Sau khi kết thúc bài học sinh viên cĩ thể
- Trình bày được nguyên lý và ý nghĩa xét nghiệm định lượng HDL-C, LDL-C trong huyết tương.
- Làm được và đánh giá được kết quả xét nghiệm định lượng HDL-C, LDL-C trong huyết tương.
1. ĐỊNH LƯỢNG HDL-C HUYẾT TƯƠNG THEO PHƯƠNG PHÁP ENZYM ĐO MÀU
1.1. Nguyên lý
Xét nghiệm HDL-C sử dụng hệ thống đồng nhất hai thuốc thử. Xét nghiệm này bao gồm hai giai đoạn riêng biệt. Trong giai đoạn một, chất tách cholesterol tự do ra khỏi các hạt lipoprotein khơng phải HDL-C. Cholesterol này được biến đổi bởi các enzym cholesterol oxidase (CHO) và peroxidase (POD) cùng với cơ chất DSBmT để tạo ra một sản phẩm cuối cùng khơng màu.
Trong giai đoạn hai, chất tách thứ hai trong thuốc thử 2 tách chọn lọc cholesterol từ lipoprotein HDL-C. Cholesterol này dưới xúc tác của các enzym cholesterol esterase (CHE), CHO và cơ chất 4- aminoantipyrine (4-AAP) tạo thành phức hợp màu xanh dương.
Các phản ứng xảy ra như sau:
Giai đoạn 1:
CHO, POD, DSBmT
LDL-C, VLDL-C, Chylomicrons → Phức hợp khơng màu
Giai đoạn 2:
CHE, CHO
HDL-C + H2O + O2 → Cholest-4-en-3-one + Acid béo + H2O2 POD
H2O2 + DSBmT + 4-AAP → Phức hợp màu xanh dương
Đo mật độ quang phức hợp này tại bước sĩng 600/700nm, sự tăng của mật độ quang tỷ lệ thuận với nồng độ LDL-C trong mẫu. So sánh với nồng độ LDL-C chuẩn sẽ tính được kết quả.
1.2. Chất thử và thuốc thử
Chất thử:
Huyết thanh hoặc huyết tương (chống đơng bằng heparin hoặc EDTA)
Thuốc thử:
Thành phần chính của thuốc thử gồm cĩ:
- Dung dịch đệm (pH 6.0)
- Cholesterol esterase 375 U/L
- Cholesterol oxidase 750 U/L
- Peroxidase 975 U/L
- Ascorbate oxidase 2250 U/L
- DSBmT 0.75 mmol/L
- 4-aminoantipyrine 0.25 mmol/L
- Detergent 0.375%
Dung dịch chuẩn HDL-C 2,28 mmol/l. 1.3. Tiến hành
Chuẩn bị máy đo quang:
+ Chương trình đo mật độ quang (A). + Bước sĩng 600 nm hoặc 700 nm. + Nhiệt độ 370C.
Tiến hành:
+ Cho thuốc thử và chất thử vào 3 ống nghiệm theo bảng sau:
Bảng 7: Thiết kế thí nghiệm định lượng HDL-C trong huyết thanh (phương pháp enzyme quan học)
Thuốc thử Ống trắng (-) Ống chuẩn (S) Ống thử (T) Thuốc thử 1
H2O cất
Dung dịch HDL-C chuẩn Huyết thanh (hoặc huyết tương) 1 ml 10 µl - - 1 ml - 10 µl - 1 ml - - 10 µl Lắc đều, ủ 5 phút ở 370C Thuốc thử 2 300 µl 300 µl 300 µl - Lắc đều, ủ 5 phút ở 370C.
+ Đo theo các bước sau: . Đo mật độ quang ống trắng. . Đo mật độ quang ống chuẩn. . Đo mật độ quang ống thử.
