5 sach XN hóa sinh1 sau chỉnh sửa thực hành

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG TÀI LIỆU HƯỚNG DẪN THỰC HÀNH XÉT NGHIỆM HÓA SINH I Tài liệu đào tạo Cử nhân xét nghiệm y học dự phòng HÀ NỘI 2015 Chủ biên: PGS.TS Phạm Văn Trân TS Bùi Thị Ngọc Hà Biên soạn: PGS.TS Phạm Văn Trân ThS Lê Thanh Hà TS Bùi Thị Ngọc Hà Thư kí biên soạn: CN Nguyễn Thị Phương Thoa MỤC LỤC BÀI 1: KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG XÉT NGHIỆM HÓA SINH LÂM SÀNG BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG GLUCOSE VÀ XÉT NGHIỆM HĨA SINH CHẨN ĐỐN TIỂU ĐƯỜNG I 11 BÀI 3: ĐỊNH LƯỢNG GLUCOSE VÀ XÉT NGHIỆM HĨA SINH CHẨN ĐỐN TIỂU ĐƯỜNG II 19 BÀI 4: ĐỊNH LƯỢNG LIPID VÀ XÉT NGHIỆM CHẨN ĐOÁN XƠ VỮA ĐỘNG MẠCH I .24 BÀI 5: ĐỊNH LƯỢNG LIPID VÀ XÉT NGHIỆM CHẨN ĐOÁN XƠ VỮA ĐỘNG MẠCH II 29 BÀI 6: KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN I 35 BÀI 7: KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN II 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 BÀI 1: KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG XÉT NGHIỆM HÓA SINH LÂM SÀNG Mục tiêu học: Sau kết thúc học sinh viên có thể: - Trình bày phương pháp lấy bảo quản bệnh phẩm để làm xét nghiệm hóa sinh - Lấy máu tĩnh mạch, ly tâm tách lấy huyết tương, huyết để làm xét nghiệm hóa sinh SỬ DỤNG MỘT SỐ DỤNG CỤ TRONG XÉT NGHIỆM HÓA SINH 1.1 Dụng cụ đong thể tích 1.1.1 Ống hút pipette Ống hút pipette loại micropipette thơng dụng để đong thể tích thay đổi nhiều thể tích khác nhau, hoạt động theo nguyên tắc chuyển đổi áp suất khơng khí Có loại pipette: - Ống hút pipette thường: loại chia vạch loại có bầu chứa với vạch thể tích cố định - Ống hút pipette tự động bao gồm loại cố định (chỉ hút thể tích cố định) loại thể tích thay đổi (có thể điều thể tích hút giới hạn cho phép, ví dụ từ 10 - 50 µl, từ 50 - 200 µl) Cấu tạo ống hút pipette tự động: Thân pipette làm polyme, gồm: - Một cửa sổ dùng để hiển thị thể tích cần dung - Một nút để điều chỉnh thể tích - Một nút ấn hút phân phối - Một nút bấm để loại đầu hút khỏi đầu pipette Đầu hút (đầu cone) làm plastic có màu vàng, màu xanh dạng hình nón, thích hợp với loại micropipette Cách sử dụng ống hút pipette tự động: - Chỉnh thể tích theo yêu cầu - Gắn đầu cone vào pipette vặn ngược kim đồng hồ - Cầm pipette thẳng đứng - Khơng nên dùng pipette tích lớn để hút thể tích nhỏ, tuyệt đối không lấy lượng dùng lần với đầu cone - Kiểm tra thể tích trước hút - Nhúng đầu cone vừa chạm vào mức nước không nhúng sâu đầu cone - Khi hút thể tích < 40 µl tráng đầu cone (trộn tất bệnh phẩm, hóa chất ) 1.1.2 Dụng cụ hịa lỗng - Đây dụng cụ để đong thể tích thuốc thử hay để hịa lỗng dung dịch - Cấu tạo: chai đựng thuốc thử với hệ thống van, pit-tông kèm nút điều chỉnh thể tích - Cách sử dụng: lần kéo đẩy ta thể tích điều chỉnh trước Sai số cho phép % 2.2 Máy ly tâm 2.2.1 Công dụng - Dùng để phân tách huyết thanh, huyết tương khỏi tế bào máu - Tách tủa khỏi dung dịch - Tách thành phần không tan khỏi chất lỏng như: tinh thể, tế bào khỏi nước tiểu, vi trùng, ký sinh trùng khỏi dung dịch phân 2.2.2 Cấu tạo - Động - Trục quay - Đầu chứa ống quay ly tâm - Nút nguồn - Nút điều chỉnh thời gian - Nút điều chỉnh tốc độ - Có hay không phận làm lạnh 2.2.3 Cách sử dụng - Chuẩn bị mẫu (các ống nghiệm mẫu) - Cho mẫu vào máy (đảm bảo nguyên tắc cân bằng, đối xứng qua trục), đậy nắp lại - Bật nút nguồn - Chọn tốc độ quay - Chọn thời gian - Bấm nút khởi động - Khi máy ngừng (trục quay