Chuong 4 cac ky thuat phan tich acid nucleic

MỘT SỐ KỸ THUẬT PHÂN TÍCH DỰA TRÊN ACID NUCLEIC  Nhận biết gen (PCR, RFLP, lai DNA, lai DNA-protein, xác định trình tự gen )  Định lượng số gen (RT-PCR)  Biểu gen (lai Northern, DNA microarray, điện di hai chiều kết hợp phân tích khối phổ, lai Western, phân tích hoạt tính )  Aptamer ứng dụng Làm để biết có mặt gen mẫu nghiên cứu? Khi gen bị đột biến? Làm để phát hiện? KỸ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR) VÀ CÁC KỸ THUẬT LIÊN QUAN Những điểm cốt yếu kỹ thuật PCR hay nhân gen ống nghiệm: Gen đích (hoặc DNA chứa gen đích) Mồi hay primer đặc hiệu cho gen đích Các nguyên liệu tổng hợp DNA DNA polymerase với hoạt tính tổng hợp chuỗi polynucleotide Các kỹ thuật PCR cải biến: PCR lồng (nested PCR), RAPD, PCR đa cặp mồi (multiplex-PCR), RT-PCR, PCR định lượng (Real-time PCR), PCR miễn dịch, PCR-RFLP… BƯỚC CƠ BẢN CỦA PCR 5’ 3’ 3’ 5’ • Khởi đầu Biến tính 5’ : Primer (Forward Primer) 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ : Primer (Reverse Primer) 3’ • Chu kỳ 3’ 5’ 5’ Gắn mồi 5’ 3’ 3’ 5’ • Chu kỳ 5’ • Chu kỳ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ Kéo dài chuỗi 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ KỸ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE Số đoạn DNA đích 1012 106 Nf = No.(1+Y)n-2 30 SỐ CHU KỲ (n)  Nf số đoạn ADN đích cuối  No số khuôn ban đầu  Y hiệu kéo dài primer qua chu kỳ (tối đa = 1) NHÂN BẢN ĐOẠN GEN ĐẶC HIỆU CỦA XOẮN KHUẨN GIANG MAI VÀ KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT (Phan et al., 2008) kb 10 500 206 bp 121 bp Xoắn khuẩn Ký sinh trùng sốt rét P falciparum (206 bp) giang mai P vivax (121 bp) T pallidum VNTR, PCR VÀ VIỆC NHẬN DẠNG CÁ THỂ Trẻ A B C D E Ai (trong số A, B, C, D, E) bố đứa trẻ? Điểm cắt RE: 13 Loài A: Loài gốc (khơng có đột biến) Lồi B: Đột biến làm xuất điểm cắt đoạn 13 kb Loài C: Tương tự lồi B cịn có đột biến điểm cắt đoạn kb Phổ băng RFLP sử dụng đoạn ADN loài A làm mẫu dò kb A B C 13 11 KỸ THUẬT ĐA HÌNH ĐỘ DÀI CÁC ĐOẠN PHÂN CẮT GiỚI HẠN Restriction fragment length polymorphism-RFLP KỸ THUẬT PCR-RFLP để phát đột biến điểm hay nhận dạng Fig DNA electrophoresis of PCR product of target gene habouring Wilson Disease Arg778 mutation after digestion with Msp I (CCGG) Lane and 2: PCR products of normal subjects before and after digestion with Msp I, respectively Lane to 13: PCR product of 10 WD patients after digestion with Msp I (295 = 236 + 59) CCGG -> CCTG (Do TTH et al, 2010) PHÁT HiỆN ĐỘT BiẾN Arg778Leu Ở BỆNH WILSON A B Sơ đồ minh hoạ kỹ thuật AFLP AATTCCAC GGTG TCGT AGCAAT Đoạn gen cắt EcoRI MseI Gắn với adaptor ligase GTAGTAGACTGCGTACCAATTCCAC CAGCATCTGACGCATGGTTAAGGTG GACTGCGTACCAATTCCAC Các nucleotide chọn lọc AGCAATGAGTCCTGAGTAG TCGTTACTCAGGACTCATCGTC AGCAATGAGTCCTGAGTAGCAG Nhân PCR EcoRI-adaptor -Đoạn phân cắt MseI adaptor MẪU DÒ/OLIGO SUY BIẾN Khi phải dùng oligo suy biến? Khái niệm “Motif”, “Signature” Nên chọn oligo suy biến nào? Real-time PCR • Tương quan logarit số số chu kỳ ngưỡng • Nội chuẩn/gen nội chuẩn PHÁT HIỆN, ĐỊNH LƯỢNG SỐ COPY MANG ĐỘT BIẾN BẰNG REAL-TIME PCR Mồi Huỳnh quang (FRET) Taqman Để nhận biết có mặt gen X mẫu nghiên cứu, cách tốt là: a)Tách gen X xác định trình tự b)Sử dụng PCR với cặp mồi đặc hiệu để nhân gen X lên c)Dùng enzyme giới hạn cắt hệ gen chứa gen X để xem gen có bị cắt điểm xác định hay không d)Dùng kháng thể đặc hiệu protein gen X mã hố xem có mặt protein X mẫu KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE (1) KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE (2) Xác định trình tự nucleotit tự động hệ thống điện di mao quản DNA microarray nghiên cứu biểu hiÖn gen RNA APTAMER VÀ ỨNG DỤNG  Là đoạn RNA với vùng biến đổi hai vùng đầu cố định có trình tự biết  Nhân lên PCR  Cho qua cột có gắn chất quan tâm, rửa bỏ aptamer không gắn, rửa chiết để thu aptamer gắn đặc hiệu (làm giàu) Phiên mã ngược để cDNA Nhân dòng xác định trình tự Ứng dụng cho mục đích khác nhờ tính chất gắn đặc hiệu    ... minh hoạ kỹ thuật AFLP AATTCCAC GGTG TCGT AGCAAT Đoạn gen cắt EcoRI MseI Gắn với adaptor ligase GTAGTAGACTGCGTACCAATTCCAC CAGCATCTGACGCATGGTTAAGGTG GACTGCGTACCAATTCCAC Các nucleotide chọn lọc... chu kỳ (tối đa = 1) NHÂN BẢN ĐOẠN GEN ĐẶC HIỆU CỦA XOẮN KHUẨN GIANG MAI VÀ KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT (Phan et al., 2008) kb 10 500 206 bp 121 bp Xoắn khuẩn Ký sinh trùng sốt rét P falciparum (206