KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH CỦA CHẾ PHẨM ENZYME PECTINASE CÔNG NGHIỆP Xác định hoạt tính enzyme pectinase công nghiệp. Xác định được pH, nhiệt độ hoạt động tối ưu cho chế phẩm enzyme pectinase. Hiện nay, hệ thống enzyme pectinase được chia thành 2 nhóm chính: Hydrolase và transeliminase với đặc điểm chung nhất là làm giảm độ nhớt của dung dịch pectin và làm giảm phân tử lượng của các sản phẩm tạo thành. Cũng như các loại enzyme khác, enzyme pectinase cũng nhạy cảm với sự thay đổi của nhiệt độ và pH môi trường. Nhiệt độ, pH của môi trường ở mỗi mức độ khác nhau sẽ có mức độ ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của enzyme khác nhau. Và mỗi loại enzyme sẽ có ngưỡng nhiệt độ, pH tối ưu khác nhau mà tại đó enzyme hoạt động cao nhất. Ngoài ra, còn nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến hoạt động của các chế phẩm enzyme như các ion kim loại, ánh sáng, sóng siêu âm, phương thức và thời gian bảo quản enzyme.
BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ ENZYME ĐỀ TÀI KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH CỦA CHẾ PHẨM ENZYME PECTINASE CƠNG NGHIỆP GVHD: Nguyễn Thị Nam Phương Sinh viên thực hiện: Nhóm QTTT MSSV: 2008190440 LTH MSSV: 2008190334 TNHL MSSV: 2008190364 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, THÁNG 04 NĂM 2022 THỰC HÀNH CHỦ ĐỘNG: KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH CỦA CHẾ PHẨM ENZYME PECTINASE CƠNG NGHIỆP Mục đích Xác định hoạt tính enzyme pectinase cơng nghiệp Xác định pH, nhiệt độ hoạt động tối ưu cho chế phẩm enzyme pectinase Cơ sở lý thuyết - Pectinase enzyme xúc tác thủy phân pectin, sản phẩm tạo thành trình acid galacturonic, galactose, arabinose, methanol nhóm ezyme ứng dụng rộng rãi công nghiệp đứng sau protease amylase - Pectinase có tác dụng làm tăng hiệu suất chất chiết, làm lọc dịch dễ dàng, làm tăng hiệu suất sản phẩm nên pectinase thường đươc ứng dụng sản xuất rượu vang, nước trái nước uống khơng có cồn, nước trái cô đặc, mứt nhừ, mứt đông, nước giải khát, sản xuất cà phê cà phê hòa tan,…Khơng vậy, chế phẩm pectinase cịn ứng dụng việc trích ly hợp chất dược liệu, hợp chất tạo màu, bổ sung vào thức ăn chăn nuôi,… - Hiện nay, hệ thống enzyme pectinase chia thành nhóm chính: Hydrolase transeliminase với đặc điểm chung làm giảm độ nhớt dung dịch pectin làm giảm phân tử lượng sản phẩm tạo thành - Cũng loại enzyme khác, enzyme pectinase nhạy cảm với thay đổi nhiệt độ pH môi trường Nhiệt độ, pH mơi trường mức độ khác có mức độ ảnh hưởng đến khả hoạt động enzyme khác Và loại enzyme có ngưỡng nhiệt độ, pH tối ưu khác mà enzyme hoạt động cao - Ngồi ra, cịn nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động chế phẩm enzyme ion kim loại, ánh sáng, sóng siêu âm, phương thức thời gian bảo quản enzyme Hóa chất - Dụng cụ - Thiết bị 3.1 Hóa chất STT Tên hóa chất Quy cách SL/ĐVT Pectinase công nghiệp Bột 100g Pectin công nghiệp 3,5 - acid dinitrosalicylic (DNS) D-galacturonic acid 1% Nước cất NaOH Potasium sodium tartrate Bột Rắn Rắn Lỏng Rắn Rắn 100g 5g 2g 10000 mL 8g 150g 10 (KNaC4H4O6·4H2O) Phenolphtalein HCl Đệm acid citric - Na2HPO4 Lỏng 0.1N PH = 3, 