Sau khi kết thúc bài học sinh viên cĩ thể
- Trình bày được nguyên lý và ý nghĩa xét nghiệm định lượng protein tồn phần trong nước tiểu.
- Thực hiện được và đánh giá được kết quả xét nghiệm nước tiểu 10 thơng số 1. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NƯỚC TIỂU
1.1. Phương pháp đo độ đục (theo Kingsburry)
1.1.1. Nguyên lý
Kết tủa protein bằng acid sulphosalicylic 3%. Đo độ đục và tính kết quả theo dung dịch protein chuẩn.
1.1.2. Chất thử và thuốc thử
- D.d. sulphosalicylic 3%: Hồ tan 30 g acid sulphosalicylic và hồn thành 1 lít trong bình định mức bằng nước cất.
- D.d. protein chuẩn 0,3 g/l: Pha từ dung dịch protein cĩ nồng độ dã biết. - Nước tiểu 24 giờ: Lấy nước tiểu 24 giờ, lọc lấy 5-10 ml để làm xét nghiệm.
Kết quả xét nghiệm trong máu thường là nồng độ các chất. Nhưng các kết quả định lượng trong nước tiểu thường tính ra số lượng được đào thải trong 24 giờ. Đĩ là do chất lượng nước tiểu thường khơng đồng đều tại các thời điểm trong ngày. Để đánh giá chính xác tình trạng bệnh lý, nên tính ra số lượng đào thải trong 24 giờ. Do đĩ phải đo thể tích nước tiểu trong 24 giờ.
Cách lấy nước tiểu 24 giờ:
Bước 1: Sau khi ngủ dậy, đi tiểu hết vào trong bồn vệ sinh mà khơng lấy mẫu nước tiểu thời điểm này.
Bước 2: Thu thập tồn bộ lượng nước tiểu trong thời gian cịn lại của ngày hơm đĩ và buổi tối, gom vào bình đựng sạch. Cĩ thể cho khoảng 10 – 20 ml toluen để bảo quản.
Bước 3: Đúng 24 giờ sau Bước 1, thu thập mẫu nước tiểu cuối cùng và đổ dồn vào bình đựng. Đo thể tích.
2.1.3. Tiến hành
Cho vào 3 ống nghiệm nhỏ:
Bảng 11: Thiết kế thí nghiệm định lượng Protein trong nước tiểu (bằng phương pháp đo độ đục)
Chất liệu ống trắng (B) ống chuẩn (S) ống thử (T)
D.d. sulphosalicylic 3% 2 ml 2 ml 2 ml
Nước cất 0,5 ml
D.d. protein chuẩn 0,5 ml
Nước tiểu 24 giờ 0,5 ml
Trộn đều. Để yên 10 phút.
Đo độ hấp thụ quang ở bước sĩng 590 nm, của ống trắng, ống chuẩn và của ống thử .
Nồng độ protein được tính theo cơng thức: AT - AB
CT = x CS (g/l) AS - AB
Lượng protein thải trong nước tiểu 24 giờ = CT x V (g/24h) Trong đĩ:
AB: độ hấp thụ quang của ống trắng AS: độ hấp thụ quang của ống chuẩn AT: độ hấp thụ quang của ống thử CS: nồng độ dung dịch chuẩn (0,2 g/l)
CT: nồng độ protein trong mẫu thử nước tiểu (g/l). V: thể tích nước tiểu 24 giờ (lít).
1.1.4. Giá trị tham khảo
Protein nước tiểu: 0,024- 0,141 g/24 giờ.
Trong lâm sàng cĩ thể cho phép tới 0,3 g/24 giờ. 1.2. Phương pháp đo màu
Phương pháp đo màu chính xác hơn phương pháp đo độ đục. Tuy nhiên, do nồng độ protein nước tiểu (cũng như protein dịch não tủy) thấp hơn nhiều so với nồng độ protein huyết thanh nên khơng dùng thuốc thử Gornall được. Hiện nay đã cĩ một số thuốc thử đo màu đủ độ nhạy để định lượng protein nước tiểu và dịch não tủy. Ví dụ như thuốc thử Coomassie.
1.2.1. Nguyên lý
Protein kết hợp với thuốc thử Coomassie trong mơi trường acid phosphoric tạo thành sản phẩm cĩ màu xanh. Cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein. Đo
màu ở bước sĩng 578 nm, song song tiến hành với mẫu chuẩn để định lượng.
