(LUẬN văn THẠC sĩ) xác định chỉ tiêu an toàn và hàm lượng kháng thể ở lợn được tiêm vacxin vô hoạt porcine circovirus type 2 sản xuất thử nghiệm từ chủng phân lập tại việt nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LƢƠNG THỊ HỒNG NHÂM XÁC ĐỊNH CHỈ TIÊU AN TOÀN VÀ HÀM LƯỢNG KHÁNG THỂ Ở LỢN ĐƯỢC TIÊM VACXIN VÔ HOẠT PORCINE CIRCOVIRUS TYPE SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM TỪ CHỦNG PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 download by : skknchat@gmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu đƣợc trình bày luận văn trung thực, khách quan chƣa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn đƣợc cảm ơn, thơng tin trích dẫn luận văn đƣợc rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày… tháng… năm 2016 Tác giả luận văn Lƣơng Thị Hồng Nhâm i download by : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nhận đƣợc hƣớng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi đƣợc bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc Học viện, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ Khoa học Cơng nghệ, Ban chủ nhiệm chƣơng trình KH&CN trọng điểm cấp Nhà nƣớc “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học”, Văn phịng chƣơng trình trọng điểm cấp Nhà nƣớc, Cổ phần phát triển công nghệ nông thôn (RTD), Tổ chức Cá nhân giúp đỡ việc triển khai nội dung đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn./ Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Lƣơng Thị Hồng Nhâm ii download by : skknchat@gmail.com MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn Thesis abstract Phần Mở đầu Phần 2: Tổng quan tài liệu 2.1 Một số hiểu biết bệnh (PCV2) 2.1.1 Hình thái, cấu trúc PCV2 2.1.2 Phân loại PCV2 2.1.3 Tính chất ni cấy 2.1.4 Sức đề kháng 2.1.5 Dịch tễ học mô tả PCV2 2.2 Hiểu biết hội chứng bệnh PCV2 gây 11 2.3 Phòng bệnh PCVAd 13 2.3.1 Mối quan hệ quản lý đàn điều kiện chăn nuôi với trình nhiễm PCV2 13 2.3.2 Vệ sinh phịng bệnh 13 2.3.3 Đánh giá chất lƣợng hiệu vacxin phòng bệnh PCV2 14 2.3.4 Điều trị 17 2.4 Tình hình nghiên cứu PCV2 17 Phần Nội dung phƣơng pháp nghiên cứu 21 3.1 Nội dung, địa điểm, đối tƣợng nguyên liệu nghiên cứu 21 3.1.1 Nội dung nghiên cứu 21 3.1.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 21 3.1.3 Đối tƣợng nghiên cứu 21 3.1.4 Nguyên liệu nghiên cứu 21 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 24 iii download by : skknchat@gmail.com 3.2.1 Phƣơng pháp tách, tinh adn tổng số 24 3.2.2 Phƣơng pháp tách, tinh arn tổng số 25 3.2.3 Phƣơng pháp pcr phát virus mycoplasma tạp nhiễm 26 3.2.4 Phƣơng pháp thực phản ứng real-time pcr 27 3.2.5 Phƣơng pháp cô đặc virus 27 3.2.6 Phƣơng pháp tinh khiết virus 27 3.2.7 Phƣơng pháp vô hoạt virus 28 3.2.8 Phƣơng pháp kiểm tra vô trùng vacxin PCV2 28 3.2.9 Phƣơng pháp gây miễn dịch cho động vật lấy mẫu huyết 28 3.2.10 Phƣơng pháp mổ khám 29 3.2.11 Phƣơng pháp phát kháng thể kháng PCV2 30 3.2.12 Phƣơng pháp làm tiêu vi thể 31 3.2.13 Phƣơng pháp xử lý số liệu 31 Phần Kết thảo luận 32 4.1 Kết chế tạo vacxin vô hoạt PCV2 thử nghiệm 32 4.1.1 Kết xác định có mặt PCV2 giống gốc để chế vacxin 32 4.1.2 Kết giám định độ khiết PCV2 32 4.1.3 Kết tinh khiết pcv2 dùng cho sản xuất vacxin thử nghiệm 33 4.1.4 Kết nghiên cứu vô hoạt PCV2 để chế vacxin 34 4.1.5 Kết kiểm tra vô trùng vacxin vô hoạt PVC2 35 4.2 Kết đánh giá chất lƣợng vacxin vô hoạt pcv2 thử nghiệm 37 4.2.1 Kết kiểm tra tiêu an tồn vacxin vơ hoạt PCV2 tiêm thử nghiệm lợn 37 4.2.2 Kết nghiên cứu so sánh hàm lƣợng kháng thể lợn đƣợc tiêm vacxin vô hoạt pcv2 thử nghiệm vacxin thƣơng mại 45 Phần Kết luận kiến nghị 47 5.1 Kết luận 47 5.2 Kiến nghị 47 Tài liệu tham khảo 48 Phụ lục 54 iv download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN : Deoxyribose Nucleic Acid CSFV : Classical Swine Fever Virus DMEM : Dulbecco's Modified Eagle's Medium ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay IFA : ImmunoFluoresecence Assay MHP : Mycoplasma HyoPneumoniae ORF : Open Reading Frame PAdV : Porcine Adenovirus PBS : Phosphate Buffered Saline PCI : Phenol- Chloroform- Isoamyl