4, 5 mL 50 mL 300 mL 11 Acid citric 0.1M 200 mL 12 Na2HPO4 0.2M 1000 mL 13 NaH2PO4 0.2M 500 mL 14 Đệm Phosphate pH = 6, 7, 300 mL 15 Giấy nhôm Cuộn cuộn 16 17 Đệm acetate Sodium acetate (CH3COONa) pH=5.5 Rắn 50 mL 15g 18 Acetic acid đặc (CH3COOH) Lỏng mL 3.2 Dụng cụ STT 10 11 12 13 14 15 16 17 TÊN DỤNG CỤ Bình tia Cốc thủy tinh Bình tam giác Ống nghiệm Giá ống nghiệm Pipet Bình định mức Xoong nhôm Đũa thủy tinh Ống đong Phễu thủy tinh Micropipette Đầu típ Quả bóp cao su Đũa thủy tinh 3.3 Thiết bị Quy cách 100, 250, 500, 1000 mL 250 mL �18 Giá inox 2, 5, 10 mL 50, 100, 250, 500 mL 25 mL �60 STT TÊN THIẾT BỊ Bếp điện Bể ổn nhiệt Tủ ấm Cân kỹ thuật Máy khuấy từ Máy lắc Máy vortex Máy đo quang phổ Quy cách số lẻ Vùng UV - VIS 3.4 Cách pha hóa chất - Pha dung dịch đệm acid citric - Na2HPO4 (Đệm citrate): Dung dịch acid citric 0.1M: Hòa tan 10.504g acid citric (C 6H8O7) nước cất → Định mức đến 500mL → Dung dịch A Dung dịch Na2HPO4 0.2M: Hòa tan 71.7g Na2HPO4.12H2O nước cất → Định mức đến 500mL → Dung dịch B Dung dịch đệm acid citric - Na2HPO4 (Đệm citrate) có pH khác phụ thuộc vào số mL dung dịch A B với tổng thể tích 100 mL Acid - citric 0.1M Na2HPO4 (Dung dịch A) 79.45 mL 61.45 mL 48.50 mL Pectine 1%: Cân 1g peptin cho vào 0.2M pH (Dung dịch B) 20.55 mL 3.0 38.55 mL 4.0 51.50 mL 5.0 cốc hòa tan nước ấm → Định mức đến 100mL - Pectinase 2%: Cân 2g pectinase cho vào cốc hòa tan 200mL dung dịch đệm citrate pH=5 - Thuốc thử DNS 1%: Cân 5g DNS cho vào cốc hòa tan nước cất 50 oC → Định mức đến 200mL → Dung dịch A Cân 8g NaOH cho vào cốc hòa tan nước cất → Định mức đến 50mL → Dung dịch B Cân 150g muối Potasium sodium tartrate (KNaC4H4O6·4H2O) cho vào cốc hòa tan nước cất → Định mức đến 150mL→ Dung dịch C Cho dung dịch B C vào dung dịch A → Bổ sung nước cất cho đủ 500 mL bảo quản dung dịch chai thủy tinh sẫm màu → Chuẩn lại DNS 1% cách thêm giọt phenolphtalein → Nhỏ từ từ dung dịch HCl 0.1N màu hồng phenolphtalein (Nếu dùng hết - mL HCl 0.1N được) - Pha dung dịch đệm acetate pH = 5.5: Cân 13.6g sodium acetate hòa tan 25 mL nước cất 50oC → Cho từ từ 2.5 mL acetic acid đặc → Định mức nước cất đến 50 mL - D-galacturonic acid 1%: Cân 1g D-galacturonic acid hòa tan nước cất định mức đến 100mL - Dung dịch đệm phosphate (pH 6, 7, 8): Dung dịch NaH2PO4 0.2M: Cân 27.8g NaH2PO4 cho vào cốc hòa tan nước cất → Định mức đến 500mL → Dung dịch a Dung dịch Na2HPO4 0.2M: Cân 71.7g Na2HPO4.12H2O cho vào cốc hòa tan nước cất → Định mức đến 500mL → Dung dịch b Dung dịch đệm phosphat có pH khác phụ thuộc vào số mL dung dịch a số mL dung dịch b với tổng thể tích 200ml NaH2PO4 0.2M Na2HPO4 0.2M Nước cất pH (Dung dịch a) 87.7 mL 39.0 mL 5.3 mL (Dung dịch b) 12.3 mL 61.0 mL 94.7 mL 100 mL 100 mL 100 mL 6.0 7.0 8.0 Nội dung thực hành 4.1 Xác định hoạt tính enzyme pectinase phương pháp so màu Phương pháp so màu: Dựa việc so sánh cường độ màu dung dịch nghiên cứu với cường độ màu dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định Nguyên tắc: Enzyme Pectinase + Pectin → Acid galacturonic → Thêm thuốc thử DNS (dinitrosalicylic acid) → Đo mật độ quang bước sóng 575nm Dựa vào đồ thị đường chuẩn glucose với thuốc thử DNS