Nếu đo theo chế độ A so với ống trắng, được mật độ quang của ống chuẩn (AS), ống thử (AT), kết quả nồng độ HDL-C được tính theo cơng thức:
AT - AB
CT = x CS (mmol/l) AS - AB
Trong đấy CS = 2,28 mmol/l. 1.4. Giá trị tham khảo
Bình thường, nồng độ HDL-C huyết tương > 0,9mmol/l 1.5. Ý nghĩa lâm sàng
Khoảng 1/3 tổng số cholesterol tồn phần được vận chuyển trong HDL-C. HDL-C thường đem cholesterol ra khỏi động mạch trở về gan và sau đĩ bài tiết ra khỏi cơ thể. Thêm vào đĩ HDL-C sẽ kết hợp với các phân tử cholesterol ứ thừa trong các mảng xơ vữa và làm chậm sự phát triển của những mảng này. Vì thế, HDL-C thường cĩ mệnh danh là loại "cholesterol cĩ ích". HDL-C càng thấp thì nguy cơ bị bệnh tim mạch càng cao. Ngược lại, HDL-C cao cĩ thể làm giảm nguy cơ bị bệnh tim mạch.
HDL-C cĩ thể được chỉ định khi kết quả xét nghiệm cholesterol tồn phần cao. HDL-C thường khơng được chỉ định xét nghiệm riêng lẻ mà thường được làm cùng với các xét nghiệm khác là LDL-C, triglyceride, cholesterol tồn phần.
Nếu HDL-C giảm, chứng tỏ cĩ nguy cơ rối loạn lipid máu. Ở người khoẻ mạnh bình thường, người ta chú ý đến tỷ số chlesterol tồn phần/HDL-C. Tỷ số này tốt nhất là < 4,0. Tỷ số này càng cao, khả năng xơ vữa động mạch càng nhiều.
2. ĐỊNH LƯỢNG LDL-C HUYẾT TƯƠNG THEO PHƯƠNG PHÁP ENZYM ĐO MÀU
2.1. Nguyên lý
Xét nghiệm LDL-C sử dụng hệ thống đồng nhất hai thuốc thử. Xét nghiệm này bao gồm hai giai đoạn riêng biệt. Trong giai đoạn một chất tách cholesterol từ các hạt lipoprotein khơng phải LDL-C. Cholesterol này được biến đổi bởi các enzym cholesterol esterase (CHE), cholesterol oxidase (CHO) và peroxidase (POD) cùng với cơ chất 4- aminoantipyrine để tạo ra một sản phẩm cuối cùng khơng màu.
Trong giai đoạn hai chất tách thứ hai trong thuốc thử 2 tách cholesterol từ lipoprotein LDL-C. Cholesterol này dưới xúc tác của các enzym cholesterol esterase, cholesterol oxidase và cơ chất DSBmT, 4-AAP tạo thành phức hợp màu xanh dương.
Các phản ứng xảy ra như sau:
Giai đoạn 1:
CHE, CHO
HDL-C, VLDL-C, Chylomicrons → Cholest-4-en-3-one + Acid béo + H2O2 POD
H2O2 – 4-AAP → LDL-C + Chất khơng màu
Giai đoạn 2 :
CHE, CHO
LDL-C → Cholest-4-en-3-one + Acid béo + H2O2 POD
H2O2 + DSBmT + 4-AAP → Phức hợp màu xanh dương
Đo mật độ quang phức hợp này tại bước sĩng 540/660nm, sự tăng của mật độ quang tỷ lệ thuận với nồng độ LDL-C trong mẫu. So sánh với nồng độ LDL-C chuẩn sẽ tính được kết quả.
2.2. Chất thử và thuốc thử
2.2.1. Chất thử
Huyết thanh hoặc huyết tương (chống đơng bằng heparin hoặc EDTA).
2.2.2. Thuốc thử
Thành phần chính gồm cĩ: - Dung dịch đệm (pH 6.3)
- Cholesterol esterase 1875 U/L - Cholesterol oxidase 1125 U/L - Peroxidase 975 U/L - Detergent 1 0.75 % - Detergent 2 0.25 %
- DSBmT 0.25 mmol/L
- 4-aminoantipyrine 0.375 mmol/L - Ascorbate oxidase 2250 U/L Dung dịch LDL-C chuẩn 2,28 mmol/l.