alcohol PCR : Polymerase Chain Reaction PCV : Porcine CircoVirus PCV1 : Porcine CircoVirus type PCV2 : Porcine CircoVirus type PCVAD : Porcine CircoVirus Associated Disease PDNS : Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome PEDV : Porcine Epidemic Diarrhea Virus PK15 : Pig Kidney 15 cells PMWS : Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome PPV : Porcine ParvoVirus PRDC : Porcine Respiratory Disease Complex PRRS : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus PRV : porcine Pseudorabies Virus RT-PCR : Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction S/N : Sample-to-Negative value TE : Tris-EDTA TCID50 : Tissue Culture 50% Infectious Dose TGEV : Transmissible GastroEnteritis Virus BEI : Binary ethyleneimine v download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Triệu chứng bệnh liên quan đến PCV2 12 Bảng 3.1 Trình tự mồi dùng phát giám định genotype PCV2 22 Bảng 3.2 Trình tự mồi dùng xác định tạp nhiễm virus mycoplasma 23 Bảng 3.3 Trình tự cặp mồi, đầu dò dùng xác định hiệu giá PCV2 24 Bảng 3.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 26 Bảng 3.5 Chu trình nhiệt hai giai đoạn phản ứng real-time PCR 27 Bảng 4.1 Ảnh hƣởng tốc độ ly tâm tới khả tủa virus 33 Bảng 4.2 Kết kiểm tra vô hoạt PCV2 35 Bảng 4.3 Kết kiểm tra vô trùng vacxin vô hoạt PCV2 36 Bảng 4.4 Khối lƣợng lợn sau tiêm vacxin thƣơng mại CircoFLEX 37 Bảng 4.5 Khối lƣợng lợn sau tiêm vacxin thử nghiệm CircoVNUA 38 Bảng 4.6 Khối lƣợng lợn đối chứng 39 Bảng 4.7 Mức sai khác khối lƣợng cơng thức thí nghiệm 40 Bảng 4.8 Kết theo dõi mức đồng khối lƣợng 41 Bảng 4.9 Tổng hợp biến đổi bệnh lý đại thể lợn tiêm vacxin PCV2 44 vi download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Đƣờng truyền lây genotype PCV2 10 Hình 4.1 Kết PCR xác định PCV2 giống gốc để chế vacxin 32 Hình 4.2 Kết giám định khiết giống PCV2 33 Hình 4.3 Kết đặc tinh khiết PCV2 34 Hình 4.4 Diễn biến tăng khối lƣợng lợn sau tiêm vacxin 40 Hình 4.5 Biến đổi bệnh lý đại thể hạch lympho 42 Hình 4.6 Biến đổi bệnh lý đại thể phổi 43 Hình 4.7 Biến đổi bệnh lý vi thể hạch lympho (100X) 45 Hình 4.8 Đáp ứng miễn dịch lợn đƣợc tiêm vacxin thử nghiệm vacxin thƣơng mại 46 vii download by : skknchat@gmail.com TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Lƣơng Thị Hồng Nhâm Tên Luận văn: “Xác định tiêu an toàn hàm lƣợng kháng thể lợn đƣợc tiêm vacxin vô hoạt Porcine Circovirus type sản xuất thử nghiệm từ chủng phân lập Việt Nam” Ngành: Thú y Mã số: : 60 64 01 01 Tên sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu - Xác định tiêu an toàn vacxin vô hoạt PCV2 tiêm thử nghiệm lợn - Đánh giá khả đáp ứng miễn dịch lợn đƣợc tiêm thử nghiệm vacxin vô hoạt PCV2 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu kiểm tra độ tinh khiết vô trùng vacxin PCV2 - Đánh giá tiêu an tồn vacxin vơ hoạt PCV2 tiêm thử nghiệm lợn - Nghiên cứu đánh giá hàm lƣợng kháng thể lợn đƣợc tiêm vacxin vô hoạt PCV2 sản xuất thử nghiệm so sánh với vacxin thƣơng mại khác Đối tƣợng nghiên cứu - Chủng virus PCV2 đƣợc lựa chọn - Vacxin vô hoạt PCV2 đƣợc sản xuất từ chủng PCV2 phân lập Việt Nam Phƣơng pháp nghiên cứu Dựa phƣơng pháp: tinh khiết virus, cô đặc virus, vô hoạt virus, kiểm tra độ vô trùng vacxin PCV2, gây miễn dịch cho động vật, thu thập mẫu, mổ khám, phát kháng thể kháng PCV2, làm tiêu vi thể, kiểm tra độ an toàn đáp ứng miễn dịch vacxin phƣơng pháp xử lý số liệu tổng hợp đƣợc kết dƣới Kết quả:  Kết chế tạo vacxin vô hoạt PCV2 thử nghiệm - 03 chủng PCV2 dùng sản xuất vacxin đạt tiêu chuẩn khiết - Trong trình tinh khiết, đặc PCV2 dùng cho sản xuất vacxin thử nghiệm cần cô đặc PCV2 huyễn dịch tế bào sau gây nhiễm 35.000 vịng/phút để đạt kết tốt - Dùng Binary ethyleneimine để bất hoạt virus 10h, kiểm tra download by : skknchat@gmail.com phản ứng RT-PCR phát virus bị bất hoạt hồn tồn - Kiểm tra vơ trùng vacxin vô hoạt PCV2 theo TCVN 8684-2011 cho thấy vacxin hồn tồn đạt tiêu chuẩn vơ trùng  Kết đánh giá vacxin vô hoạt PCV2 thử nghiệm - Vacxin vơ hoạt PCV2 thử nghiệm an tồn:  Lợn đƣợc tiêm vacxin khơng có sai