(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu tạo kháng thể đơn dòng kháng progesterone ở bò

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM DƯƠNG VĂN CƯỜNG NGHİÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG PROGESTERONE Ở BÒ Ngành: Chăn nuôi Mã số: 8620105 Người hướng dẫn khoa học: TS Cù Thị Thiên Thu PGS.TS Nguyễn Bá Mùi NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 download by : skknchat@gmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2019 Tác giả luận văn Dương Văn Cường i download by : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, tơi nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Cù Thị Thiên Thu PGS-TS Nguyễn Bá Mùi tận tình hướng dẫn, dành nhiều cơng sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Sinh lý - Tập tính động vật, Khoa Chăn Ni - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tạo điều kiện, giúp đỡ trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán viên chức Khoa Thú y, Bệnh viện Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn./ Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2019 Tác giả luận văn Dương Văn Cường ii download by : skknchat@gmail.com MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract x Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học thực tiễn Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài ngồi nước 2.1.1 Tình hình nghiên cứu giới 2.1.2 Tình hình nghiên cứu nước 2.2 Quá trình hình thành chức Hormone Progesterone 2.2.1 Tổng quan Hormone 2.2.2 Sự điều hoà hoạt động sinh dục tuyến nội tiết 2.3 Một số hiểu biết miễn dịch học 13 2.3.1 Miễn dịch đáp ứng miễn dịch 13 2.3.2 Các quan tế bào tham gia vào đáp ứng miễn dịch 16 2.3.3 Kháng nguyên (Antigen) 17 2.3.4 Kháng thể 18 2.3.5 Sự kết hợp kháng nguyên kháng thể 20 2.3.6 Kháng thể đơn dòng ứng dụng 21 2.4 Kỹ thuật ELISA 30 Phần Vật liệu, nội dung phương pháp nghiên cứu 32 3.1 Vật liệu nghiên cứu 32 3.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 33 iii download by : skknchat@gmail.com 3.3 Nội dung nghiên cứu 33 3.3.1 Gây miễn dịch cho chuột chủng BALB/c kháng nguyên khác 33 3.3.2 Thu số lượng tế bào lympho B chuột gây miễn dịch 33 3.3.3 Đánh thức nuôi cấy tế bào Myeloma Sp2/0 dùng để dung hợp với tế bào Lympho B 33 3.3.4 Sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng phản ứng ELISA 33 3.3.5 Nuôi cấy tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu progesterone 33 3.3.6 Xác định nồng độ kháng thể đơn dòng tạo dịch báng chuột BALB/c 33 3.3.7 Kiểm tra khả bắt cặp đặc hiệu, bắt cặp chéo kháng thể đơn dòng với kháng nguyên 33 3.4 Phương pháp nghiên cứu 33 3.4.1 Phương pháp gây miễn dịch cho chuột chủng BALB/c kháng nguyên khác 33 3.4.2 Phương pháp thu số lượng tế bào lympho B chuột gây miễn dịch 35 3.4.3 Phương pháp đánh thức nuôi cấy tế bào Myeloma Sp2/0 dùng để dung hợp với tế bào Lympho B 36 3.4.4 Sàng lọc dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng phương pháp ELISA 37 3.4.5 Phương pháp nuôi cấy tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu progesterone 38 3.4.6 Phương pháp xác định nồng độ kháng thể đơn dòng tạo dịch báng chuột BALB/c 38 3.4.7 Kiểm tra khả bắt cặp đặc hiệu, bắt cặp chéo kháng thể đơn dòng với kháng nguyên 41 Phần Kết thảo luận 42 4.1 Kết đáp ứng miễn dịch chuột với kháng nguyên 42 4.2 Kết thu số lượng tế bào Lympho B chuột gây miễn dịch 44 4.3 Kết dung hợp tế bào Myeloma SP2/0 với tế bào Lympho B 45 4.4 Kết sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng phản ứng ELISA 47 iv download by : skknchat@gmail.com 4.5 Kết nuôi cấy tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng 52 4.6 Xác định nồng độ kháng thể đơn dòng tạo dịch báng chuột BALB/c 53 4.6.1 Kết xác định hiệu giá kháng thể phương pháp ELISA 53 4.6.2 Kết tinh chế kháng thể từ dịch nước báng 54 4.6.3 Kết chạy điện di kháng thể IgG thu gel SDS-PAGE 55 4.7 Kết qủa kiểm tra khẳ bắt cặp đặc hiệu, bắt cặp chéo kháng thể đơn dòng với kháng nguyên 55 Phần Kết luận kiến nghị 58 5.1 Kết luận 58 5.3 Kiến nghị 58 Tài liệu tham khảo 59 v download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt BSA Bovine Serum Albumin Cs Cộng DMEM Dulbeco Modified Eagl Medium ĐƯMD Đáp ứng miễn dịch EIA Enzyme Immuno Assay ELISA Enzyme Linkied Imumuno Sorbent Assay FBS Fetal Bovine Serum FCA Freund complete Adjuvant FIA Freund’s Incomplete Adjuvant FSH Follicle Stimulating Hormone GnRH Gonadotropin Realising Hormone HAT HypoxanthineAminopterinThimidine HPRT Hypoxathin Phospho Ribosyl Transferase HT Hypoxanthine Thimidine KN Kháng nguyên KT Kháng thể KTĐD Kháng thể đơn dòng LH Luteinizing Hormone PBS FetalBovineSerum PEG Polyethylene glycol PGF2α Progesterone F2α RIA Radio Immuno Assay vi download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Giá trị OD450 mẫu huyết chuột nồng độ gây miễn dịch khác loại kháng nguyên 42 Bảng 4.2 Số lượng tế bào Lympho B chuột có khả đáp ứng miễn dịch tốt với kháng nguyên khác 45 Bảng 4.3 Kết lai tế bào Myeloma Sp2/0 tế bào lymphoB chuột BALB/c gây miễn dịch với kháng nguyên khác 46 Bảng 4.4 Kết sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesteron Antigen phản ứng ELISA 48 Bảng 4.5 Kết sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone-3-BSA Antigen phản ứng ELISA 49 Bảng 4.6 Kết sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone -3- CMO:BSA Antigen phản ứng ELISA 51 Bảng 4.7 Số lượng tế bào sau phục hồi 53 Bảng 4.8 Hàm lượng kháng thể đặc hiệu progesterone sau tinh chế 54 Bảng 4.9 Tính đặc hiệu kháng thể đơn dòng tạo với kháng nguyên tương ứng 56 Bảng 4.10 Khả bắt cặp chéo kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên khác phản ứng ELISA 57 vii download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cơ chế tác dụng hormone Hình 2.2 Điều hồ tiết hormone vị trí tác động chúng kỳ động dục bò Hình 2.3 Cơng thức cấu tạo progesterone Hình 2.4 Biến thiên nồng độ progesteron sau thụ tinh có kết thời điểm lấy mẫu chẩn đốn có thai 10 Hình 2.5 Cơng thức cấu tạo kháng thể (Đỗ Ngọc Liên, 1999) 20 Hình 2.6 Kháng thể đơn dịng liên kết với epitope đặc hiệu 22 Hình 2.7 Qui trình sản xuất kháng