2.3. Tiến hành
- Chuẩn bị máy đo quang:
+ Chương trình đo mật độ quang (A). + Bước sĩng 540/660 nm.
+ Nhiệt độ 37oC. - Tiến hành:
+ Cho thuốc thử và chất thử vào 3 ống nghiệm theo bảng sau:
Bảng 8: Thiết kế thí nghiệm định lượng LDL-C trong huyết thanh bằng (phương pháp enzyme quang học)
Thuốc thử Ống trắng (-) Ống chuẩn (S) Ống thử (T) Thuốc thử 1
H2O cất
Dung dịch LDL-C chuẩn Huyết thanh (hoặc huyết tương) 1 ml 10 µl - - 1 ml - 10 µl - 1 ml - - 10 µl Lắc đều, ủ 5 phút ở 370C Thuốc thử 2 300 µl 300 µl 300 µl + Trộn đều, ủ 5 phút ở 37OC. + Đo theo các bước sau: . Đo mật độ quang ống trắng. . Đo mật độ quang ống chuẩn. . Đo mật độ quang ống thử.
Nếu đo theo chế độ A so với ống trắng, được mật độ quang của ống chuẩn (AS), ống thử (AT), kết quả nồng độ LDL-C được tính theo cơng thức:
AT
CT = x CS (mmol/l) AS
Trong đấy CS = 2,28 mmol/l. 2.4. Giá trị tham khảo
Bình thường, nồng độ LDL-C huyết tương < 3,9 mmol/l. 2.5. Ý nghĩa lâm sàng
Ngược lại với HDL-C, LDL-C được xem như là "cholesterol xấu". Khi cĩ quá nhiều LDL-C, cholesterol bị đưa vào các màng của động mạch, dấn dần làm hẹp
đường kính của mạch. Sau đĩ, kết hợp với các chất khác trong màng của thành động mạch tạo thành những mảng xơ vữa. Những mảng này cĩ thể bị rạn nứt làm cho thành động mạch khơng được trơn tru. Khi chảy qua những chỗ "gồ ghề" này, dịng máu dễ bị hỗn loạn khơng đều, trì trệ và dễ đơng lại thành cục máu đơng. Cục máu đơng này cĩ thể phát triển theo kiểu lớp lớp chồng lên nhau, cĩ lúc dày đủ để làm nghẽn động mạch.
Nếu trường hợp này xảy ra trong lịng động mạch vành tim thì kết quả là nghẽn mạch tim, gây chứng nhồi máu cơ tim. Trong trường hợp cục máu đơng bị bong ra khỏi thành động mạch, trơi theo dịng máu cho đến khi tắc ở một mạch cĩ đường kính nhỏ hơn sẽ làm nghẽn mạch ấy. Nếu đấy là mạch dẫn máu của não thì kết quả sẽ gây ra tai biến mạch máu não.
BÀI 6: KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN I
Mục tiêu bài học:
Sau khi kết thúc bài học sinh viên cĩ thể
- Trình bày được nguyên lý và ý nghĩa xét nghiệm định lượng albumin trong huyết thanh
- Làm được và đánh giá được kết quả xét nghiệm định lượng protein tồn phần trong máu
1. ĐỊNH LƯỢNG ALBUMIN TRONG MÁU 1.1. Nguyên lý
Ở pH = 4,1, albumin tác dụng với bromocresol green (BCG ) tạo thành phức hợp cĩ màu xanh đậm (blue green).
pH = 4,1
Albumin + BCG Phức hợp Albumin-BCG.
Đậm độ màu tỷ lệ với nồng độ albumin và được đo bằng máy đo quang ở bước sĩng 600 nm.