khác khối lƣợng so với lợn đối chứng từ thời điểm đƣợc tiêm vacxin đến thời điểm D28 Từ D42 đến D84 sai khác bắt đầu rõ rệt nhƣng khơng có ý nghĩa thống kê  Lợn đƣợc tiêm vacxin triệu chứng đặc trƣng bệnh PCV2 gây ra, thân nhiệt lợn ổn định dao động từ 39,3 ± 0,3 oC, nhiệt độ thân nhiệt lợn khỏe mạnh bình thƣờng  Khi mổ khám khơng phát bệnh tích đại thể đặc trƣng bệnh PCV2 gây Quan sát tiêu vi thể hạch lympho không thấy tƣợng thối hóa khơng phát thấy tế bào khổng lồ - Đánh giá đáp ứng miễn dịch dịch thể: vacxin thử nghiệm kích thích lợn sản sinh đáp ứng miễn dịch với độ dài tƣơng tự nhƣ vacxin thƣơng mại khác, nhƣng có mức kích thích sản sinh đáp ứng miễn dịch thấp Kết luận:  Về chế vacxin vô hoạt PCV2 thử nghiệm - 03 chủng virus dùng sản xuất vacxin vô hoạt PCV2 thử nghiệm đạt khiết - Thành công việc tinh khiết cô đặc virus để chế vacxin dùng BEI 0,2 % để bất hoàn hoàn toàn virus - Vacxin thử nghiệm CircoVNUA đạt khiết, vô trùng theo TCVN 8684-2011  Về đánh giá vacxin vô hoạt PCV2 thử nghiệm - Vacxin thử nghiệm Circo VNUA an tồn:  Lợn đƣợc tiêm vacxin vơ hoạt PCV2 thử nghiệm có tăng trọng khơng có sai khác so với lợn đƣợc tiêm vacxin thƣơng mại lợn đối chứng  Lợn đƣợc tiêm khơng có dấu hiệu, triệu chứng, bệnh tích đại thể vi thể đặc trƣng bệnh PCV2 gây - Vacxin thử nghiệm CircoVNUA kích thích lợn sản sinh đáp ứng miễn dịch với độ dài tƣơng tự nhƣ vacxin thƣơng mại CircoFLEX, nhƣng có mức kích thích sản sinh đáp ứng miễn dịch thấp download by : skknchat@gmail.com xám (R2.1) chúng tơi có nhận xét tƣơng tự (3) Về mặt cắt phổi: dùng dao cắt ngang phổi quan sát đƣợc màu mặt cắt đồng nhất, có màu hồng nhạt (4) Về đƣờng dẫn khí: tồn niêm mạc quản, khí quản, nhánh phế quản lớn có màu trắng, khơng quan sát đƣợc dịch rỉ viêm Dùng tay ép nhẹ vào tổ chức phổi, thấy bọt khí nhánh phế quản Nhƣ vậy, mặt đại thể, toàn phổi lợn đƣợc tiêm vacxin PCV2 thử nghiệm (CircoVNUA), vacxin thƣơng mại (CircoFLEX) lợn đối chứng bình thƣờng, khơng phát thấy tƣợng viêm hạch lympho tƣợng viêm phổi Tổng hợp biến đổi bệnh lý đại thể lợn tiêm vacxin PCV2 thử nghiệm đƣợc trình bày bảng 4.9 Bảng 4.9 Tổng hợp biến đổi bệnh lý đại thể lợn tiêm vacxin PCV2 TT Cơ quan Có biến đổi Hạch bẹn nông Hạch dƣới hàm - 10 Hạch amidal Hạch cuống phổi Hạch màng treo ruột Hạch gan- dày Thanh quản Khí quản Phế quản lớn Phổi - 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Tim Gan Lách Thận Dạ dày Ruột non Manh tràng Kết tràng Trực tràng Bàng quang Não Cơ - 44 download by : skknchat@gmail.com Ở lợn mổ khám, chúng tơi tiếp tục nghiên cứu biến đổi bệnh tích vi thể hạch lympho Kết đƣợc trình bày hình 4.7 Hình 4.7 Biến đổi bệnh lý vi thể hạch lympho (100X) Quan sát tiêu bệnh lý vi thể hạch lympho, không quan sát đƣợc tƣợng thối hóa hạch lympho Đặc biệt, tồn tiêu quan sát, chúng tơi không phát thấy tế bào khổng lồ (biến đổi bệnh lý vi thể đặc trƣng hạch PCV2 gây ra) Nhƣ vậy, kết nghiên cứu bệnh lý đại thể vi thể cho thấy vacxin thử nghiệm CircoVNUA an tồn, khơng gây biến đổi bệnh lý đại thể vi thể đặc trƣng bệnh PCV2 gây 4.2.2 Kết nghiên cứu so sánh hàm lƣợng kháng thể lợn đƣợc tiêm vacxin vô hoạt PCV2 thử nghiệm vacxin thƣơng mại Kết hàm lƣợng kháng thể lợn đƣợc tiêm vacxin PCV2 đƣợc xác định phản ứng ELISA Hình 4.8 trình bày kết so sánh đáp ứng miễn dịch lợn tiêm vacxin thử nghiệm (CircoVNUA) vacxin thƣơng mại (CircoFLEX) 45 download by : skknchat@gmail.com Hình 4.8 Đáp ứng miễn dịch lợn đƣợc tiêm vacxin thử nghiệm vacxin thƣơng mại Kết trình bày hình 4.8(A) cho thấy, lợn đƣợc tiêm vacxin thử nghiệm vacxin thƣơng mại sản sinh đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu Hiện tƣợng chuyển dƣơng tính huyết học sau mũi tiêm thứ xảy vòng D14- D28 Ở hai loại vacxin, dƣơng tính huyết học kéo dài đến ngày D70 sau tiêm vacxin So sánh mức độ khác biệt đáp ứng miễn dịch (hình 4.8 B), chúng tơi thấy vacxin CircoFLEX có mức chuyển dƣơng tính huyết học thời điểm sau vacxin (t2) so với thời điểm bắt đầu vacxin (t1) lớn so với lợn đƣợc tiêm vacxin thử nghiệm Nhƣ vậy, đáp ứng miễn dịch dịch thể, thấy vacxin thử nghiệm CircoVNUA