thể đơn dịng 28 Hình 2.8 Kỹ thuật ELISA 31 Hình 3.1 Gây miễn dịch cho chuột BALB/c 35 Hình 3.2 Thu hạch bẹn chuột 35 Hình 3.3 Thu lách chuột 35 Hình 3.4 Nghiền nhỏ hạch bẹn lách chuột 35 Hình 3.5 Chuột BALB/c trước tiêm 39 Hình 3.6 Tiêm tế bào lai vào xoang phúc mạc chuột 39 Hình 3.7 Thu dịch báng xoang phúc mạc chuột 39 Hình 3.8 Dịch báng thu sau ly tâm loại bỏ cặn 39 Hình 4.1 Tế bào lai sau 24h phục hồi 52 Hình 4.2 Tế bào lai sau 72h phục hồi 52 Hình 4.3 Kết ELISA dịch nước báng độ pha loãng khác 53 Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn phân đoạn thu tinh chế kháng thể đơn dòng từ dịch nước báng 54 Hình 4.5 Dịch thu phân đoạn 2-9 55 viii download by : skknchat@gmail.com TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Dương Văn Cường Tên luận văn: Nghiên cứu tạo kháng thể đơn dịng kháng progesterone bị Ngành : Chăn ni Mã số: 8620105 Cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu Tạo dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng kháng progesterone, làm sở cho việc ứng dụng sản xuất que thử thai nhanh bò Việt Nam Phương pháp nghiên cứu - Gây miễn dịch chuột BALB/c ba kháng nguyên chuẩn: Progesterone Antigen (Mã code MBS238011, hãng Mybiosource, Mỹ); Progesterone-3-BSA Antigen (Mã code LA330, hãng EastCoast Bio, Mỹ); Proesterone-3-CMO:BSA Antigen (Mã code ND-R0752, hãng Novateinbio, Mỹ) - Tế bào lympho B mẫn cảm với kháng nguyên thu từ lách hạch chuột BALB/c - Đánh thức nuôi cấy tế bào Myeloma dùng để dung hợp với tế bào Lympho B để tạo dòng tế bào lai hybrydoma có khả tiết kháng thể đơn dòng - Bằng phản ứng ELISA sàng lọc dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với Progesterone - Kiểm tra khả bắt cặp đặc hiệu khả bắt cặp chéo kháng thể đơn dòng với kháng nguyên phương pháp ELISA Kết kết luận - Chuột có khả đáp ứng miễn dịch tốt kháng nguyên progesterone nồng độ 200 µg/lần/con - Đã tạo dòng tế bào lai (đặt tên là: E4, E3, C6, H3, F10) có khả tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone Antigen - Đã tạo dòng tế bào lai (đặt tên là: C12, D7, F11) có khả tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone-3-BSA antigen - Đã tạo dòng tế bào lai (đặt tên là: G5, H3, A7) có khả tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone-3-CMO:BSA Antigen ix download by : skknchat@gmail.com Bảng 4.3 Kết lai tế bào Myeloma Sp2/0 tế bào lympho B chuột BALB/c gây miễn dịch với kháng nguyên khác Số lượng tế bào dùng để lai Lần lai (fusion) Tế bào Myeloma Sp2/0 1,5 x 107 Số đĩa nuôi Tổng số cấy tế giếng bào nuôi Tế bào dùng cấy tế Lympho B (đĩa 96 bào giếng) Progesterone Antigen 1,5 x 108 768 Tỷ lệ% số Tổng số giếng giếng có có tế bào tế lai/giếng bào lai ni cấy tế bào 723 94,14 768 654 85,16 768 743 96,74 2,1 x 108 768 629 81,90 2,7 x 107 2,7 x 108 768 701 91,28 1,3 x 107 Progesterone-3-BSA Antigen 1,3 x 108 768 602 78,39 1,4 x 107 1,4 x 108 768 721 93,88 1,6 x 107 1,6 x 108 768 589 76,69 1,7 x 10 1,7 x 10 768 378 49,22 2,2 x 107 2,2 x 108 768 478 62,24 1,6 x 10 1,6 x 10 1,8 x 107 1,8 x 108 2,1 x 107 Progesterone-3-CMO:BSA