu xác định 19/24 chủng có khả sinh tổng hợp COD Trong số chủng nấm CPA14V phân lập từ mẫu nấm ký sinh côn trùng Blattodea có khả sinh tổng hợp COD tốt để tiến hành nghiên cứu sâu 1.3 Nghiên cứu số đặc điểm hình thái định loại chủng nấm tuyển chọn phương pháp sinh học phân tử xác định chủng nấm CPA14V loài Cordyceps cateniannulata, chi Cordyceps, họ Cordycipitaceae Đây lần ghi nhận có mặt lồi Cordyceps cateniannulata Việt Nam 1.4 Môi trường Czapek-Dox (CzD) với độ pH môi trường 8, nguồn cacbon glucose, nguồn nitơ cao nấm men, phù hợp cho sinh trưởng sinh tổng hợp COD chủng nấm C cateniannulata CPA14V Khi sử dụng môi trường kết hợp với nuôi lắc 150 vòng/phút thời gian ngày nhiệt độ 25oC thu kết 65,789 ± 2,186 mg/l COD Tương đương với nghiên cứu chủng nấm công bố giới 1.5 Đã xác định điều kiện tách chiết thu hồi COD từ sinh khối chủng nấm C cateniannulata CPA14V Sử dụng dung môi chiết dichloromethane, điều kiện nhiệt độ 40-50oC siêu âm 2h quy trình tách chiết đề xuất thu COD 98,1% với hiệu suất thu hồi đạt 0,37% lượng sinh khối khô Đã xác định cấu trúc hóa học COD thu từ chủng C cateniannulata CPA14V COD có ba nhóm N-MePhe ba nhóm Hiv, có tên gọi beauvericin 1.6 Beauvericin thu từ chủng C cateniannulata CPA14V thể hoạt tính sinh học tốt Có khả gây độc dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 (giá trị IC50=19,17 µg/mL), ung thư tuyến tiền liệt (PC-3) (giá trị IC50= 23,52 µg/mL), thể hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định tốt với tất chủng vi khuẩn nấm thử nghiệm bao gồm chủng E coli, P aeruginosa, B subtillis, S Cerevisiae, S aureus, A Niger, F Oxysporum, C albicans với giá trị MIC= 100- 200µg/ml 24 KIẾN NGHỊ Những kết thu trình nghiên cứu cho thấy phần mức độ phong phú tiềm nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp COD Khu bảo tồn thiên nhiên Copia Vườn quốc gia Xuân Sơn Đặc biệt kết nghiên cứu thu khả sinh tổng hợp, thu hồi, tinh hoạt tính hợp chất COD từ chủng nấm C cateniannulata CPA14V cho thấy tiềm nghiên cứu ứng dụng hợp chất Việt Nam Tuy nhiên để phát triển hợp chất COD nhằm ứng dụng y học lĩnh vực khác vấn đề cần giải sau đây: 2.1 Cần tiếp tục có nghiên cứu thử nghiệm hồn thiện quy trình sản xuất, thu hồi tinh COD quy mô cơng nghiệp 2.2 Cần có nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng đánh giá hợp chất COD lĩnh vực khác nhau, đặc biệt lĩnh vực y tế DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Thị Thùy Vân, Nguyễn Đình Việt, Dương Minh Lam (2021), “Cấu trúc, sinh tổng hợp hoạt tính sinh học hợp chất cyclooligomer depsipeptide từ nấm”, T p hí kho h Đ i h ph m Hà Nội, 66(1), tr 124134 Nguyễn Đình Việt, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trương Xuân Lam, Dương Minh Lam (2021), “Đặc điểm hình thái sinh học phân tử chủng nấm Isaria Vườn Quốc gia Xuân Sơn khu bảo tồn thiên nhiên Copia”, T p hí khoa h Đ i h ph m Hà Nội, 66(1), tr 134-135 Nguyễn Thị Thùy Vân, Nguyễn Đình Việt, Dương Minh Lam (2021), “Đặc điểm hình thái, khả sinh trưởng sinh tổng hợp Cycooligomer depsipeptide chủng nấm Cordyceps sp CPA14V”, T p hí kho h Đ i h c Vinh, 1A/2021, tr 80-87 Nguyễn Thị Thuỳ Vân, Dương Minh Lam, Đào Việt Hùng, Vũ Thị Thu Lê, Phạm Thị Hồng Minh, Đỗ Tiến Lâm (2021), Nghiên cứu tách chiết phân lập beauvericin từ chủng nấm Cordyceps cateniannulata CPA14V, T p hí Kho h Cơng nghệ Đ i h Thái Ng yên, 226 (14), tr 79-86 https://doi.org/10.34238/tnu-jst.4921 Van, N T T., Lam, D T, Minh, P T H., Le, V T T, Hoan, B V., Lam, D M (2021) Studies on biological activities of extracts and beauvericin from Cordyceps cateniannulata CPA14V International Journal of Agricultural Technology Vol 17(6): 2449-2460 Nguyen Thi Thuy Van, Nguyen Dinh Viet, Duong Minh Lam (2022), “Effects of Culture Conditions on Growth and Cyclooligomer Depsipeptide Biosynthesis of Cordyceps sp CPA14V”, VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol 38, No xx-xx https://doi.org/10.25073/25881140/vnunst.5273 ... nấm ký sinh côn trùng Khu bảo tồn thiên nhiên Copia Vườn Quốc gia Xuân Sơn, lựa chọn nghiên cứu đề tài: ? ?Nghiên cứu đa dạng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide nấm ký sinh côn trùng Khu bảo. .. QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đa dạng nấm ký sinh côn trùng phân lập từ mẫu thu Khu bảo tồn thiên nhiên Copia Vƣờn quốc gia Xuân Sơn 3.1.1 Kết phân lập nghiên cứu đặc điểm nấm ký sinh côn trùng Khu bảo tồn. .. hệ phát sinh chủng loại chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập khu vực nghiên cứu 3.1.2 Một số nhận xét đa dạng chủng nấm ký sinh côn trùng Khu bảo tồn thiên nhiên Copia Vườn quốc gia Xuân Sơn