giảm tốc độ từ từ sau ngừng hẳn, nhẹ nhàng lấy ống nghiệm ra) - Tắt điện 2.2.4 Cách bảo dưỡng - Thường xuyên làm vệ sinh, kiểm tra máy - Định kỳ kiểm tra thay chổi than (đối với máy sử dụng chổi than) - Cho dầu bôi trơn vào trục ổ bi - Đặt máy nơi cố định nơi vững có nguồn điện với điện hoạt động tránh di chuyển Chú ý: - Đợi máy ngừng hẳn mở nắp ra, không dùng tay hãm đà quay máy - Trong máy hoạt động thấy có tượng khơng bình thường máy bị rung, lắc, có tiếng khua phải tắt máy kiểm tra lại LẤY VÀ BẢO QUẢN BỆNH PHẨM XÉT NGHIỆM HÓA SINH 2.1 Máu 2.1.1 Đại cương Máu bệnh phẩm quan trọng sử dụng làm vật liệu xét nghiệm nhiều Máu đóng vai trị trung tâm q trình vận chuyển nước chất hịa tan Đó nội mơi thể Cơ thể ln đảm bảo ổn định số nội mơi nghĩa thơng số máu (trong có thơng số hóa sinh) ln ln trạng thái ổn định động Khi trị số thơng số vượt khởi giới hạn sinh lý (cao thấp hơn) chúng phản ánh trạng thái bệnh lý Các bệnh phẩm từ máu: Máu tồn phần: lấy máu cho vào ống nghiệm có chất chống đơng (heparin, natriclorua, natrioxalat,…) có máu tồn phần - Huyết tương huyết cầu: ly tâm màu tồn phần (có chất chống đơng) thu huyết tương (dịch trên) huyết cầu (phần đặc đáy ống nghiệm) Huyết tương có fibrinogen Có thể thực xét nghiệm hồng cầu bạch cầu - Huyết thanh: lấy máu cho vào ống nghiệm khơng có chất chống đơng, cục máu đơng hình thành tiết huyết Huyết khác huyết tương chỗ không chứa fibrinogen - 2.1.2 Cách lấy máu làm xét nghiệm Dụng cụ: - Bơng gịn vơ trùng - Ống tiêm vô trùng sử dụng lần - Dây thắt garrot, cồn 700 - Ống nghiệm có hay khơng có chất chống đơng - Băng dán cầm máu Kỹ thuật: - Ống đựng máu phải ghi đầy đủ tên, tuổi bệnh nhân, khoa ban - Cho bệnh nhân ngồi ngắn, tay duỗi thẳng bàn - Thắt dây garo cách khuỷu tay khoảng 10cm - Dùng ngón tay sờ nhẹ vào tĩnh mạch để xác định vị trí lấy máu Sát trùng vị trí lấy máu bơng tẩm cồn 70 0, lau bơng theo xốy trơn ốc từ - - Hướng mũi vát đầu kim lên, cẩn thận đưa vào tĩnh mạch - Sau kim vào tĩnh mạch tháo dây garo - Kéo nhẹ pittong, lấy đủ lượng máu cần dùng - Rút kim tiêm khỏi tĩnh mạch, dán băng cầm máu vào chỗ vừa rút kim - Lấy kim khỏi ống tiêm, bơm máu nhẹ nhàng vào thành tube đựng máu - Đậy nắp, trộn nhẹ nhàng lên xuống tube có chất chống đơng 2.1.3 Bảo quản lưu ý lấy máu Để tránh tiêu huyết, bơm máu vào thành ống nghiệm phải rút kim bơm nhẹ vào thành ống Vận chuyển nhẹ nhàng, tránh làm rơi va đập mạnh - - Lấy huyết cần máu đơng hồn tồn đem ly tâm - Khơng ly tâm q 15 phút với vận tốc khơng q 3000 vịng/phút Nếu lấy huyết tương huyết cần tiến hành ly tâm tách máu sớm tốt, không để kể từ lấy máu - Máu tồn phần trữ lạnh khơng trữ đơng làm cho tế bào bị phá vỡ - - Phải đeo găng tay lấy máu tiếp xúc với bệnh phẩm - Đậy nắp ống nghiệm để tránh bốc nước nhiễm khuẩn 2.1.4 Một số điều cần biết sử dụng chất chống đơng Chất chống đơng có tác dụng ngăn cản hình thành cục máu đơng, giữ cho máu trạng thái lỏng sau khỏi thể - Nguyên tắc lựa chọn chất chống đông thành phần chất chống đơng khơng có danh mục định lượng không làm ảnh hưởng thay đổi đến kết xét nghiệm - Tuyệt đối không san máu từ ống chứa chất chống đông sang ống chứa chất chống đông khác - - Không nên đậy nhầm nút nhựa ống chứa chất chống đông khác 2.1.5 Một số chất chống đông sử dụng EDTA (Ethylenediaminetraacetic acid): EDTA có cơng thức phân tử C10H16N2O8 Ống nghiệm chứa chống đơng EDTA có nắp đậy màu xanh da trời EDTA có tác dụng giữ tế bào máu hình dạng bình thường sau