Antigen 1,4 x 107 1,4 x 108 768 664 86,46 1,5 x 10 1,5 x 10 768 704 91,67 1,6 x 107 1,6 x 108 768 689 89,71 1,9 x 107 1,9 x 108 768 576 75,00 2,2 x 107 2,2 x 108 768 593 77,21 Đối với kháng nguyên Progesterone Antigen tỷ lệ lai thành công cao đạt 96,74% (lần lai thứ có 743/768 giếng ni cấy tế bào có tế bào lai với tỷ lệ lai 1,8 x 108 tế bào Lympho B 1,8 x 107 tế bào Myeloma Sp2/0 ), tỷ lệ lai thấp đạt 81,90% (lần lai thứ có 629/768 giếng ni cấy tế bào có tế bào lai với tỷ lệ lai 2,1 x 108 tế bào Lympho B 2,1 x 107 tế bào Myeloma Sp2/0) Đối với kháng nguyên Progesterone-3-BSA Antigen tỷ lệ lai thành công cao đạt 93,88% (lần lai thứ có 721/768 giếng ni cấy tế bào có tế bào lai, với 46 download by : skknchat@gmail.com tỷ lệ lai 1,4 x 108 tế bào Lympho B 1,4 x 107 tế bào Myeloma Sp2/0), tỷ lệ lai thấp đạt 49,22% (lần lai thứ có 378/768 giếng ni cấy tế bào có tế bào lai, với tỷ lệ lai 1,7 x 108 tế bào Lympho B 1,7 x 107 tế bào Myeloma Sp2/0) Đối với kháng nguyên Progesterone-3-CMO:BSA Antigen tỷ lệ lai thành công cao đạt 91,67% (lần lai thứ có 704/768 giếng ni cấy tế bào có tế bào lai với tỷ lệ lai 1,5 x 108 tế bào Lympho B 1,5 x 107 tế bào Myeloma Sp2/0), tỷ lệ lai thấp đạt 75% (lần lai thứ có 576/768 giếng ni cấy tế bào có tế bào lai, với tỷ lệ lai 1,9 x 108 tế bào Lympho B 1,9 x 107 tế bào Myeloma Sp2/0) Kết lai tế bào lympho B tế bào Myeloma Sp2/0 chuột BALB/c gây miễn dịch với loại kháng nguyên progesterone cho thấy tỷ lệ % số giếng có tế bào lai số giếng nuôi cấy tế bào kháng nguyên Progesterone Antigen có kết cao so hai loại kháng nguyên Progesterone -3- BSA Antigen Progesterone -3- CMO:BSA Antigen Kết nghiên cứu thấp so với nghiên cứu Cù Thị Thiên Thu cs.(2017), White et al (1982) cao so với nghiên cứu Yücel and Çirakoğlu (1999) Theo Cù Thị Thiên Thu cs.(2017), tỷ lệ % số giếng có tế bào lai/giếng nuôi cấy tế bào đạt 90% Trong đó, nghiên cứu White et al (1982) lần lai khác tỷ lệ giếng có tế bào lai lần lai đạt 100%, có lần lai đạt 42% (21/50 giếng) Theo nghiên cứu cel and Çirakoğlu (1999), số giếng có tế bào lai lần lai thứ chiếm 58,92% (có 396/672 giếng, lần lai thứ chiếm 37,05% (có 249/762 giếng) 4.4 KẾT QUẢ SÀNG LỌC TẾ BÀO LAI TIẾT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG BẰNG PHẢN ỨNG ELISA Để sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dịng kháng progesterone, dịch ni cấy tế bào tất giếng có tế bào lai thu nhận đánh giá phản ứng ELISA Sau kiểm tra khả tạo kháng thể phương pháp ELISA, ta biết giếng có kháng thể, nhiên kháng thể đa dòng nhiều dòng tế bào lai tạo thành Để có kháng thể đơn dòng ta phải tiến hành sàng lọc tế bào dương tính, giếng có hiệu giá kháng thể cao cho giá trị cao Từ kết chúng tơi chọn số giếng có hiệu giá cao để đánh giá tiếp Sau sàng lọc lần đầu khoảng 24h, tiến hành sàng lọc kháng thể đơn dòng với BSA phương pháp ELISA Ở lần sàng lọc chọn 47 download by : skknchat@gmail.com giếng có tế bào lai có kết tốt lần Tuy nhiên bố trí thí nghiệm gắn song song kháng nguyên Progesterone kháng nguyên BSA Do hormone Progesterone