Bài viết Nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng phòng trừ sinh học ruồi đục trái Bactrocera sp. của chủng nấm ký sinh côn trùng Isaria fumosorosea Bb-V3 được nghiên cứu nhằm mục đích đánh giá một số điều kiện nuôi cấy và bước đầu khảo sát khả năng kiểm soát nhộng ruồi đục trái của loài nấm ký sinh côn trùng I. fumosorosea.
Tuyển tập Hội nghị Nấm học Toàn quốc lần thứ doi: 10.15625/vap.2022.0144 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ KHẢ NĂNG PHÒNG TRỪ SINH HỌC RUỒI ĐỤC TRÁI Bactrocera sp CỦA CHỦNG NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG Isaria fumosorosea Bb-V3 Nguyễn Thanh Triều1, Lê Thuỵ Tố Như1, Nguyễn Bảo Quốc2, Nguyễn Ngọc Phi Uyên1,3, Nguyễn Ngọc Bảo Châu1* Bộ môn Công nghệ Sinh học Nông nghiệp, Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Khoa Đào tạo Sau Đại học, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh *Email: nnbchau@gmail.com; chau.nnb@ou.edu.vn TĨM TẮT Nấm ký sinh trùng có ý nghĩa lớn khả ứng dụng kiểm soát sinh học bảo vệ thực vật Trong nghiên cứu này, chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 thu thập phân lập từ ve sầu bị ký sinh tỉnh Gia Lai Kết nghiên cứu số điều kiện môi trường pH, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy đến phát triển tản nấm mật độ bào tử cho thấy Isaria fumosorosea Bb-V3 nuôi cấy mơi trường PDA, pH 5,5, 29 ℃ có đường kính khuẩn lạc mật độ bào tử tăng trưởng cao khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức cịn lại Bên cạnh đó, hiệu lực gây chết nhộng ruồi đục trái Bactrocera dosalis mật độ 109 sau 10 ngày nuôi cấy đạt 73,72 % điều kiện phịng thí nghiệm Những kết nghiên cứu góp phần phục vụ cho nghiên cứu tìm khả ứng dụng phịng trừ sinh học lồi nấm Từ khố: Isaria fumosorosea, nấm ký sinh trùng, ruồi đục trái GIỚI THIỆU Chi Isaria bao gồm lồi nấm ký sinh trùng phân bố rộng rãi Việt Nam Isaria giai đoạn sinh sản vơ tính (giai đoạn hình thành bào tử đính) chi Cordyceps thuộc lớp Ascomycetes Hiện chi Isaria có triển vọng phịng trừ sâu hại trồng, điển lồi I fumosorosea, I javanica, I tenuipes [1, 2, 3] Tổ hợp loài I fumosorosea thu hút ý năm gần hiệu chúng kiểm soát sinh học loài rầy phấn trắng Bemisia số chủng thương mại bán, đặc biệt châu Âu dùng để kiểm soát sinh học rầy phấn trắng lồi sâu bệnh nhà kính [4] Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ độ ẩm đến khả nảy mầm bào tử nấm I fumosorosea cho thấy chủng nấm nảy mầm yếu điều kiện có ánh sáng (43 % RH, 28 oC) ổn định điều kiện khơng có ánh sáng luân phiên (98 % RH, 15 oC) với mô khí hậu ơn đới Sự nảy mầm giảm nhiệt độ tăng cao khả tồn bào tử cao nhiệt độ 45 ºC 50 ºC, 33 % RH 160 [5] Bên cạnh đó, kết nghiên cứu Jason cs (2008), nấm Isaria fumosorosea Wize (Ifr) (Paecilomyces fumosoroseus) (Hypocreales: Cordycipitaceae) tác nhân kiểm soát quan trọng rầy chổng cánh Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae), vecto truyền bệnh Greening có múi Florida, Mỹ Cho trưởng thành rầy chổng cánh tiếp xúc với nguồn bệnh mẫu thu 145 Nguyễn Thanh Triều cs đồng ruộng sau 72 giờ, nhiệt độ 24 - 25 oC 100 % số rầy thí nghiệm chết khơng có cá thể chết cơng thức đối chứng [6] Theo David cs., 2012 nghiên cứu đánh giá khả tương thích nấm Isaria fumosorosea ong kí sinh Lysiphlebus testaceipes rệp muội đen cam quýt Florida, Mỹ Thí nghiệm cho thấy sử dụng đơn lẻ nấm Isaria fumosorosea vòng hai tuần đầu tỷ lệ chết rệp muội đen khơng có khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng Tuy nhiên, sau rệp muội đen có tượng nhiễm bệnh [7] Kết nghiên cứu Pasco cs (2013) xác định khả tương thích nấm Isaria fumosorosea với hóa chất nơng nghiệp sử dụng để kiếm soát rầy chổng cánh Diaphorina citri [8] Rahim cs (2013) ghi nhận kết bước đầu sử dụng nấm Isaria fumosorosea kiểm soát rầy phấn trắng (Bemisia tabaci Genn.) Malaysia Trong điều kiện phịng thí nghiệm, nồng độ bào tử 106 CFU/mL, nấm có khả gây chết cao rầy phấn trắng, tỷ lệ chết đạt 91, 90, 86 89 % trứng, ấu trùng tuổi 2, tuổi tuổi [9] Hiện nay, nhiều nước giới nghiên cứu, ứng dụng nấm ký sinh trùng phịng trừ sinh học sâu hại Bên cạnh loài nấm truyền thống thuộc chi Beauvera Metarhizium, chi nấm Isaria bắt đầu nghiên cứu hứa hẹn tạo chế phẩm hiệu Kết bước đầu cho thấy lồi nấm chi Isaria có triển vọng phòng trừ nhiều loại sâu hại trồng Vườn Quốc gia Pù Mát, Nghệ An đánh giá có tính đa dạng sinh học cao, chứa đựng nguồn lợi lớn nấm kí sinh trùng Theo kết nghiên cứu Trần Ngọc Lân cs (2008) thu thập xác định 71 loài nấm thuộc 17 chi kí sinh vật chủ thuộc trùng khác nhau, có chi Isaria có lồi I farinosa, I javanica, I tennuiqes, Isaria sp.,…[10] Trần Ngọc Lân cs (2012) xác định 101 lồi nấm thuộc 21 chi kí sinh 11 trùng, nhện Nhìn chung nghiên cứu đa dạng sinh học hay ứng dụng chi nấm Isaria chưa phổ biến Nghiên cứu nhằm mục đích đánh giá số điều kiện nuôi cấy bước đầu khảo sát khả kiểm sốt nhộng ruồi đục trái lồi nấm ký sinh côn trùng I fumosorosea [11] VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nấm kí sinh trùng Isaria fumosorosea Bb-V3 Nguồn nấm kí sinh trùng phân lập từ mẫu ve sầu bị nấm kí sinh ngồi tự nhiên thu vườn cà phê, xã Sơ Pai, K’bang, tỉnh Gia Lai Mẫu nấm kí sinh trùng sau phân lập làm thuần, định danh hình thái sinh học phân tử định danh lồi Isaria fumosorosea Bb-V3 giữ giống Phịng thí nghiệm Động vật học Sau thí nghiệm thực Phịng thí nghiệm Động vật học, Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở, sở Bình Dương 2.2 Nguồn ruồi đục trái Bactrocera sp Thu thập xác định nguồn ruồi đục trái Bactrocera sp từ trái khế có dấu hiệu hư hỏng, có chấm đen chợ Thủ Dầu Một đem Phịng thí nghiệm Động vật học, Khoa Cơng nghệ Sinh học, trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, sở Bình Dương Ruồi đục trái tiến hành nhân nuôi cách để trái vào hộp nhựa vuông (cao 13 cm, đáy 9,5 cm), nắp có đục lỗ bọc lưới Ruồi đục trái trải qua vòng đời sinh sản, ấu trùng cho ăn sáp mật ong Ấu trùng sau hoá nhộng ngày tuổi theo dõi để thu thập tiến hành làm thí nghiệm 146 Nghiên cứu số điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng khả phòng trừ sinh học… 2.3 Ảnh hưởng pH đến hình thành bào tử chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 Nhằm đánh giá ảnh hưởng pH lên sinh bào tử nấm kí sinh côn trùng Isaria fumosorosea Bb-V3 môi trường PDA, thí nghiệm tiến hành với mức độ pH khác nhau: 5; 5,5; 6; 6,5; Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, thí nghiệm lặp lại lần, lần lặp lại đĩa Petri Ø 90 Số bào tử/mL mẫu tính thời điểm 6, 8, 10, 12 ngày sau nuôi cấy theo phương pháp đếm trực tiếp buồng đếm Thoma: Số bào tử/mL = 4a ×106 b đó: a: Số