khỏi thể Chất chống đông sử dụng phân tích huyết học, xét nghiệm HbA1c định lượng thuốc EDTA có gốc kali nên làm kali tăng cao trong xét nghiệm ion đồ EDTA tạo thành hợp phức với Ca2+, Cu2+, Fe3+, Mn2+… nên làm ảnh hưởng nhiều đến kết xét nghiệm ion không lên màu phản ứng màu, nồng độ định lượng giảm Heparin: Heparin có cơng thức phân tử C12H19NO20S3, chất kết hợp với nhiều ion khác tạo thành muối heparin heparin lithium (chứa Li+), heparin sodium (chứa Na+), heparin calcium (chứa Ca2+) Ống nghiệm chứa chống đơng heparin lithium có nắp đậy màu đen, sử dụng cho xét nghiệm Ion đồ Chất chống đông heparin Sodium sử dụng xét nghiệm khí máu động mạch NaF (Sodium florid): Ống nghiệm chứa chống đơng NaF có nắp đậy màu xám Chất chống đông NaF sử dụng để định lượng xác đường huyết, có khả ức chế hồng cầu tiêu thụ glucose máu NaF có gốc Na + nên làm tăng kết Na+ xét nghiệm ion đồ KLiO4S (Lithium potassium sulfat): Tương tự NaF, có chứa gốc K+ Li Tri Na Citrat (Tri-sodium citrat): Chất có cơng thức phân tử C6H5O7Na2H2O Ống nghiệm chứa chống đông có nắp đậy màu xanh cây, dùng xét nghiệm đơng máu Do có chứa gốc Na+ ảnh hưởng đến ion đồ 2.2 Nước tiểu 2.2.1 Đại cương Nước tiểu hình thành qua giai đoạn, giai đoạn lọc cầu thận giai đoạn tái hấp thu, tiết ống thận Kết q trình dịch lọc đặc thành nước tiểu cuối qua ống góp, bể thận 2.2.2 Cách lấy mẫu nước tiểu ngẫu nhiên - Lấy mẫu thử nước tiểu vào buổi sáng sớm tốt - Vệ sinh đường tiểu - Lấy nước tiểu dòng, bỏ phần đầu phần cuối - Lọ đựng phải vô trùng Ghi tên, tuổi bệnh nhân, khoa phòng đầy đủ - Để tránh kết sai lệch cần tránh lấy mẫu: + Sau uống nước nhiều + Sau ăn, + Sau lao động nặng nhọc đứng lâu chỗ + Trong thời gian có kinh nguyệt phụ nữ 2.2.3 Mẫu nước tiểu 24h Thực xét nghiệm: - Tính tổng lượng urê, creatinin nước tiểu 24 - Tính tổng lượng protein nước tiểu 24 - Ion đồ niệu 24 - Độ thải creatinin - Tính tổng lượng đồng nước tiểu 24 (Bệnh Willson) - Các xét nghiệm sinh hóa nước tiểu khác Cách lấy mẫu nước tiểu 24 giờ: Nhân viên xét nghiệm phải hướng dẫn bệnh nhân thật kỹ cách lấy nước tiểu 24 Chuẩn bị sẵn bình chứa thể tích khoảng lít lớn tùy thuộc vào lượng nước tiểu hàng ngày Dùng nước sôi tráng, khử trùng bình nhựa, để nguội, cho dung dịch chất bảo quản vào, đậy kín nắp Chọn bắt đầu thực (tốt từ 6h sáng ngày bắt đầu đến 6h sáng ngày hôm sau) Đúng 6h sáng hôm bắt đầu, tiểu hết bỏ hẳn phần nước tiểu Mỗi muốn tiểu sau đó, tiểu vào bình chứa (đã chuẩn bị sẵn) vào ca miệng rộng, rót vào bình chứa Đúng 6h sáng hôm sau (đủ 24h) tiểu lần cuối vào bình chứa Mang bình chứa nước tiểu nhanh tốt tới phịng xét nghiệm (khơng để lâu q 1giờ hoàn tất nước tiểu 24 giờ) Chất bảo quản nước tiểu 24 giờ: Quá trình phát triển vi sinh vật làm biến chất hư hại nước tiểu Vì muốn giữ mẫu tốt khơng làm ảnh hưởng kết xét nghiệm ta phải bảo quản nước tiểu 24 nhằm hạn chế phát triển vi sinh vật Một số chất bảo quản: Dung dịch Thymol rượu 1%, 1ml cho 100ml nước tiểu (không dùng dung dịch cần định lượng protein làm sai kết quả) Dầu toluene đổ vào bình chứa, tạo thành lớp mỏng bề mặt nước tiểu, tạo mơi trường kị khí, làm chậm trình phát triển vi sinh vật Phenol Formol (1 giọt cho 30 ml nước tiểu) Acid acetic 50% 2.3 Các bệnh phẩm khác Phân, dịch não tủy, nước bọt, dịch hút (dịch màng phổi, dịch cổ chướng, dịch khớp, dịch tụy, dịch mật…) tế bào mô, sỏi niệu, sỏi mật 10 Lắc Để yên nhiệt độ phòng 10 phút Đo mật độ quang học bước sóng 530 nm Đối chiếu với ống trắng để tính mật độ quang học thực phức hợp màu xanh tím tạo ống chuẩn (AS) ống thử (AT) Nồng độ protein ống thử (CT) tính theo cơng thức: A T - AB CT =  x CS (g/l) A S - AB Trong CS = 60 g/l 2.4 Ý nghĩa Protein toàn phần huyết tổng hợp chủ yếu gan, tế bào máu, hạch lympho, lách tủy xương Bình thường, nồng độ protein tồn phần huyết 60 - 80 g/L Khi bị bệnh, nồng độ protein tồn phần thành phần protein thay đổi Trong lâm sàng giảm nồng độ protein huyết quan tâm - Giảm protein huyết thường gặp: + Do giảm cung cấp: Gặp trường hợp chế độ ăn thiếu protein, suy dinh dưỡng, bệnh Kwashiorkor tiêu hoá hấp thu gặp số bệnh đường tiêu hoá bệnh spru (rối loạn tiêu hóa, hấp thu protein), bệnh Crohn’s (viêm đại tràng tự miễn), thiếu hụt enzym tiêu hoá, thiếu hụt hệ thống vận chuyển acid amin, + Do giảm tổng hợp: Chủ yếu gặp bệnh gan xơ gan, viêm gan gan tổng hợp 100% albumin, 80% globulin huyết + Do protein: Bệnh thận: Điển hình hội chứng thận hư, đào thải nhiều protein qua nước tiểu Nồng độ protein mỏu giảm dẫn đến giảm áp lực keo lòng mạch gây phù Ngồi cịn gặp viêm cầu thận mạn, suy thận Bệnh bỏng nặng: Mất máu huyết tương qua vết bỏng Các trường hợp chảy máu, máu nói chung + Do dùng thuốc: Thuốc gây giảm protein huyết bao gồm estrogen thuốc tránh thai đường uống - Tăng protein huyết thanh: Ít gặp Tăn tương đối gặp trường hợp máu cô nước, điện giải nặng 38 Tăng tuyệt đối gặp trường hợp tăng tổng hợp loại protein bất thường đó, ví dụ bệnh đa u tuỷ xương xuất protein Bence-Jones (protein nhiệt tan) làm cho protein máu tăng cao, tới 160 g/L Garo lâu lấy máu gây tăng nhẹ protein Một số thuốc gây tăng protein tồn phần huyết thanh, VD steroids, androgens, corticosteroids, dextran, hóc mơn sinh trưởng, insulin, phenazopyridine progesterone 39 BÀI 7: KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN II Mục tiêu học: Sau kết thúc học sinh viên - Trình bày nguyên lý ý nghĩa xét nghiệm định lượng protein toàn phần nước tiểu - Thực đánh giá kết xét nghiệm nước tiểu 10 thông số ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NƯỚC TIỂU 1.1 Phương pháp đo độ đục (theo Kingsburry) 1.1.1 Nguyên lý Kết tủa protein acid sulphosalicylic 3% Đo độ đục tính kết theo dung dịch protein chuẩn 1.1.2 Chất thử thuốc thử - D.d sulphosalicylic 3%: Hoà tan 30 g acid sulphosalicylic hoàn thành lít bình định mức nước cất - D.d protein chuẩn 0,3 g/l: Pha từ dung dịch protein có nồng độ dã biết - Nước tiểu 24 giờ: Lấy nước tiểu 24 giờ, lọc lấy 5-10 ml để làm xét nghiệm Kết xét nghiệm máu thường nồng độ chất Nhưng kết định lượng nước tiểu thường tính số lượng đào thải 24 Đó chất lượng nước tiểu thường không đồng thời điểm ngày Để đánh giá xác tình trạng bệnh lý, nên tính số lượng đào thải 24 Do phải đo thể tích nước tiểu 24 Cách lấy nước tiểu 24 giờ: Bước 1: Sau ngủ dậy, tiểu hết vào bồn vệ sinh mà không lấy mẫu nước tiểu thời điểm Bước 2: Thu thập toàn lượng nước tiểu thời gian cịn lại ngày hơm buổi tối, gom vào bình đựng Có thể cho khoảng 10 – 20 ml toluen để bảo quản Bước 3: Đúng 24 sau Bước 1, thu thập mẫu nước tiểu cuối đổ dồn vào bình đựng Đo thể tích 40 2.1.3 Tiến hành Cho vào ống nghiệm nhỏ: Bảng 11: Thiết kế thí nghiệm định lượng Protein nước tiểu (bằng phương pháp đo độ đục) Chất liệu D.d sulphosalicylic 3% Nước cất D.d protein chuẩn Nước tiểu 24 ống trắng (B) ml 0,5 ml ống chuẩn (S) ml ống thử (T) ml 0,5 ml 0,5 ml Trộn Để yên 10 phút Đo độ hấp thụ quang bước sóng 590 nm, ống trắng, ống chuẩn ống