phi protein nên để tăng khả đáp ứng miễn dịch Progesterone gắn với BSA, chuột đáp ứng miễn dịch với progesterone với BSA Vì vậy, để sàng lọc thu nhận dòng tế bào lai hydridoma tiết kháng thể cho loại kháng nguyên kháng nguyên khác gắn riêng rẽ cho tế bào lai tương ứng phản ứng ELISA Bên cạnh đó, phản ứng ELISA với kháng nguyên gắn BSA thực song song Kết sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng cho loại kháng nguyên khác thể Bảng 4.4, Bảng 4.5 Bảng 4.6 Bảng 4.4 Kết sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesteron Antigen phản ứng ELISA Kết phản ứng ELISA Lần lai Tổng số giếng kiểm tra Sử dụng kháng nguyên gắn Pro-Antigen Sử dụng kháng nguyên gắn BSA Số giếng dương tính Tỷ lệ (%) Số giếng dương tính Tỷ lệ (%) Số giếng cho kết dương tính với kháng nguyên Pro-Antigen âm tính với BSA Số giếng Tỷ lệ dương tính (%) 654 14 2,14 14 2,14 0 701 18 2,57 15 2,14 0,43 629 26 4,13 26 4,13 0 723 25 3,46 23 3,18 0,28 743 14 1,88 14 1,88 0 Kết thể Bảng 4.4 cho thấy: Ở lần lai thứ có 14/654 giếng (2,14%), lần lai thứ ba có 26/629 giếng (4,13%) lần lai thứ năm có 14/743 giếng(1,88%) cho kết ELISA dương tính sử dụng hai loại kháng nguyên gắn riêng rẽ Progesterone-Antigen BSA Đối với lần lai thứ hai có 18/701 giếng (2,57%) cho kết ELISA dương tính với kháng nguyên Progesterone Antigen, có 15/701 giếng 48 download by : skknchat@gmail.com (2,14%) cho kết ELISA dương tính với kháng nguyên gắn BSA Điều có nghĩa số 18 giếng cho kết ELISA dương tính với Progesterone Antigen có đến 15/18 giếng (83,33%) có kháng thể đơn dịng đặc hiệu cho kháng nguyên BSA có 3/18 giếng (16,67%) có kháng thể đơn dịng đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone Antigen mà không bắt cặp chéo với kháng nguyên BSA Đối với lần lai thứ tư có 25/723 giếng (3,46%) cho kết ELISA dương tính với kháng ngun Progesterone Antigen, có 23/723 giếng (3,18%) cho kết ELISA dương tính với kháng nguyên gắn BSA Điều có nghĩa số 25 giếng cho kết ELISA dương tính với Progesterone Antigen có đến 23/25 giếng (92%) có kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên BSA có 2/25 giếng (8%) có kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone Antigen mà không bắt cặp chéo với kháng nguyên BSA Như sau lần lai lai tạo thành cơng dịng tế bào lai (đặt tên là: E4, E3, C6, H3, F10) tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên progesterone Antigen Từ dòng tế bào này, tiến hành nhân giống với số lượng lớn để bảo quản tiến hành thí nghiệm Bảng 4.5 Kết sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone-3-BSA Antigen phản ứng ELISA Kết phản ứng ELISA Lần lai Tổng số giếng kiểm tra 378 589 478 602 721 Sử dụng kháng nguyên gắn Pro-3-BSA Số giếng dương tính Tỷ lệ (%) 19 12 21 3,23 1,88 1,99 2,91 Sử dụng kháng nguyên gắn BSA Số giếng dương tính 19 12 20 Tỷ lệ (%) Số giếng cho kết dương tính với kháng nguyên Pro-3-BSA, âm tính với BSA Số giếng Tỷ lệ dương tính (%) 3,23 1,46 1,99 2,77 0 0 0,42 0,14 Kết thể Bảng 4.5 cho thấy: Ở lần lai thứ có 0/378 giếng (0%) khơng cho kết ELISA dương tính 