kích thích lợn sản sinh đáp ứng miễn dịch với độ dài tƣơng tự nhƣ vacxin thƣơng mại CircoFLEX, nhƣng có mức kích thích sản sinh đáp ứng miễn dịch thấp 46 download by : skknchat@gmail.com PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN  Về chế vacxin vô hoạt PCV2 thử nghiệm - 03 chủng virus dùng sản xuất vacxin vô hoạt PCV2 thử nghiệm đạt khiết - Thành công việc tinh khiết cô đặc virus để chế vacxin dùng BEI 0,2 % để bất hoàn hoàn toàn virus - Vacxin thử nghiệm CircoVNUA đạt khiết, vô trùng theo TCVN 8684-2011  Về đánh giá vacxin vô hoạt PCV2 thử nghiệm - Vacxin thử nghiệm Circo VNUA an toàn:  Lợn đƣợc tiêm vacxin vô hoạt PCV2 thử nghiệm có tăng trọng khơng có sai khác so với lợn đƣợc tiêm vacxin thƣơng mại lợn đối chứng  Lợn đƣợc tiêm khơng có dấu hiệu, triệu chứng, bệnh tích đại thể vi thể đặc trƣng bệnh PCV2 gây - Vacxin thử nghiệm CircoVNUA kích thích lợn sản sinh đáp ứng miễn dịch với độ dài tƣơng tự nhƣ vacxin thƣơng mại CircoFLEX, nhƣng có mức kích thích sản sinh đáp ứng miễn dịch thấp 5.2 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục đề tài nghiên cứu để xác định thêm số tiêu hiệu lực vacxin thử nghiệm - Đề xuất đề tài nghiên cứu sản xuất vacxin PCV2 thƣơng mại từ chủng lƣu hành Việt Nam 47 download by : skknchat@gmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Mai Thị Ngân and Nguyễn Văn Giáp, 2012a: Xác định tỷ lệ lƣu hành kháng thể huyết kháng Porcine circovirus type (PCV2) đàn lợn nuôi số tỉnh miền Bắc Khoa học Kỹ thuật Thú y, Huỳnh Thị Mỹ Lệ and Nguyễn Văn Giáp, 2013: Phân lập xác định đặc tính sinh học Porcine circovirus type (PCV2) đàn lợn nuôi số tỉnh miền Bắc Việt Nam Tạp chí Khoa học Phát triển, 11, 304-309 Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Nguyễn Văn Giáp, Đặng Hữu Anh and Nguyễn Bá Tiếp, 2012b: Biểu lâm sàng bệnh tích hội chứng gày còm sau cai sữa liên quan đến Porcine circovirus type đàn lợn nuôi số tỉnh miền Bắc Việt Nam Tạp chí Khoa học Phát triển, 7, 968-977 Nguyễn Thị Thu Hồng, Lê Thị Thu Phƣơng, Đặng Hùng, Nguyễn Tiến Hà, Nguyễn Ngọc Hải, Chris J Morrissy and Darren Schfer, 2008: Phân tích di truyền circo virus lợn typ (PCV2) lợn khu vực Nam Bộ Khoa học Kỹ thuật Thú y, XV, - 12 Nguyễn Thị Thu Hồng, Phan Hoàng Dũng, Đặng Hùng, Nguyễn Tiến Hà and Chris Morrissy, 2006: Bƣớc đầu khảo sát tình hình nhiễm PCV2 đàn heo ni số tỉnh thành phía Nam Khoa học Kỹ thuật Thú y, XIII, 67 - 69 Trần Thị Dân, Nguyễn Tất Toàn, Nguyễn Thị Thu Năm, Võ Thị Trà An, Hồ Thị Nga, Nguyễn Thị Phƣớc Ninh, Lê Hữu Ngọc, Vũ Đình Hịa, Bùi Văn Đơng and Nguyễn Hữu Tín, 2010: Biến đổi tiêu huyết học bệnh tích heo ni thịt đƣợc tiêm chủng vacxin thể ORF2 phòng ngừa hội chứng gầy còm viêm da-thận circovirus typ Khoa học Kỹ thuật Thú y, 17 Tiếng Anh: Nawagitgul, P., I Morozov, S R Bolin, P A Harms, S D Sorden and P S Paul, 2000: Open reading frame of porcine circovirus type encodes a major capsid protein J Gen Virol, 81, 2281-2287 Cook, A J., 2001: A case study: control study of post-weaning multi-systemic wasting syndrome (PMWS) and porcine dermatitis nepropathy syndrome (PDNS) The Pig Journal, 48, 53 - 60 48 download by : skknchat@gmail.com Chae, C., 2012a: Commercial porcine circovirus type vaccines: efficacy and clinical application Vet J, 194, 151-157 10 Chae, J S and K S Choi, 2010: Genetic diversity of porcine circovirus type from pigs in Republic of Korea Res Vet Sci, 88, 333-338 11 Chiarelli-Neto, O., K Yotoko, P Vidigal, F Silva, L Castro, J Fietto, A Silva and M Almeida, 2009: Classification and putative origins of Brazilian porcine circovirus inferred through phylogenetic and phylogeographical approaches Virus Research, 140, 57-63 12 Cortey, M., E Pileri, M Sibila, J Pujols, M Balasch, J Plana and J Segales, 2011: Genotypic shift of porcine circovirus type from PCV-2a to PCV-2b in Spain from 1985 to 2008 Vet J, 187, 363-368 13 Dewey, C E., W T Johnston, L Gould and T L Whiting, 2006: Postweaning mortality in Manitoba swine Can J Vet Res, 70, 161-167 14 Dupont, K., E O Nielsen, P Baekbo and L E Larsen, 2008: Genomic analysis of PCV2 