thử Nồng độ protein tính theo cơng thức: A T - AB CT =  x CS (g/l) A S - AB Lượng protein thải nước tiểu 24 = CT x V (g/24h) Trong đó: AB: độ hấp thụ quang ống trắng AS: độ hấp thụ quang ống chuẩn AT: độ hấp thụ quang ống thử CS: nồng độ dung dịch chuẩn (0,2 g/l) CT: nồng độ protein mẫu thử nước tiểu (g/l) V: thể tích nước tiểu 24 (lít) 1.1.4 Giá trị tham khảo Protein nước tiểu: 0,024- 0,141 g/24 Trong lâm sàng cho phép tới 0,3 g/24 1.2 Phương pháp đo màu Phương pháp đo màu xác phương pháp đo độ đục Tuy nhiên, nồng độ protein nước tiểu (cũng protein dịch não tủy) thấp nhiều so với nồng độ protein huyết nên không dùng thuốc thử Gornall Hiện có số thuốc thử đo màu đủ độ nhạy để định lượng protein nước tiểu dịch não tủy Ví dụ thuốc thử Coomassie 1.2.1 Nguyên lý Protein kết hợp với thuốc thử Coomassie mơi trường acid phosphoric tạo thành sản phẩm có màu xanh Cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein Đo 41 màu bước sóng 578 nm, song song tiến hành với mẫu chuẩn để định lượng 1.2.2 Chất thử thuốc thử - Nước tiểu 24 - Dung dịch chuẩn protein: 0,2 g/l (200 mg/l) - Thuốc thử: sẵn dùng, gồm Coomassie G-250, phosphoric acid 1.2.3 Tiến hành Phản ứng Cho vào ống nghiệm: Bảng 11: Thiết kế thí nghiệm định lượng Protein nước tiểu (phương pháp đo màu) Chất liệu Thuốc thử Nước cất D.d protein chuẩn Nước tiểu 24 ống trắng (B) ml 10 µl ống chuẩn (S) ml 10 µl ống thử (T) ml 10 µl Trộn Để phút Đo độ hấp thụ quang bước sóng 578 nm, ống trắng (AB), ống chuẩn (As) ống thử (AT) Nồng độ protein tính theo cơng thức: A T - AB CT =  x CS (g/l) A S - AB Lượng protein thải nước tiểu 24 = CT x V (g/24h) Trong đó: AB: độ hấp thụ quang ống trắng AS: độ hấp thụ quang ống chuẩn AT: độ hấp thụ quang ống thử CS: nồng độ dung dịch chuẩn (0,2 g/l) CT: nồng độ protein mẫu thử nước tiểu (g/l) V: thể tích nước tiểu 24 (lít) 2.3 Ý nghĩa lâm sàng - Tăng protein nước tiểu chủ yếu gặp bệnh thận Bệnh thận nguyên phát thứ phát gây tăng tính thấm cầu thận, đặc biệt thận hư nhiễm mỡ, protein lọt qua màng lọc cầu thận, xuất nước tiểu Nếu 42 nhiều protein qua thận làm protein huyết tương giảm xuống, áp lực keo giảm, gây triệu chứng phù ứ nước dịch gian bào - Protein niệu nguyên nhân sau thận thường nhiễm khuẩn tổn thương đường tiết niệu Trong trường hợp này, thường xuất hồng cầu, bạch cầu nước tiểu - Protein niệu cịn ngun nhân trước thận (hiếm gặp) Đó rối loạn tổng hợp protein bệnh đa u tủy xương (bệnh Kahler) Protein huyết tương sản xuất với số lượng nhiều (120 – 160g/l), phân tử lượng nhỏ, nước tiểu Protein niệu loại protein Bence-Jones hay gọi protein “nhiệt tan” XÉT NGHIỆM TỔNG PHÂN TÍCH NƯỚC TIỂU 10 THƠNG SỐ 2.1 Ngun lý Các thơng số hoá sinh nước tiểu (… ) bán định lượng giấy thử sử dụng kỹ thuật đo phản quang Thông thường, giấy (que thử) cấu tạo gồm 11 khu vực phản ứng có chứa sẵn chất thị để sẵn sàngcác phản ứng với chất thông thường xuất nước tiểu theo nguyên lý : - Glucose nước tiểu: Glucose oxidase xúc tác phản ứng oxy hóa glucose thành acid gluconic hydrogen peroxide (H2O2) Sau peroxidase xúc tác phản ứng H2O2 iodua Kali tạo hợp chất có mầu từ xanh đến mầu nâu tùy theo nồng độ glucose nước tiểu Phương pháp bán định lượng glucose nước tiểu từ 100mg/dl đến 200mg/dl - Protein nước tiểu: Dựa nguyên tắc phản ứng protein với chất thị, pH định, có mặt protein nước tiểu tạo mầu xanh đến màu xanh lục tùy theo nồng độ protein nước tiểu - Bilurubin niệu (sắc tố mật): Bilirubin kết hợp với muối diazo (dichloroanilin diazo hóa ) mơi trường acid mạnh thành phức hợp có mầu hồng xám - Ceton niệu: Dựa vào phản ứng Legal: acid acetoacetic kết hợp với nitroprussid tạo thành phức hợp có màu tím hồng - Máu hemoglobin: Dựa hoạt tính peroxidase hemoglobin xúc tác phân hủy hydrogen peroxide hữu giải phóng oxy Oxy giải phóng oxy hóa chất thị 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidin tạo hợp chất mầu từ da cam đến xanh lục đến xanh đen - Bạch cầu: Dựa tác dụng enzyme esterase bạch cầu có hạt có nước tiểu Esterase xúc tác thủy phân dẫn xuất naphthyl este, naphthyl giải phóng phản ứng với muỗi diazo tạo thành họp chất có mầu từ đỏ be tới đỏ tím Độ nhạy thí nghiệm từ 5-15 tế bào/µl nước tiểu Ngay bạch cầu bị phân giải esterase bạch cầu hoạt động Cho nên thử nghiệm bổ sung cho xét nghiệm tế bào 43 - Nitrit: Nguyên lý thử nghiệm nitrat từ thức ăn có nước tiểu bị chuyển hóa vi khuẩn gram (-) thành nitrit Nitrit phản ứng với p-arsanilic acid tạo thành phức hợp diazo môi trường acid Phức hợp diazo kết hợp với 1,2,3,4tetrahydrobenzoquinolin- 3-ol tạo hợp chất có mầu hồng Phản ứng đặc trưng với nitrit, không phản ứng với chất nước tiểu - Urobilinogen: Xét nghiệm dựa kết hợp urobilinogen với thuốc thử diazo tạo thành hợp chất có mẫu đỏ hồng Phản ứng đặc hiệu cho urobilinogen stescobinlinogen - Tỷ trọng nước tiểu: Với có mặt chất thị mầu, nồng độ chất điện ly (đặc trưng cho tỷ trọng) tạo mầu xanh lục đến mầu vàng - pH nước tiểu: Các chất thị đỏ methyl, phenolphtalein bromothymol bleu có giấy thử cho gam mầu từ màu đỏ da cam đến vàng tồi xanh lục xanh vùng pH nước tiểu 2.2 Chất thử thuốc thử - Nước tiểu lấy - Que thử nước tiểu sẵn dùng 2.3 Tiến hành - Lấy que thử khỏi lọ đậy nắp Nhúng tồn phần có thử que thử ngập vào nước tiểu (mới lấy, trộn đều, chưa ly tâm) lấy để tránh hoà tan thuốc thử - Khi lấy ra, gạt nhẹ cạnh que thử vào thành ống đựng nước tiểu để loại bỏ nước tiêủ thừa Giữ que nằm ngang thấm nhẹ hai cạnh que thử giấy thấm để tránh trộn lẫn thuốc thử hai ô thử cạnh tránh nước tiểu thấm vào tay Đọc kết vòng 1-2 phút 2.4 Đọc kết Có cách đọc kết quả: - Theo bảng màu mẫu, dán kèm hộp đựng que thử Đặt que thử cạnh bảng màu, so sánh cường độ màu ô thử với dãy ô màu mẫu cho thông số tương ứng Khi thấy nhau, đọc kết ghi kèm theo ô mẫu - Đo máy Nguyên tắc: chiếu tia sáng đơn sắc vào ô màu Một phần ánh sáng bị ô màu hấp thụ, phần ánh sáng phản xạ trở lại Căn vào cường độ ánh sáng ban đầu ánh sáng phản xạ, tính phần ánh sáng bị hấp thụ Phần ánh sáng bị hấp thụ tùy thuộc vào đậm độ ô màu, tức phụ thuộc vào nồng độ chất thử mẫu nước tiểu 3.5 Ý nghĩa lâm sàng: Glucose nước tiểu: 44 Bình thường khơng có glucose nước tiểu có lượng nhỏ khơng phát phương pháp thông thường (nên coi glucose âm tính) Glucose niệu xuất thống qua số trường hơp như: gây mê, dùng thuốc glucocorticoid có mang, ăn lúc nhiều đường.Glucose niệu xuất liên tục gặp đái tháo đường tụy, đo đường máu cao vượt khả hấp thu thận Hoặc gặp trường hợp đường máu bình thường ngưỡng thận glucose thấp (đái tháo đường thận) Glucose niệu gặp ưu số tuyến nội tiết ưu tuyến yên, tuyến giáp, tuyến thượng thận Lưu ý: Xét nghiệm đặc trưng cho glucose, không phản ứng với lactose, galactose, fructose chất chuyển hóa khác Vitamin C với nồng độ cao nước tiểu đưa đến kết âm tính giả Cho nên có loại băng thử người ta thêm ô thử để xác định vitamin C Dương tính giả xuất chất tây rửa có tính oxy hóa lọ đựng nước tiểu - Protein nước tiểu: Nước