49 download by : skknchat@gmail.com sử dụng hai loại kháng nguyên gắn riêng rẽ Progesterone-3-BSA BSA Ở lần lai thứ hai có 19/589 giếng (3,23%), lần lai thứ tư có 12/602 giếng (1,99%) cho kết ELISA dương tính sử dụng hai loại kháng nguyên gắn riêng rẽ Progesterone-3-BSA BSA Đối với lần lai thứ ba có 9/478 giếng (1,88%) cho kết ELISA dương tính với kháng ngun Progesterone-3-BSA Antigen, có 7/478 giếng (1,46%) cho kết ELISA dương tính với kháng nguyên gắn BSA Điều có nghĩa số giếng cho kết ELISA dương tính với kháng ngun Progesterone-3-BSA Antigen có đến 7/9 giếng (77,78%) có kháng thể đơn dịng đặc hiệu cho kháng nguyên BSA có 2/9 giếng (22,22%) có kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone-3-BSA Antigen mà không bắt cặp chéo với kháng nguyên BSA Đối với lần lai thứ năm có 21/721 giếng (2,91%) cho kết ELISA dương tính với kháng nguyên Progesterone-3-BSA Antigen, có 20/721 giếng (2,77%) cho kết ELISA dương tính với kháng nguyên gắn BSA Điều có nghĩa số 21 giếng cho kết ELISA dương tính với kháng nguyên Progesterone-3-BSA Antigen có đến 20/21 giếng (95,24%) có kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên BSA có 1/21 giếng (4,76%) có kháng thể đơn dịng đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone -3- BSA Antigen mà không bắt cặp chéo với kháng nguyên BSA Như sau lần lai lai tạo thành cơng dịng tế bào lai (đặt tên là: C12, D7, F11) tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone-3-BSA antigen Từ dòng tế bào này, tiến hành nhân giống với số lượng lớn để bảo quản tiến hành thí nghiệm Kết Bảng 4.6 cho thấy: Ở lần lai thứ có 7/576 giếng (1,22%), lần lai thứ hai có 16/689 giếng (2,23%), lần lai thứ có 29/664 giếng (4,37%), lần lai thứ có 11/593 giếng (1,85%) cho kết ELISA dương tính sử dụng hai loại kháng nguyên gắn riêng rẽ Progesterone-3-CMO:BSA Antigen BSA Đối với lần lai thứ ba có 13/704 giếng (1,85%) cho kết ELISA dương tính với kháng nguyên Progesterone-3-CMO:BSA Antigen, có 10/704 giếng (1,42%) cho kết ELISA dương tính với kháng nguyên gắn BSA Điều có nghĩa số 13 giếng cho kết ELISA dương tính với kháng nguyên 50 download by : skknchat@gmail.com Progesterone-3-CMO:BSA Antigen có đến 10/13 giếng (76,92%) có kháng thể đơn dịng đặc hiệu cho kháng nguyên BSA có 3/13 giếng (23,08%) có kháng thể đơn dịng đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone-3-CMO: BSA Antigen mà không bắt cặp chéo với kháng nguyên BSA Như sau lần lai lai tạo thành công dòng tế bào lai (đặt tên là: G5, H3, A7) tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone-3-CMO:BSA Antigen Từ dịng tế bào này, chúng tơi tiến hành nhân giống với số lượng lớn để bảo quản tiến hành thí nghiệm Nhận xét chung: Thông qua kết Bảng 4.4, Bảng 4.5, Bảng 4.6 cho thấy, tỷ lệ giếng tế bào lai có kết dương tính với loại kháng ngun thấp (dưới 5%) Ở lần lai, tỷ lệ số giếng dương tính với kháng nguyên progesterone Antigen dao động từ 1,88% - 4,13%, với kháng nguyên Progesterone-3-BSA Antigen dao động từ 0% - 3.23%, với kháng nguyên Progesterone-3-CMO: BSA Antigen dao động