bào tử có thể tích huyền phù ứng với diện tích nhỏ (= 1/400 mm2) x độ sâu 0,1 mm, b: Hệ số pha loãng, Số ô nhỏ buồng đếm Thoma đếm lần đếm dịch bào tử nấm ô nhỏ, Mật độ bào tử/cm2 = số bào tử (bào tử/mL)/ diện tích khuẩn lạc 2.4 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên phát triển nấm kí sinh trùng Isaria fumosorosea Bb-V3 Nhằm đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ khác 27 ºC, 28 ºC, 29 ºC 30 ºC lên sinh bào tử nấm kí sinh trùng Isaria fumosorosea Bb-V3 mơi trường PDA, pH tối ưu từ thí nghiệm 2.3 Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, thí nghiệm lặp lại lần, lần lặp lại đĩa Petri Ø 90 Đường kính khuẩn lạc đo sau 12 ngày nuôi cấy Mật độ bào tử/cm2 tính tương tự thí nghiệm 2.3 2.5 Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên phát triển nấm kí sinh trùng Isaria fumosorosea Bb-V3 Mục đích: Để đánh giá ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 6, 8, 10, 12, ngày lên sinh bào tử nấm kí sinh côn trùng Isaria fumosorosea Bb-V3 tốt môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) pH tối ưu từ thí nghiệm 2.3 nhiệt độ tối ưu từ thí nghiệm 2.4 Chỉ tiêu theo dõi phát triển nấm Isaria fumosorosea Bb-V3: • Mật độ bào tử/cm2 = số bào tử (bào tử/mL)/diện tích khuẩn lạc tính tương tự thí nghiệm 2.3 (Sau 6, 8, 10, 12 ngày ni cấy) • Tốc độ phát triển trung bình (mm/ngày): Đo độ dài đường kính trục khuẩn lạc sau ngày nuôi cấy theo công thức [12]: d= d1 ×d2 đó: d1 d2 độ dài đường kính chéo phần khuẩn lạc phân bố đĩa Petri 147 Nguyễn Thanh Triều cs 2.6 Khảo sát hiệu lực tiêu diệt nhộng ruồi đục trái Bactrocera dosalis dịch bào tử nấm từ chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 mật độ bào tử khác điều kiện phịng thí nghiệm Thí nghiệm bố trí theo thể thức hồn tồn ngẫu nhiên với nồng độ 107, 108, 109 bào tử/mL dịch bào tử nấm, nghiệm thức đối chứng phun nước lần lặp lại Mỗi nghiệm thức 20 nhộng ruồi đục trái Bactrocera dosalis Dịch bào tử nấm với nồng độ khác nghiệm thức phun mL/hộp Chuẩn bị chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 cấy ống nghiệm môi trường PDA nghiêng sau 12 ngày Pha loãng ống nghiệm với nước cất vơ trùng có bổ sung 0,05 % Tween 20 với nồng độ 107, 108, 109 Tiến hành vortex khoảng 30 giây để dịch bào tử nấm trộn với Chỉ tiêu ghi nhận số nhộng chết sau 6, 8, 10, 12 ngày ba nồng độ Nhộng chết tách riêng đựng đĩa petri nhựa có bơng gịn thấm nước để theo dõi nấm kí sinh Đánh giá hiệu tiêu diệt nhộng ruồi đục trái theo công thức Abbot (1925): E (%) = [(C-T)/C] x 100 đó: - E: Tỷ lệ (%) nhộng ruồi đục trái chết, - C: Số nhộng ruồi đục trái sống lô đối chứng, - T: Số nhộng ruồi đục trái sống lơ thí nghiệm, - Đánh giá tỉ lệ nấm kí sinh trùng 2.7 Xử lý số liệu Số liệu ghi nhận xử lý phần mềm excel thống kê chương trình Mstatc kiểm định Duncan KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng pH đến hình thành bào tử chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 Bảng Ảnh hưởng pH đến đường kính khuẩn lạc hình thành bào tử chủng nấm I fumosorosea Bb-V3 sau 12 ngày nuôi cấy Mức độ pH Đường kính khuẩn lạc (cm) Mật độ bào tử ( 109/cm2) 3,17 ± 0,17d 0,15 ± 0,04d 6,5 3,81 ± 0,25c 0,41 ± 0,06c 4,44 ± 0,26b 1,61 ± 0,18b 5,5 5,40 ± 0,26a 3,15 ± 1,63a Ghi chú: Trong cột, số có mẫu tự khơng có khác biệt mức ý nghĩa 0,05 (P