tính hàm lượng đường khử mẫu nghiên cứu Hoạt tính enzyme pectinase đo lượng đường khử cắt từ pectin phương pháp dinitrosalicylic acid (DNS) Một đơn vị hoạt độ enzyme pectinase lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1mol acid D- galacturonic từ pectin phút 37oC, pH=5.5 Cách tiến hành: Xây dựng đường chuẩn D-galacturonic acid nồng độ khác (0, 1, 2, 3, 4, 5) cách pha dd D-galacturonic acid 1% với nước cất theo tỷ lệ tương ứng Sau đó, thêm vào ống 3ml thuốc thử DNS: Hóa chất Đơn vị Các ống nghiệm D-galacturonic acid 1% Nước cất Nồng độ D-galacturonic acid Thuốc thử DNS 1% Lắc để yên 20 phút Đo OD λ=575nm - mL mL mg/mL mL 0.0 0.1 1.0 0.9 3mL 0.2 0.8 0.127 0.326 0.3 0.7 0.4 0.6 0.5 0.5 0.534 0.731 0.938 Dùng phần mềm Microsoft Excel để vẽ đường chuẩn với trục tung y giá trị đo OD bước sóng 575nm, trục hồnh x nồng độ D-galacturonic acid, hệ số tương quan R2, đồ thị có dạng đường thẳng y= ax + b Xác định hoạt tính enzyme pectinase: Lấy 0,5 ml enzymepectinase 2% + 0.5 ml pectin 1% → Thêm 0.5ml đệm acetate 0.1M → Để yên 37 oC 60 phút → Thêm 3ml thuốc thử DNS 1% → Đun sôi 15 phút (để thuốc thử màu) → Đo OD bước sóng 575 nm → Xác định hoạt độ enzyme pectinase Một đơn vị hoạt tính enzyme pectinase đo 1µmol galacturonic acid giải phóng phút 1mL 4.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt động enzyme pectinase - Tiến hành thí nghiệm: Chuẩn bị ống nghiệm tiến hành sau: 4.3 Khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt động enzyme pectinase Hóa chất Đơn Các ống nghiệm vị Pectin 1% mL 1.0 Dung dịch đệm acetate mL 1.0 Để yên 37oC 10 phút Pectinase 2% 1.0 Giữ nhiệt độ 25oC 30oC 37oC 40oC 45oC 50oC 55oC Để yên 15 phút DNS 1% 3.0 Bịt đầu ống nghiệm giấy nhôm, lắc đun 100oC 15 phút Để nguội nhiệt độ phòng Đo OD λ=575nm 0.401 0.277 0.205 0.185 0.153 0.117 0.401 - Tiến hành thí nghiệm: Chuẩn bị ống nghiệm với dung dịch đệm pH tương ứng từ - chuẩn bị 6.3.4 Tiến hành sau: Hóa chất Đơn vị Dung dịch đệm với khoảng mL Các ống nghiệm Kết 5.1 Xác định hoạt độ enzyme pectinase phương pháp so màu 0.244 0.257 1.0 pH khác Pectinase 2% mL 1.0 Pectin 1% mL 1.0 Để yên 30 phút nhiệt độ phòng DNS 1% mL 3.0 Bịt đầu ống nghiệm giấy nhôm đun cách thủy 15 phút Để nguội nhiệt độ phòng Đo OD λ=575nm 0.241 0.226 0.246 0.279 Đồ thị đường chuẩn D-galcturonic: Đường chuẩn D-galcturonic có dạng: y = 0.2027x - 0.0769 với R2 = 0.9999 Từ đường chuẩn D-galacturonic, ta có: X nồng độ acid D-galcturonic (mg/ml), X = 4,829 (mg/ml) Y giá trị OD đo λ=575nm, Y = 0,902nm Hoạt độ enzyme pectinase: HđPe = (UI/mL) Trong đó: X lượng acid D-galcturonic suy từ đường chuẩn (mg) V tổng thể tích hỗn hợp enzyme phản ứng (mL) v thể tích dịch lọc đem phân tích (mL) K độ pha loãng mẫu t thời gian phản ứng (phút) hệ số chuyển đổi đơn vị HđPe hoạt độ enzyme pectinase (UI/mL) - Ta có: Lượng acid D-galcturonic (X) = 4,829 (mg/ml) Tổng thể tích hỗn hợp enzyme phản ứng (V) = Thể tích dịch lọc đem phân tích (v) = 1.5mL Mẫu pha loãng lần trước đo OD nên độ pha loãng mẫu Thời gian phản ứng 60 phút nên t=60 Hoạt độ enzyme pectinase: HđPe = (UI/mL) = = 1,245 (UI/mL) 5.