isolates from Danish archives and a current PMWS case-control study supports a shift in genotypes with time Vet Microbiol, 128, 56-64 15 Fenaux, M., P G Halbur, G Haqshenas, R Royer, P Thomas, P Nawagitgul, M Gill, T E Toth and X J Meng, 2002: Cloned genomic DNA of type porcine circovirus is infectious when injected directly into the liver and lymph nodes of pigs: characterization of clinical disease, virus distribution, and pathologic lesions Journal of Virology, 76, 541-551 16 Ferreira, D., B Sansot and A Laval, 2001: Attempt to use serotherapy to control mortality in PMWS Proc ssDNA viruses of plants, birds, pigs, primates S, 144 17 Gagnon, C A., N Music, G Fontaine, D Tremblay and J Harel, 2010: Emergence of a new type of porcine circovirus in swine (PCV): a type and type PCV recombinant Vet Microbiol, 144, 18-23 18 Gagnon, C A., D Tremblay, P Tijssen, M H Venne, A Houde and S M Elahi, 2007: The emergence of porcine circovirus 2b genotype (PCV-2b) in swine in Canada Can Vet J, 48, 811-819 19 Gillespie, J., T Opriessnig, X J Meng, K Pelzer and V Buechner-Maxwell, 2009: Porcine circovirus type and porcine circovirus-associated disease J Vet Intern Med, 23, 1151-1163 49 download by : skknchat@gmail.com 20 Guo, L J., Y H Lu, Y W Wei, L P Huang and C M Liu, 2010: Porcine circovirus type (PCV2): genetic variation and newly emerging genotypes in China Virol J, 7, 273 21 Hamel, A L., L L Lin and G P Nayar, 1998: Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs J Virol, 72, 5262-5267 22 Huynh, T M., B H Nguyen, V G Nguyen, H A Dang, T N Mai, T H Tran, M H Ngo, V T Le, T N Vu, T K Ta, V H Vo, H K Kim and B K Park, 2014: Phylogenetic and phylogeographic analyses of porcine circovirus type among pig farms in Vietnam Transbound Emerg Dis, 61, e25-34 23 Jaganathan, S., O Toung, P Yee, T Yew, C Yoon and L Keong, 2011: Genetic characterization of Porcine circovirus found in Malaysia Virology Journal, 8, 437 24 Jantafong, T., A Boonsoongnern, P Poolperm, K Urairong, C Lekcharoensuk and P Lekcharoensuk, 2011: Genetic characterization of porcine circovirus type in piglets from PMWS-affected and -negative farms in Thailand Virol J, 8, 88 25 Kim, H B., K S Lyoo and H S Joo, 2009: Efficacy of different disinfectants in vitro against porcine circovirus type Vet Rec, 164, 599-600 26 Kurtz, S., L Grau-Roma, M Cortey, M Fort, F Rodriguez, M Sibila and J Segales, 2014: Pigs naturally exposed to porcine circovirus type (PCV2) generate antibody responses capable to neutralise PCV2 isolates of different genotypes and geographic origins Vet Res, 45, 29 27 Lam, T H and C M Duong, 2006: Detection of porcine circovirus from lesions of postweaning-pig with wasting disease at some farms in Ho Chi Minh city and some adjacent provinces Proceedings of international workshop on Biotechnology in agriculture, pp 65 - 67 Ho Chi Minh city, Vietnam 28 Liu, J., I Chen, Q Du, H Chua and J Kwang, 2006b: The ORF3 protein of porcine circovirus type is involved in viral pathogenesis in vivo Journal of Virology, 80, 5065-5073 29 Lopez-Soria, S., J Segales, N Rose, M J Vinas, P Blanchard, F Madec, A Jestin, J Casal and M Domingo, 2005: An exploratory study on risk factors for postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in Spain Prev Vet Med, 69, 97-107 30 Lyoo, K., H Joo, B Caldwell, H Kim, P R Davies and J Torrison, 2011: Comparative efficacy of three commercial PCV2 vaccines in conventionally reared pigs Vet J, 189, 58-62 50 download by : skknchat@gmail.com 31 Martin, H., M F Le Potier and P Maris, 2008: Virucidal efficacy of nine commercial disinfectants against porcine circovirus type Vet J, 177, 388-393 32 McKeown, N E., T Opriessnig, P Thomas, D K Guenette, F Elvinger, M Fenaux, P G Halbur and X J Meng, 2005: Effects of porcine circovirus type (PCV2) maternal antibodies on experimental infection of piglets with PCV2 Clin Diagn Lab Immunol, 12, 1347-1351 33 Muhling, J., W S Raye, J R Buddle and G E Wilcox, 2006: Genetic characterisation of Australian strains of porcine circovirus types and Aust Vet J, 