tiểu bình thường có lượng protein khoảng 0,03-0,1g/24h, vốn lượng nhỏ phương pháp thơng thường khơng phát được, protein có KLPT nhỏ Được coi protein niệu âm tính Trong số trường hợp bệnh lý protein nước tiểu tăng lên gọi protein niệu Thông thường protein nước tiểu thường albumin có người cịn gọi albumin niệu Protein niệu bệnh lý: thường gặp tổn thương màng lọc cầu thận như: hội chứng thận hư nhiễm mỡ, suy thận, viêm thận mạn, viêm thận cấp… Protein niệu gặp trường hợp xuất loại protein bất thường máu, ví dụ bệnh đa u tủy xương xuất loại protein có KLPT nhỏ gọi protein Bence Jones hay protein nhiệt tan Bence Jones phát qua màng lọc cầu thận nước tiểu (mặc dù mạng lọc cầu thận bình thường) Protein niệu gặp suy tim, tốc độ dòng máu qua cầu thận giảm protein khuếch tán dịch lọc cầu thận - Bilurubin niệu (sắc tố mật): Nước tiểu bình thường có lượng vết bilirubin Trong bệnh lý tắc mật, viêm gan, xơ gan làm tăng mật máu đào thải nước tiểu Chỉ có loại bilirubin liên hợp qua mang lọc cầu thận đào thải nước tiểu Còn bilirubin tự (gắn với albumin huyết thanh) không qua màng lọc cầu thận dù có tăng lên máu khơng có bilirubin nước tiểu - Ceton niệu: Mỗi ngày có khoảng 0,003- 0,015 gam thể ceton chủ yếu 3-hydroxybutyrat acetoacetat có nước tiểu Một lượng nhỏ khơng thể phát phương pháp hóa sinh thơng thường coi ceton niệu âm tính Trong 45 số bệnh lý ceton máu đào thải nước tiểu bệnh đái tháo đường tụy đói ăn kéo dài, có thai, luyện tập nặng, dùng thuốc glucocorticoid lâu ngày - Máu hemoglobin: Nước tiểu bình thương có hồng cầu khơng có hemoglobin Một số trường hợp bệnh lý làm tăng nhiều hồng cầu hemoglobin nước tiểu như: viêm thận, sỏi thận, ung thư thận, vàng da tan máu, sốt rét, bỏng nặng… - Bạch cầu: Sự có mặt bạch cầu nước tiểu dấu hiệu nhiễm trùng thận hay đường tiết niệu - Nitrit: Kết dương tính cho biết có ≥ 105 vi khuẩn/1ml nước tiểu Kết âm tính khơng loại trừ có mặt vi khuẩn nước tiểu Có thể thời gian ủ bệnh chưa đủ nhiễm trùng đường niệu vi khuẩn khơng có enzyme nitratreductase Trước làm xét nghiệm bệnh nhân ăn nhiều rau, uống bớt nước, ngừng dùng kháng sinh vitamin C ngày trước Vitamin cao gây kết âm tính giả Dương tính giả nước tiểu cũ, nitrit tạo thành nhiễm bẩn - Urobilinogen: Nồng độ urobilinogen nước tiểu bình thường 0,1-1,0 EU/dl (Ehrlich Unit/dl) Nếu EU/l dương tính Urobilinogen tăng nước tiểu gặp viêm gan, xơ gan, ung thư gan vỡ hồng cầu nhiều Urobilinogen biến hoàn toàn nước tiểu tắc nghẽn đường dẫn mật - Tỷ trọng nước tiểu: Nước tiểu bình thường có tỷ trọng thay đổi từ 1,003- 1,035, trung bình từ 1,016-1, 022 Tỷ trọng cao đái tháo đường (> 1,030) Tỷ trọng thấp đái tháo nhạt (1,000) Vitamin C, acid gentisic ảnh hưởng đến xét nghiệm này, phải lấy nước tiểu 10 sau dùng thuốc - pH nước tiểu: pH nước tiểu bình thường từ 5-8; pH< gặp đái tháo đường khơng kiểm sốt, đói lả, nước (cần kiểm tra thêm đường ceton niệu); pH> nhiễm trùng đường tiết niệu (chỉ cần kiểm tra thêm nitrit, bạch cầu, hồng cầu, protein) 46 BÀI 8: KỸ THUẬT PHÁT HIỆN SẮC TỐ MẬT VÀ ĐỊNH LƯỢNG ACID URIC TRONG NƯỚC TIỂU Mục tiêu học: Sau kết thúc học sinh viên - Trình bày ngun lý ý nghĩa xét nghiệm xác định sắc tố mật đinh lượng acid uric nước tiểu - Làm đánh giá kết xét nghiệm xác định sắc tố mật đinh lượng acid uric nước tiểu PHÁT HIỆN SẮC TỐ MẬT (BILIRUBIN) TRONG NƯỚC TIỂU (thử nghiệm Harrison) 1.1 Nguyên lý Oxy hóa bilirubin thành biliverdin có màu xanh thuốc thử Fouchet (FeCl acid trichloacetic) 1.2 