1.2.2. Chất thử và thuốc thử
- Nước tiểu 24 giờ.
- Dung dịch chuẩn protein: 0,2 g/l (200 mg/l).
- Thuốc thử: sẵn dùng, gồm Coomassie G-250, phosphoric acid.
1.2.3. Tiến hành Phản ứng
Cho vào 3 ống nghiệm:
Bảng 11: Thiết kế thí nghiệm định lượng Protein trong nước tiểu (phương pháp đo màu)
Chất liệu ống trắng (B) ống chuẩn (S) ống thử (T)
Thuốc thử 1 ml 1 ml 1 ml
Nước cất 10 µl
D.d. protein chuẩn 10 µl
Nước tiểu 24 giờ 10 µl
Trộn đều. Để 5 phút.
Đo độ hấp thụ quang ở bước sĩng 578 nm, của ống trắng (AB), ống chuẩn (As) và của ống thử (AT).
Nồng độ protein được tính theo cơng thức: AT - AB
CT = x CS (g/l) AS - AB
Lượng protein thải trong nước tiểu 24 giờ = CT x V (g/24h) Trong đĩ:
AB: độ hấp thụ quang của ống trắng AS: độ hấp thụ quang của ống chuẩn AT: độ hấp thụ quang của ống thử CS: nồng độ dung dịch chuẩn (0,2 g/l)
CT: nồng độ protein trong mẫu thử nước tiểu (g/l). V: thể tích nước tiểu 24 giờ (lít)
2.3. Ý nghĩa lâm sàng
- Tăng protein trong nước tiểu chủ yếu gặp trong các bệnh thận. Bệnh thận nguyên phát hoặc thứ phát cĩ thể gây tăng tính thấm cầu thận, đặc biệt trong thận hư nhiễm mỡ, các protein lọt qua màng lọc cầu thận, xuất hiện trong nước tiểu. Nếu
mất nhiều protein qua thận sẽ làm protein huyết tương giảm xuống, áp lực keo giảm, gây triệu chứng phù do ứ nước ở dịch gian bào.
- Protein niệu do các nguyên nhân sau thận thường là do nhiễm khuẩn hoặc tổn thương đường tiết niệu. Trong các trường hợp này, thường xuất hiện hồng cầu, bạch cầu trong nước tiểu.
- Protein niệu cịn cĩ thể do nguyên nhân trước thận (hiếm gặp). Đĩ là do rối loạn tổng hợp protein trong bệnh đa u tủy xương (bệnh Kahler). Protein huyết tương được sản xuất với số lượng nhiều (120 – 160g/l), nhưng phân tử lượng nhỏ, ra nước tiểu. Protein niệu loại này là protein Bence-Jones hay cịn gọi là protein “nhiệt tan”. 2. XÉT NGHIỆM TỔNG PHÂN TÍCH NƯỚC TIỂU 10 THƠNG SỐ
2.1. Nguyên lý
Các thơng số hố sinh nước tiểu (…..) được bán định lượng bằng thanh giấy thử sử dụng kỹ thuật đo phản quang. Thơng thường, các thanh giấy (que thử) được cấu tạo gồm 11 khu vực phản ứng cĩ chứa sẵn chất chỉ thị để sẵn sàngcác phản ứng với các chất thơng thường xuất hiện trong nước tiểu theo nguyên lý :
- Glucose nước tiểu: Glucose oxidase xúc tác phản ứng oxy hĩa glucose thành acid gluconic và hydrogen peroxide (H2O2). Sau đĩ peroxidase xúc tác phản ứng giữa H2O2 và iodua Kali tạo ra hợp chất cĩ mầu từ xanh lá cây đến mầu nâu tùy theo nồng độ glucose trong nước tiểu. Phương pháp này cĩ thể bán định lượng được glucose trong nước tiểu từ 100mg/dl đến 200mg/dl.
- Protein nước tiểu: Dựa trên nguyên tắc phản ứng của protein với chất chỉ thị, tại một pH nhất định, sự cĩ mặt của protein trong nước tiểu tạo ra mầu xanh đến màu xanh lục tùy theo nồng độ protein trong nước tiểu.