84, 421-425; discussion 416 34 Neumann, E J., S S Dobbinson, E B Welch and R S Morris, 2007: Descriptive summary of an outbreak of porcine post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS ) in New Zealand N Z Vet J, 55, 346-352 35 O'Dea, M A., M J Kabay, J Carr, G E Wilcox and R B Richards, 2011: Porcine circovirus-associated disease in weaner pigs in Western Australia Aust Vet J, 89, 122-130 36 O'Neill, K., M Hemann, L Gimenez-Lirola, P Halbur and T Opriessnig, 2012: Vaccination of sows reduces the prevalence of PCV-2 viraemia in their piglets under field conditions The Veterinary record, 171, 425-425 37 Olvera, A., M Cortey and J Segales, 2007: Molecular evolution of porcine circovirus type genomes: phylogeny and clonality Virology, 357, 175-185 38 Opriessnig, T., X J Meng and P G Halbur, 2007: Porcine circovirus type associated disease: update on current terminology, clinical manifestations, pathogenesis, diagnosis, and intervention strategies J Vet Diagn Invest, 19, 591-615 39 Opriessnig, T., A R Patterson, D M Madson, N Pal and P G Halbur, 2009a: Comparison of efficacy of commercial one dose and two dose PCV2 vaccines using a mixed PRRSV-PCV2-SIV clinical infection model 2-3-months post vaccination Vaccine, 27, 1002-1007 40 Plana-Duran, J., M Balasch, J Segales, C Rosell, G M Rodriguez-Arrioja, M Domingo, J M Folch, A Sanchez and A Mankertz, 1999: Post-weaning multisystemic wasting syndrome in Spain Vet Rec, 145, 87-88 41 Ramos, N., S Mirazo, G Castro and J Arbiza, 2015: First identification of Porcine Circovirus Type 2b mutant in pigs from Uruguay Infect Genet Evol, 33, 320-323 51 download by : skknchat@gmail.com 42 Rodriguez-Arrioja, G M., J Segales, C Rosell, A Rovira, J Pujols, J Plana-Duran and M Domingo, 2003: Retrospective study on porcine circovirus type infection in pigs from 1985 to 1997 in Spain J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health, 50, 99-101 43 Rose, N., T Opriessnig, B Grasland and A Jestin, 2012: Epidemiology and transmission of porcine circovirus type (PCV2) Virus Res, 164, 78-89 44 Royer, R L., P Nawagitgul, P G Halbur and P S Paul, 2001: Susceptibility of porcine circovirus type to commercial and laboratory disinfectants Journal of swine health and production, 9, 281-284 45 Segales, J., A Olvera, L Grau-Roma, C Charreyre, H Nauwynck, L Larsen, K Dupont, K McCullough, J Ellis, S Krakowka, A Mankertz, M Fredholm, C Fossum, S Timmusk, N Stockhofe-Zurwieden, V Beattie, D Armstrong, B Grassland, P Baekbo and G Allan, 2008: PCV-2 genotype definition and nomenclature Vet Rec, 162, 867-868 46 Segales, J., A Urniza, A Alegre, T Bru, E Crisci, M Nofrarias, S Lopez-Soria, M Balasch, M Sibila, Z Xu, H J Chu, L Fraile and J Plana-Duran, 2009: A genetically engineered chimeric vaccine against porcine circovirus type (PCV2) improves clinical, pathological and virological outcomes in postweaning multisystemic wasting syndrome affected farms Vaccine, 27, 7313-7321 47 Seo, H W., C Park, K Han and C Chae, 2014: Effect of porcine circovirus type (PCV2) vaccination on PCV2-viremic piglets after experimental PCV2 challenge Vet Res, 45, 13 48 Takahagi, Y., Y Nishiyama, S Toki, T Yonekita, F Morimatsu and H Murakami, 2008: Genotypic change of Porcine circovirus Type on Japanese pig farms as revealed by restriction fragment length polymorphism analysis Journal of Veterinary Medical Science, 70, 603-606 49 Tischer, I., D Peters, R Rasch and S Pociuli, 1987: Replication of porcine circovirus: induction by glucosamine and cell cycle dependence Arch Virol, 96, 39-57 50 Vidigal, P M., C L Mafra, F M Silva, J L Fietto, A Silva Junior and M R Almeida, 2012: Tripping over emerging pathogens around the world: a phylogeographical approach for determining the epidemiology of Porcine circovirus-2 (PCV-2), considering global trading Virus Res, 163, 320-327 51 Wang, F., X Guo, X Ge, Z Wang, Y Chen, Z Cha and H Yang, 2009: Genetic variation analysis of Chinese strains of porcine circovirus type Virus Res, 145, 151-156 52 download by : skknchat@gmail.com 52 