từ 1,22% - 4,37% tổng số giếng có tế bào lai Bảng 4.6 Kết sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone -3- CMO:BSA Antigen phản ứng ELISA Kết phản ứng ELISA Lần lai Tổng số giếng kiểm tra 576 689 704 664 593 Sử dụng kháng nguyên gắn Pro-3-CMO Sử dụng kháng nguyên gắn BSA Số giếng dương tính Tỷ lệ (%) Số giếng dương tính Tỷ lệ (%) 16 13 29 11 1,22 2,32 1,85 4,37 1,85 16 10 29 11 1,22 2,32 1,42 4,37 1,85 Số giếng cho kết dương tính với kháng nguyên Pro-3-CMO, âm tính với BSA Số giếng Tỷ lệ dương tính (%) 0 0 0 0,43 0 Tuy nhiên, sử dụng kháng nguyên gắn BSA cho phản ứng ELISA để kiểm tra tính đặc hiệu tế bào lai loại kháng nguyên tỷ lệ số giếng có tế bào lai dương tính với loại kháng nguyên âm tính với BSA thấp (1,3 âm tính với tất kháng nguyên lại Các dòng tế bào tiếp tục nhân nuôi thu dịch nổi, lưu giữ tế bào Nitơ lỏng gây báng cho chuột nhằm thu lượng kháng thể cao nghiên cứu 57 download by : skknchat@gmail.com PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN - Chuột có khả đáp ứng miễn dịch tốt kháng nguyên progesterone nồng độ 200 µg/lần/con - Kết nghiên cứu tạo dòng tế bào lai để sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo, cụ thể: + Đã tạo dòng tế bào lai (đặt tên là: E4, E3, C6, H3, F10) có khả tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone Antigen + Đã tạo dòng tế bào lai (đặt tên là: C12, D7, F11) có khả tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone-3-BSA Antigen + Đã tạo dòng tế bào lai (đặt tên là: G5, H3, A7) có khả tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone-3-CMO:BSA Antigen - Các kháng thể đơn dòng tạo kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng 5.3 KIẾN NGHỊ - Cần tiếp tục thử nghiệm dòng kháng thể đơn dòng tạo để ứng dụng chế tạo thành công que thử nhanh (Quick Sticks) chẩn đốn có thai sớm bị rối loạn hormone sinh sản cho vật nuôi 58 download by : skknchat@gmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu Tiếng Việt: Cù Thị Thiên Thu, Nguyễn Bá Mùi, Lê Văn Phan, Nguyễn Thị Phương Giang, Nguyễn Hoàng Thịnh, Phạm Kim Đăng (2017) Tạo dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dịng kháng Progesterone Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam 23(12) 12.2017 Cục chăn nuôi (2019) Báo cáo kết thực chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020 định hướng phát triển chăn ni giai đoạn 2020 – 2030, tầm nhìn năm 2040 Lê Văn Thọ, Lê Xuân Cương (1979) Kích dục tố ứng dụng chăn nuôi NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Đỗ Quyên (2004), Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình sản xuất kháng thể đơn dòng, Luận án Tiến sĩ khoa học y dược Nguyễn Như Thanh (1997), Miễn dịch học Thú y NXB Nông Nghiệp Tr 7-10, 40-45 a Nguyễn Tấn Anh (1998), Sinh lí sinh sản gia súc NXB Nơng nghiệp, Hà Nội Nguyễn Xuân Tịnh, Tiết Hồng Ngân, Nguyễn Bá Mùi, Lê Mộng Loan (1996) Sinh lý học gia súc NXB Nông nghiệp, Hà Nội 10 Phan Văn Kiểm, Nguyễn Bá Mùi (2005) "Định lượng progesteron máu, góp phần đánh giá tình trạng sinh sản đàn bị sữa", Tạp chí khoa