- Bilurubin niệu (sắc tố mật): Bilirubin kết hợp với muối diazo (dichloroanilin diazo hĩa ) trong mơi trường acid mạnh thành phức hợp cĩ mầu hồng xám
- Ceton niệu: Dựa vào phản ứng Legal: acid acetoacetic kết hợp với nitroprussid tạo thành phức hợp cĩ màu tím hồng.
- Máu và hemoglobin: Dựa trên hoạt tính peroxidase của hemoglobin xúc tác phân hủy một hydrogen peroxide hữu cơ và giải phĩng oxy. Oxy giải phĩng sẽ oxy hĩa chất chỉ thị là 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidin tạo ra hợp chất mầu từ da cam đến xanh lục và đến xanh đen.
- Bạch cầu: Dựa trên tác dụng của enzyme esterase ở bạch cầu cĩ hạt nếu cĩ trong nước tiểu. Esterase xúc tác thủy phân dẫn xuất naphthyl este, naphthyl giải phĩng sẽ phản ứng với muỗi diazo tạo thành họp chất cĩ mầu từ đỏ be tới đỏ tím. Độ nhạy của thí nghiệm là từ 5-15 tế bào/µl nước tiểu. Ngay cả khi bạch cầu bị phân giải thì esterase của bạch cầu vẫn hoạt động. Cho nên thử nghiệm cĩ thể bổ sung cho xét nghiệm tế bào
- Nitrit: Nguyên lý của thử nghiệm là nitrat từ thức ăn cĩ trong nước tiểu bị chuyển hĩa bởi vi khuẩn gram (-) thành nitrit. Nitrit phản ứng với p-arsanilic acid tạo thành phức hợp diazo trong mơi trường acid. Phức hợp diazo này kết hợp với 1,2,3,4- tetrahydrobenzoquinolin- 3-ol tạo ra hợp chất cĩ mầu hồng. Phản ứng này đặc trưng với nitrit, khơng phản ứng với chất nào trong nước tiểu.
- Urobilinogen: Xét nghiệm này dựa trên sự kết hợp của urobilinogen với thuốc thử diazo tạo thành hợp chất cĩ mẫu đỏ hồng. Phản ứng đặc hiệu cho urobilinogen và stescobinlinogen.
- Tỷ trọng nước tiểu: Với sự cĩ mặt của chất chỉ thị mầu, nồng độ các chất điện ly (đặc trưng cho tỷ trọng) tạo ra các mầu xanh lục đến mầu vàng.
- pH nước tiểu: Các chất chỉ thị đỏ methyl, phenolphtalein và bromothymol bleu cĩ trong giấy thử cho một gam mầu từ màu đỏ da cam đến vàng tồi xanh lục và xanh ở vùng pH của nước tiểu
2.2. Chất thử và thuốc thử - Nước tiểu mới lấy.
- Que thử nước tiểu sẵn dùng. 2.3. Tiến hành
- Lấy que thử ra khỏi lọ và đậy nắp ngay. Nhúng tồn bộ phần cĩ các ơ thử của que thử ngập vào trong nước tiểu (mới lấy, đã trộn đều, chưa ly tâm) rồi lấy ra ngay để tránh sự hồ tan của thuốc thử.
- Khi lấy ra, gạt nhẹ cạnh que thử vào thành ống đựng nước tiểu để loại bỏ nước tiêủ thừa. Giữ que nằm ngang rồi thấm nhẹ hai cạnh que thử bằng giấy thấm để tránh trộn lẫn thuốc thử giữa hai ơ thử cạnh nhau và tránh nước tiểu thấm vào tay. Đọc kết quả trong vịng 1-2 phút.
2.4. Đọc kết quả
Cĩ 2 cách đọc kết quả:
- Theo bảng màu mẫu, được dán kèm ở hộp đựng que thử.
Đặt que thử cạnh bảng màu, so sánh cường độ màu của từng ơ thử với dãy các ơ màu mẫu cho từng thơng số tương ứng. Khi thấy bằng nhau, đọc kết quả được ghi kèm theo ơ mẫu.
- Đo trên máy.
Nguyên tắc: chiếu tia sáng đơn sắc vào từng ơ màu. Một phần ánh sáng bị ơ màu hấp thụ, một phần ánh sáng phản xạ trở lại. Căn cứ vào cường độ ánh sáng ban đầu và ánh sáng phản xạ, sẽ tính được phần ánh sáng bị hấp thụ. Phần ánh sáng bị hấp thụ tùy thuộc vào đậm độ của ơ màu, tức là phụ thuộc vào nồng độ chất thử trong mẫu nước tiểu.