Woodbine, K A., G F Medley, J Slevin, A L Kilbride, E J Novell, M J Turner, M J Keeling and L E Green, 2007: Spatiotemporal patterns and risks of herd breakdowns in pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome Vet Rec, 160, 751-762 53 Xiao, C T., P G Halbur and T Opriessnig, 2015: Global molecular genetic analysis of porcine circovirus type (PCV2) sequences confirms the presence of four main PCV2 genotypes and reveals a rapid increase of PCV2d J Gen Virol, 96, 1830-1841 54 Yang, K., W Li, H Niu, W Yan, X Liu, Y Wang, S Cheng, X Ku and Q He, 2012: Efficacy of single dose of an inactivated porcine circovirus type (PCV2) wholevirus vaccine with oil adjuvant in piglets Acta Vet Scand, 54, 67 55 Yilmaz, A and E Kaleta, 2004: Disinfectant tests at 20 and 10 degrees C to determine the virucidal activity against circoviruses Deutsche tierarztliche Wochenschrift, 111, 248-251 56 Sno M., E Cox, H Holtslag, T Nell, S Pel, R Segers, V Fachinger and M Witvliet 2016 Efficacy and safety of a new intradermal PCV2 vaccine in pigs Trials in Vaccinology Volume 5, 2016, Pages 24–31 57 Feng H., J Segalés, L Fraile, S López-Soria and M Sibila 2016 Effect of high and low levels of maternally derived antibodies on porcine circovirus type (PCV2) infection dynamics and production parameters in PCV2 vaccinated pigs under field conditions Vaccine 2016 Jun 8;34(27):3044-50 58 Park C., J Jeong, K Choi and C Chae 2016 Efficacy of a new bivalent vaccine of porcine circovirus type and Mycoplasma hyopneumoniae (Fostera™ PCV MH) under experimental conditions Vaccine 2016 Jan 4;34(2):270-5 59 Jeong J., H.S Kang, C Park, H.W Seo, I Kang, K Choi and C Chae 2016 Comparative efficiacy of concurrent administration of a porcine circovirus type (PCV2) vaccine plus a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) vaccine from two commercial sources in pigs challenged with both virruses J Swine Health Prod 24 (3): 130-141 60 Martelli P., R Saleri, G Ferrarini, E De Angelis, V Cavalli, M, Benetti, L Ferrari, P Bonilauri, E Arioli, A Caleffi, H Nathues and P Borghetti 2016 Impact of maternally derived immunity on piglets’ immune response and protection against porcine circovirus type (PCV2) after vaccination against PCV2 at different age BMC Veterinary ResearchBMC series – open, inclusive and trusted201612:77 53 download by : skknchat@gmail.com PHỤ LỤC TCVN 8684:2011 VẮC XIN VÀ CHẾ PHẨM SINH HỌC DÙNG TRONG THÚ Y – PHÉP THỬ ĐỘ THUẦN KHIẾT Veterinary vaccines and biological products – Purity test Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phƣơng pháp thử độ khiết vắc xin chế phẩm sinh học dùng thú y Thuốc thử môi trƣờng nuôi cấy 2.1 Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích sử dụng nƣớc cất nƣớc có độ tinh khiết tƣơng đƣơng, trừ có quy định khác 2.1.1 Metylbenzothiazolon hydrazon hydroclorua 2.1.2 Dung dịch sắt(II) clorua axit sulfamic 2.1.3 Formaldehyt chuẩn 2.2 Môi trƣờng nuôi cấy Sử dụng môi trƣờng nuôi cấy pha chế sẵn chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy trƣớc sử dụng 2.2.1 Môi trƣờng thioglycollat 2.2.2 Môi trƣờng trypticaza đậu tƣơng 2.2.3 Thạch máu 2.2.4 Canh thang thịt 2.2.5 Thạch Sabouraud 2.2.6 Sản phẩm thủy phân casein đậu tƣơng 2.2.7 Canh thang PPLO, có bổ sung huyết ngựa chất chiết nấm men 2.2.8 Thạch PPLO (tên đầy đủ pleuropneumonia-like organism agar, có bổ sung huyết ngựa chất chiết nấm men 2.2.9 Dung dịch DPN-cystein, có bổ sung nicotinamid adenin dinucleotid, Lcystein hydroclorua huyết ngựa 2.2.10 Canh thang tim, có bổ sung proteoza pepton chất chiết nấm men 2.2.11 Thạch MacConkey 2.2.12 Thạch Salmonella-Shigella 54 download by : skknchat@gmail.com 2.2.13 Thạch brilliant green 2.2.14 Thạch desoxycholat xitrat 2.2.15 Thạch xyloza lysin deoxycholat (thạch XLD) 2.2.16 Canh thang selenit 2.2.17 Canh thang tetrathionat Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phịng thử nghiệm sinh học thơng thƣờng cụ thể nhƣ sau: 3.1 Tủ ấm, trì nhiệt độ 37 0C 3.2 Tủ ấm CO2 3.3 Tủ sấy 3.5 Máy lắc 3.7 Máy đo quang phổ, sử dụng cuvet cm, đo đƣợc bƣớc sóng 