học kỹ thuật nơng nghiệp, Trường đại học nông nghiệp I Hà Nội, 3(2) Tr 130-134 11 Phan Văn Kiểm, Trịnh Quang Phong, Nguyễn Quý Quỳnh Hoa, Tăng Xuân Lưu (2003) “Ứng dụng kết nghiên cứu hàm lượng progesterone để chẩn đoán điều trị rối loạn sinh sản bị sữa”, Hội nghị Cơng nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội Tr 708-711 12 Trần Tiến Dũng, Dương Đình Long, Nguyễn Văn Thanh (2002) Sinh sản gia súc NXB Nông Nghiệp, Hà Nội II Tài Liệu Tiếng Anh: 13 Baruselli P.S., Reis E.L., Marques M.O., Nasser L.F., Bób G.A (2004), The use of hormonal treatments to improve reproductive performance of anestrous beef cattle in tropical climates, Animal Reproduction Science pp.479–486 14 Baruselli P.S., Reis E.L., Marques M.O., Nasser L.F., Bób G.A (2004) The use of hormonal treatments to improve reproductive performance of anestrous beef 59 download by : skknchat@gmail.com cattle in tropical climates, Animal Reproduction Science pp.479–486 15 Fatıma Yücel & Beyazıt Çirakoğlu (1999) Production of Monoclonal Antibodies specific for Progesterone Turk Journal of Biology.23: 393-399 16 htpp://www.accessexcellence.org/RC/AB/MonoclonalAntibody.html 17 Köhler G and Milstein C (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity Nature 256 (5517) pp.495-497 18 Liddell JE, Cryer A (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies John Wiley & Sons Ltd; Chichester: 19 Maurice J Sauner, John A Foulkes and Alan D Cookson (1981) “Direct enzyme immunoassay of progesteron in bovine milk”, Steroids, volume 38, number UK pp.45-52 20 Nakao T, Sugihashi A, Saga N, Tsunda N and Kawata K (1983) “An improved Enzyme immunoassay of progesterone applied to bovine milk”, Br veterinary japan pp.109-117 21 Oliver JP.Leger and Jose.Wsaldanha (2000) Monocnonal Antibodies Cell Feeder, pp.10-30 22 Van De Weil D.F.M and Koops W (1986), “Development and validation of an Enzyme immunoassay for progesterone in bovine milk or blood plasma”, Annimal Reproduction Sience pp.201-203 23 Wu L.S, Guo I.C, Lin J.H (1997), “Pregnancy diagnosis on sows by using an on farm blood progesterone test”, Asia- Australasian journal of Animal Science pp.603-608 24 Yücel F and B Çirakoğlu (2000) Production of Monoclonal Antibodies specific for Progesterone, Estradiole by Simultaneous Injection of Different Steroids Tr J Biology, 24: 697-05 60 download by : skknchat@gmail.com ... văn: Nghiên cứu tạo kháng thể đơn dòng kháng progesterone bò Ngành : Chăn nuôi Mã số: 8620105 Cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu Tạo dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn. .. tiến hành đề tài ? ?Nghiên cứu tạo kháng thể đơn dòng kháng progesterone bò? ?? 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Tạo dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng kháng progesterone làm sở cho việc ứng dụng sản xuất... lực KN - KT cao Kháng thể dòng tế bào tạo gọi kháng thể đơn dịng (KTĐD) Hình 2.6 Kháng thể đơn dòng liên kết với epitope đặc hiệu Các kháng thể đơn dòng nhận biết loại epitope kháng nguyên cho