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt động enzyme pectinase Đường chuẩn D-galcturonic có dạng: y = 0.2027x - 0.0769 với R2 = 0.9999 Hoạt độ enzyme pectinase: HđPe = (UI/mL) Kết đo OD nhiệt độ khảo sát: Nhiệt độ (oC) 30 OD 0.401 Nồng độ acid 37 0.277 40 0.205 45 0.185 50 0.153 55 0.117 D- 1.599 0.987 0.632 0.533 0.375 0.198 0.549 0.339 0.217 0.183 0.129 0.068 galcturonic Hoạt độ enzyme Đồ thị ảnh hưởng nhiệt độ: Nhận xét: - Hoạt tính enzyme mạnh 30°C nhiệt độ tăng hoạt tính enzyme giảm Vậy hoạt tính enzyme tối ưu 30°C (0.549 UI/ml) - Có thể thấy, đa số enzyme bị hoạt tính nhiệt độ 70°C phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhiệt độ 30-40°C 5.3 Khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt động enzyme pectinase Đường chuẩn D-galcturonic có dạng: y = 0.2027x - 0.0769 với R2 = 0.9999 Hoạt độ enzyme pectinase: HđPe = (UI/mL) Kết đo OD nhiệt độ khảo sát: pH OD 0.241 Nồng độ acid 0.226 0.246 0.279 0.244 0.257 D- 1.568 1.494 1.593 1.765 1.583 1.647 2.694 2.567 2.737 3.033 2.720 2.830 galcturonic Hoạt độ enzyme Đồ thị ảnh hưởng pH : Nhận xét: Hoạt tính enzyme đạt giá trị lớn pH (3.033 UI/ml) hoạt tính enzyme thấp pH (2.567 UI/ml) Vậy pH tối ưu cho enzyme pectinase hoạt động pH 6 Kết luận Hoạt tính enzyme pectinase phụ thuộc vào ảnh hưởng nhiệt độ pH: Pectinase hoạt động tối ưu điều kiện nhiệt độ ơn hịa (30°C) Mặc dù, nhiệt độ cao tốc độ phản ứng xúc tác hóa học lớn enzyme khơng bền tác dụng nhiệt bị hoạt tính nhiệt độ cao → Vận tốc phản ứng enzyme xúc tác tăng theo nhiệt độ giới hạn xác định mà phân tử enzyme cịn bền chưa bị biến tính pH tác dụng vào trạng thái ion phân tử enzyme (nhất trung tâm hoạt động enzyme), chất độ bền vững phân tử enzyme ảnh hưởng kết hợp phần protein (enzyme) phần phụ protein (coenzyme) pH cao hay thấp làm ảnh hưởng đến hoạt động enzyme, làm biến tính enzyme ảnh hưởng đến điện tích phân tử enzyme chất Mỗi enzyme có giới hạn pH định mà enzyme hoạt động tối ưu Pectinase hoạt động tối ưu điều kiện pH=6 Cần xác định nhiệt độ pH tối ưu cho enzyme hoạt động để ứng dụng enzyme sản xuất cách hiệu mang lại giá trị kinh tế cao Tài liệu tham khảo [7.1] Lê Thanh Mai cộng (2009) Các phương pháp phân tích ngành cơng nghệ lên men [7.2] Hiền, đ T., & trang, h P P (2019) Bước đầu nghiên cứu tạo enzyme pectinase dạng bột từ aspergillus niger khảo sát số đặc tính chế phẩm Tạp chí khoa học đại học mở thành phố hồ chí minh-kỹ thuật cơng nghệ, 14(1), 27-38 [7.3] Đỗ Thị Hiền (2021) Giáo trình “Kiểm nghiệm chế phẩm enzyme” Trường đại học Công nghiệp Thực phẩm thành phố Hồ Chí Minh 10 ... ĐỘNG: KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH CỦA CHẾ PHẨM ENZYME PECTINASE CƠNG NGHIỆP Mục đích Xác định hoạt tính enzyme pectinase cơng nghiệp Xác định pH, nhiệt độ hoạt động tối ưu cho chế phẩm enzyme pectinase. .. Xác định hoạt độ enzyme pectinase Một đơn vị hoạt tính enzyme pectinase đo 1µmol galacturonic acid giải phóng phút 1mL 4.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt động enzyme pectinase - Tiến... Hoạt độ enzyme Đồ thị ảnh hưởng nhiệt độ: Nhận xét: - Hoạt tính enzyme mạnh 30°C nhiệt độ tăng hoạt tính enzyme giảm Vậy hoạt tính enzyme tối ưu 30°C (0.549 UI/ml) - Có thể thấy, đa số enzyme