628 nm Cách tiến hành 4.1 Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn 4.1.1 Tiến hành 4.1.1.1 Cấy vắc xin ống môi trƣờng kiểm tra sau đây: môi trƣờng thioglycollat (2.2.1), môi trƣờng trypticaza đậu tƣơng (2.2.2), đĩa môi trƣờng thạch máu (2.2.3), lƣợng vắc xin cấy từ % đến % (phần thể tích) so với mơi trƣờng kiểm tra Nếu vắc xin dạng đơng khơ phải đƣợc hồ tan trở lại dung tích ban đầu Ủ mơi trƣờng cấy vắc xin tủ 37 oC, theo dõi từ ngày đến 10 ngày 4.1.1.2 Nếu vắc xin có chất diệt trùng giữ mẫu nhiệt độ từ 25 0C đến 30 0C thời gian từ 24 h đến 48 h trƣớc tiến hành kiểm tra Kiểm tra vắc xin có chất diệt trùng nhƣ sau: – Cấy mẫu vào ống 10 ml canh thang thịt (2.2.4), theo dõi 37 0C ngày – Cấy chuyển từ ống canh thang thịt sang ống canh thang thịt chuẩn bị, theo dõi 37 0C thời gian từ ngày đến 10 ngày 4.1.2 Đọc kết Mẫu vắc xin đƣợc xem đạt tiêu chuẩn khơng có vi sinh vật mọc môi trƣờng kiểm tra thời gian theo dõi 4.2 Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc 4.2.1 Tiến hành 55 download by : skknchat@gmail.com Mẫu vắc xin đƣợc ria cấy môi trƣờng thạch Sabouraud (2.2.5) sản phẩm thủy phân casein đậu tƣơng (2.2.6) Theo dõi 14 ngày nhiệt độ phòng (từ 20 C đến 25 0C) 4.2.2 Đọc kết Mẫu vắc xin đƣợc xem đạt tiêu chuẩn khơng có tạp khuẩn nấm mốc mọc môi trƣờng kiểm tra thời gian theo dõi 4.3 Kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma 4.3.1 Tiến hành Mẫu vắc xin đƣợc cấy kiểm tra môi trƣờng canh thang PPLO (2.2.7) với nồng độ từ % đến % vắc xin 100 ml môi trƣờng đĩa thạch PPLO (2.2.8) có bổ sung huyết ngựa chất chiết nấm men với thể tích 0,1 ml vắc xin đĩa Có thể sử dụng dung dịch DPN-cystein (2.2.9), đƣợc bổ sung nicotinamid adenin dinucleotid, L-cystein hydroclorua huyết ngựa sử dụng môi trƣờng canh thang tim (2.2.10) đƣợc bổ sung proteoza pepton chất chiết nấm men để làm môi trƣờng kiểm tra Theo dõi môi trƣờng lỏng 14 ngày nhiệt độ từ 330C đến 370C Tại thời điểm ngày, ngày, 10 ngày 14 ngày, lấy canh khuẩn môi trƣờng lỏng ria cấy vào môi trƣờng thạch PPLO (2 đĩa) Ủ tủ ấm CO2 (3.2) 370C có % khí CO2, theo dõi 28 ngày 4.3.2 Đọc kết Mẫu vắc xin đƣợc xem đạt khơng có khuẩn lạc Mycoplasma mọc môi trƣờng kiểm tra 4.4 Kiểm tra tạp nhiễm Salmonella 4.4.1 Tiến hành nuôi cấy Mẫu vắc xin đƣợc cấy môi trƣờng kiểm tra, dùng loại môi trƣờng sau: thạch MacConkey (2.2.11), thạch Salmonella-Shigella (2.2.12), thạch Brilliant Green (2.2.13), thạch desoxycholat xitrat (2.2.14) thạch XLD (2.2.15), với nồng độ từ % đến % dung tích mơi trƣờng kiểm tra Ủ môi trƣờng cấy vắc xin tủ 37 oC, theo dõi từ 18 h đến 24 h sau cấy chuyển tiếp sang ống mơi trƣờng nƣớc, dùng loại môi trƣờng sau: canh thang selenit (2.2.16) canh thang tetrathionat (2.2.17) Ủ tủ 37 oC, theo dõi từ 48 h đến 72 h 4.4.2 Đọc kết Mẫu vắc xin đƣợc xem đạt khơng có vi khuẩn Salmonella mọc loại môi trƣờng kiểm tra 56 download by : skknchat@gmail.com MỘT SỐ THƠNG TIN VÀ HÌNH ẢNH MINH HỌA Loại mẫu bệnh phẩm cách bảo quản TT Tên Bảo quản -70oC Ngâm formol 10% Hạch amidal   Hạch dƣới hàm   Hạch bẹn nông   Hạch cuống phổi   Hạch màng treo ruột   Phổi   Tim   Gan   Lách   10 Thận   11 Dạ dày   12 Bàng quang   13 Ruột non   14 Manh tràng   15 Kết tràng   57 download by : skknchat@gmail.com Thực phản ứng IFA Hình ảnh đĩa phản ứng ELISA Thực phản ứng Realtime-PCR Siêu ly tâm cô đặc virus Hệ thống máy đọc kết ELISA Lợn gây miễn dịch vacxin thử nghiệm CircoVNUA 58 download by : skknchat@gmail.com ... tinh khiết vô trùng vacxin PCV2 - Đánh giá tiêu an toàn vacxin vô hoạt PCV2 tiêm thử nghiệm lợn - Nghiên cứu đánh giá hàm lƣợng kháng thể lợn đƣợc tiêm vacxin vô hoạt PCV2 sản xuất thử nghiệm so... lợn tiêm vacxin vô hoạt porcine circovirus type sản xuất thử nghiệm từ chủng phân lập Việt Nam? ?? download by : skknchat@gmail.com MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Xác định tiêu an tồn vacxin vơ hoạt PCV2 tiêm. .. 10 13 19 24 36 R2 .2 4,5 14 13 21 25 45 R2.3 11 13 27 37 46 R2.4 10 13 27 27 49 R2.5 10 15 25 29 55 R2.6 5,5 12 19 19 28 53 R2.7 5,5 6,5 22 23 35 47 R2.8 8 16 20 29 40 R2.9 17 27 36 36 R2.10 4,5