3.5. Ý nghĩa lâm sàng: Glucose nước tiểu:
Bình thường khơng cĩ glucose trong nước tiểu chỉ cĩ một lượng rất nhỏ khơng phát hiện được bằng các phương pháp thơng thường (nên coi như là glucose âm tính). Glucose niệu cĩ thể xuất hiện thống qua trong một số trường hơp như: gây mê, dùng thuốc nào đĩ như là glucocorticoid khi cĩ mang, hoặc do ăn một lúc quá nhiều đường.Glucose niệu xuất hiện liên tục gặp trong đái tháo đường tụy, đo đường máu quá cao vượt quá khả năng hấp thu của thận. Hoặc gặp trong trường hợp đường máu bình thường nhưng ngưỡng thận đối với glucose thấp (đái tháo đường do thận). Glucose niệu cĩ thể gặp trong ưu năng một số tuyến nội tiết như ưu năng tuyến yên, tuyến giáp, tuyến thượng thận.
Lưu ý: Xét nghiệm này đặc trưng cho glucose, khơng phản ứng với lactose, galactose, fructose hoặc các chất chuyển hĩa khác. Vitamin C với nồng độ cao trong nước tiểu cĩ thể đưa đến kết quả âm tính giả. Cho nên cĩ loại băng thử người ta thêm 1 ơ thử nữa để xác định vitamin C. Dương tính giả cĩ thể xuất hiện do chất tây rửa cĩ tính oxy hĩa trong lọ đựng nước tiểu.
- Protein nước tiểu:
Nước tiểu bình thường cĩ một lượng rất ít protein khoảng 0,03-0,1g/24h, vốn một lượng nhỏ như vậy thì các phương pháp thơng thường khơng phát hiện được, đĩ là các protein cĩ KLPT nhỏ. Được coi như là protein niệu âm tính.
Trong một số trường hợp bệnh lý protein nước tiểu tăng lên gọi là protein niệu. Thơng thường protein trong nước tiểu thường là albumin cho nên cĩ người cịn gọi albumin niệu.
Protein niệu bệnh lý: thường gặp do tổn thương màng lọc cầu thận như: hội chứng thận hư nhiễm mỡ, suy thận, viêm thận mạn, viêm thận cấp…
Protein niệu cịn gặp trong trường hợp xuất hiện một loại protein bất thường trong máu, ví dụ trong bệnh đa u tủy xương xuất hiện một loại protein cĩ KLPT nhỏ gọi là protein Bence Jones hay protein nhiệt tan do Bence Jones phát hiện ra cĩ thể qua màng lọc cầu thận ra nước tiểu (mặc dù mạng lọc cầu thận vẫn bình thường).
Protein niệu cĩ thể gặp trong suy tim, do tốc độ dịng máu qua cầu thận giảm protein cĩ thể khuếch tán ra dịch lọc cầu thận.
- Bilurubin niệu (sắc tố mật):
Nước tiểu bình thường chỉ cĩ một lượng vết bilirubin. Trong bệnh lý như trong tắc mật, viêm gan, xơ gan làm tăng mật trong máu và đào thải ra nước tiểu. Chỉ cĩ loại bilirubin liên hợp mới qua được mang lọc cầu thận và đào thải ra nước tiểu. Cịn bilirubin tự do (gắn với albumin huyết thanh) khơng qua được màng lọc cầu thận cho nên dù cĩ tăng lên trong máu cũng khơng cĩ bilirubin trong nước tiểu.
- Ceton niệu:
Mỗi ngày cĩ khoảng 0,003- 0,015 gam các thể ceton chủ yếu là 3-hydroxybutyrat và acetoacetat cĩ trong nước tiểu. Một lượng nhỏ như vậy khơng thể phát hiện bằng các phương pháp hĩa sinh thơng thường và coi như là ceton niệu âm tính. Trong
một số bệnh lý ceton trong máu và được đào thải ra nước tiểu như trong bệnh đái tháo đường tụy hoặc đĩi ăn kéo dài, cĩ thai, luyện tập nặng, dùng thuốc glucocorticoid lâu ngày.