Chất thử thuốc thử - Nước tiểu tươi - Dung dịch BaCl2 10% - Thuốc thử Fouchet - Dung dịch (NH4)2 SO4 bão hoà 1.3 Tiến hành Cho vào ống nghiệm to: - Nước tiểu lấy ml - BaCl2 10% ml Lắc đều, cho thêm - giọt amonisunfat bão hoà Lắc để yên 10 phút Lọc giấy lọc, giữ lấy tủa giấy lọc Thấm khô tủa giấy thấm Nhỏ lên tủa 1giọt thuốc thử Fouchet 1.4 Nhận định kết Phản ứng dương tính (có bilirubin nước tiểu), có vịng xanh xung quanh giọt thuốc thử Fouchet sau 1vài phút 1.5 Ứng dụng lâm sàng Nếu có bilirubin nước tiểu loại bilirubin trực tiếp (bilirubin liên hợp) loại tan nước Loại bilirubin gián tiếp (bilirubin tự do) khơng tan 47 nước, máu kết hợp với albumin làm kích thước phân tử lớn nên khơng qua màng lọc cầu thận Bilirubin niệu dương tính gặp trường hợp viêm gan tắc mật Trên lâm sàng, kết hợp với xét nghiệm bilirubin huyết để chẩn đoán nguyên nhân gây vàng da 1.6 Cách pha thuốc thử - Dung dịch BaCl2 10% pha nước - Thuốc thử Fouchet: hoà tan 25 gam acid trichloacetic 100 ml nước Thêm vào 10 ml dung dịch BaCl2 10% trộn - Dung dịch amonisunfat bão hoà : (NH4)2SO4 80 g Hoà tan 100 ml H2O - Dung dịch iod alcol etylic: Iod 0,7 g KI 0,5 g H2 O ml Trộn cho thêm: alcol 950 95 ml Trộn ĐỊNH LƯỢNG ACID URIC TRONG NƯỚC TIỂU 2.1 Nguyên lý Acid uric bị oxy hóa uricase H2O2 tạo thành, xúc tác peroxidase, phản ứng với acid 3,5-dichloro-2-hydroxybenzensulfonic (DCHBS) 4aminophenazon (PAP) tạo thành quinonimin có màu đỏ tím Uricase Uric + O2 + H2O Allantoin + CO2 + H2O2 Peroxidase H2O2 + DCHBS + PAP N-(4-antipyryl)-3-chloro-5-sulfonat-pbenzoquinon imin (quinonimin) + HCl + H2O 2.2 Chất thử thuốc thử - Nước tiểu pha loãng 10 lần (1+9) nước cất + Thuốc thử: - Tùy theo hãng sản xuất thuốc thử mà có cách pha chế đóng gói thuốc thử khác Đối với kít hãng Beckman Coulter, nồng độ chất dung dịch phản ứng là: 48 Đệm phosphate (pH 7.5) 42 mmol/L MADB 0.15 mmol/L 4-Aminophenazone 0.30 mmol/L Peroxidase ≥ 5.9 kU/L (98 μkat/L) Uricase ≥ 0.25 kU/L (4.15 μkat/L) Ascorbate Oxidase ≥ 1.56 kU/L (26 μkat/L) Chất bảo quản Khi làm pha theo tỷ lệ hướng dẫn ghi hộp thuốc thử - Dung dịch acid uric chuẩn 476 µmol/l (8 mg/dl) 2.3 Tiến hành + Cài đặt chương trình đo nồng độ acid uric máy xét nghiệm bán tự động Chú ý thông số quan trọng: - Phương pháp đo: Đo điểm cuối (Endpoint) - Bước sóng: 546 nm - Giá trị chuẩn: Tùy theo loại dịch chuẩn sử dụng mà có giá trị khác - Đơn vị tính: µmol//L - Nhiệt độ: 37oC - Giới hạn tuyến tính: 119 – 23800 μmol/L + Cho vào ống nghiệm dung tích ml: Bảng 12: Thiết kế thí nghiệm định lượng acit uric nước tiểu Thuốc thử Ống trắng Ống chuẩn Ống thử ml ml ml - 20 µl - Thuốc thử Dung dịch chuẩn acid uric 476 µmol/l Huyết nước tiểu pha loãng 20 µl 1/10 Trộn đều, để yên 10 phút nhiệt độ phịng Đo mật độ quang học bước sóng 546 nm phức hợp đỏ quinonimin tạo thành ống trắng (AB), ống chuẩn (AS) ống thử (AT) Nồng độ acid uric tính kết theo cơng thức: A T - AB CT =  x CS A S - AB CS nồng độ dung dịch acid uric chuẩn 49 (mol/l) 2.4 Giá trị tham khảo - Nam : 200 - 420 µmol/L - Nữ : 150 - 350 µmol/L - Nước tiểu: 1488 – 4463 μmol/24 2.5 Ý nghĩa Acid uric sản phẩm cuối q trình thối biến purin Acid uric tạo thành xảy gan đào thải qua thận Trong máu thường tồn dạng monosodium urate Giới hạn hoà tan muối urat khoảng 6,8 mg/dl nhiệt độ 37oC Ở nồng độ cao tinh thể urate bị kết tủa Tuy nhiên, số trường hợp tinh thể urate không bị kết tủa, ảnh hưởng số chất hòa tan máu Phần lớn acid uric máu dạng tự do, khoảng