- Máu và hemoglobin:
Nước tiểu bình thương cĩ rất ít hồng cầu và khơng cĩ hemoglobin. Một số trường hợp bệnh lý làm tăng nhiều hồng cầu và hemoglobin trong nước tiểu như: viêm thận, sỏi thận, ung thư thận, vàng da tan máu, sốt rét, bỏng nặng…
- Bạch cầu:
Sự cĩ mặt của bạch cầu trong nước tiểu là dấu hiệu của nhiễm trùng thận hay đường tiết niệu.
- Nitrit:
Kết quả dương tính cho biết cĩ ≥ 105 vi khuẩn/1ml nước tiểu
Kết quả âm tính khơng loại trừ sự cĩ mặt của vi khuẩn trong nước tiểu. Cĩ thể do thời gian ủ bệnh chưa đủ hoặc nhiễm trùng đường niệu do vi khuẩn khơng cĩ enzyme nitratreductase.
Trước khi làm xét nghiệm bệnh nhân ăn nhiều rau, uống bớt nước, ngừng dùng kháng sinh và vitamin C 3 ngày trước. Vitamin cao cĩ thể gây kết quả âm tính giả. Dương tính giả cĩ thể do nước tiểu cũ, nitrit được tạo thành do nhiễm bẩn.
- Urobilinogen:
Nồng độ urobilinogen trong nước tiểu bình thường là 0,1-1,0 EU/dl (Ehrlich Unit/dl). Nếu trên 1 EU/l là dương tính. Urobilinogen tăng trong nước tiểu gặp trong viêm gan, xơ gan, ung thư gan hoặc vỡ hồng cầu quá nhiều .Urobilinogen biến mất hồn tồn trong nước tiểu cĩ thể do tắc nghẽn đường dẫn mật.
- Tỷ trọng nước tiểu:
Nước tiểu bình thường cĩ tỷ trọng thay đổi từ 1,003- 1,035, trung bình là từ 1,016-1, 022. Tỷ trọng cao trong đái tháo đường (> 1,030). Tỷ trọng thấp trong đái tháo nhạt (1,000)
Vitamin C, acid gentisic cĩ thể ảnh hưởng đến xét nghiệm này, cho nên phải lấy nước tiểu ít nhất 10 giờ sau khi dùng thuốc này.
- pH nước tiểu:
pH nước tiểu bình thường là từ 5-8; pH< 5 gặp trong đái tháo đường khơng kiểm sốt, đĩi lả, mất nước (cần kiểm tra thêm đường và ceton niệu); pH> 8 cĩ thể do nhiễm trùng đường tiết niệu (chỉ cần kiểm tra thêm nitrit, bạch cầu, hồng cầu, protein)
BÀI 8: KỸ THUẬT PHÁT HIỆN SẮC TỐ MẬT VÀ ĐỊNH LƯỢNG ACID URIC TRONG NƯỚC TIỂU
Mục tiêu bài học:
Sau khi kết thúc bài học sinh viên cĩ thể
- Trình bày được nguyên lý và ý nghĩa xét nghiệm xác định sắc tố mật và đinh lượng acid uric trong nước tiểu.
- Làm được và đánh giá được kết quả xét nghiệm xác định sắc tố mật và đinh lượng acid uric trong nước tiểu.
1. PHÁT HIỆN SẮC TỐ MẬT (BILIRUBIN) TRONG NƯỚC TIỂU (thử nghiệm Harrison)
1.1. Nguyên lý
Oxy hĩa bilirubin thành biliverdin cĩ màu xanh bằng thuốc thử Fouchet (FeCl3 trong acid trichloacetic).
1.2. Chất thử và thuốc thử - Nước tiểu tươi.
- Dung dịch BaCl2 10%. - Thuốc thử Fouchet.
- Dung dịch (NH4)2 SO4 bão hồ. 1.3. Tiến hành
Cho vào ống nghiệm to:
- Nước tiểu mới lấy 5 ml
- BaCl2 10% 2 ml
Lắc đều, cho thêm 4 - 5 giọt amonisunfat bão hồ. Lắc đều để yên 10 phút. Lọc bằng giấy lọc, giữ lấy tủa trên giấy lọc. Thấm khơ tủa bằng giấy thấm.
Nhỏ lên tủa 1giọt thuốc thử Fouchet. 1.4. Nhận định kết quả
Phản ứng dương tính (cĩ bilirubin trong nước tiểu), nếu cĩ 1 vịng xanh xung quanh giọt thuốc thử Fouchet sau 1vài phút.
1.5. Ứng dụng lâm sàng