1.2. Chất thử và thuốc thử
Huyết thanh, huyết tương, dịch màng bụng, dịch màng phổi…
Tùy theo các hãng sản xuất thuốc thử mà cĩ cách pha chế và đĩng gĩi thuốc thử khác nhau. Đối với kít của hãng Beckman Coulter, nồng độ các chất trong dung dịch phản ứng là:
Đệm succinat (pH 4.2) 100 mmol/L Bromocresol green 0.2 mmol/L
Chất bảo quản. 1.3. Tiến hành
+ Cài đặt chương trình trên máy xét nghiệm bán tự động. Chú ý các thơng số quan trọng:
- Phương pháp đo: Đo điểm cuối (Endpoint). - Bước sĩng (wavelength): 600/800nm.
- Giá trị chuẩn: Tùy theo loại dịch chuẩn được sử dụng mà cĩ giá trị khác nhau. - Đơn vị tính (g/L).
- Nhiệt độ: 37oC.
+ Đối với kít của hãng Beckman Coulter, trước khi làm, trộn thuốc thử với nước cất theo tỷ lệ 29:121. Cho vào các ống nghiệm nhỏ thành phần các thuốc thử và chất thử như sau:
Bảng 9: Thiết kế thí nghiệm định lượng albumin trong huyết thanh bằng (phương pháp enzyme quang học)
Ống trắng Ống chuẩn Ống thử Hỗn hợp thuốc thử Nước cất Albumin chuẩn Huyết thanh 900 µl 6 µl - - 900 µl - 6 µl - 900 µl - - 6 µl Trộn đều, để 5 phút ở nhiệt độ phịng.
Đo trên máy theo chương trình lần lượt ống trắng, ống chuẩn và ống thử. Máy sẽ tự động tính kết quả hoặc tính kết quả tương tự như đối với fibrinogen ở trên. 1.4. Ý nghĩa lâm sàng
Albumin huyết thanh người bình thường: Người lớn : 35 - 52 g/l.
Trẻ sơ sinh : 28 - 44 g/l.
Albumin là protein chiếm tỷ lệ 55-65 % tổng số protein trong máu. Chức năng sinh học chính của nĩ là vận chuyển, dự trữ các chất và duy trì áp lực thẩm thấu. Albumin cũng được coi như một nguồn acid amin nội sinh. Albumin liên kết hịa tan các hợp chất ít phân cực như như bilirubin tự do, các acid béo chuỗi dài và cĩ thể gắn với rất nhiều thuốc.
Tăng albumin máu ít gặp và thường được gây ra bởi tình trạng mất nước nghiêm trọng và ứ tĩnh mạch quá mức.
Giảm albumin máu cĩ thể gặp các trường hợp sau:
- Giảm tổng hợp trong bệnh gan hoặc trong chế độ ăn thiếu chất đạm. - Tăng dị hĩa là kết quả của tổn thương mơ và viêm.
- Giảm hấp thu các acid amin do bệnh đường tiêu hĩa hoặc suy dinh dưỡng. - Mất protein trong hội chứng thận hư hoặc bỏng.
Giảm albumin máu nghiêm trọng làm giảm áp lực keo trong lịng mạch, nước thốt ra khoảng gian bào gây ra triệu chứng phù nề. Ngồi ra, giảm albumin trong máu cũng kéo theo giảm nồng độ các ion canxi và magiê vì các ion này được gắn với albumin.
2. ĐỊNH LƯỢNG PRO TEIN TỒN PHẦN TRONG MÁU THEO PHƯƠNG PHÁP GORNALL
2.1. Nguyên lý
Các liên kết peptid trong phân tử protein kết hợp với ion Cu++ trong mơi trường kiềm tạo thành phức hợp màu xanh tím. Cường độ màu xanh tỷ lệ với nồng độ protein (số lượng liên kết peptid) cĩ trong huyết thanh. Đo mật độ quang học so với chuẩn tính được kết quả.
Phản ứng xảy ra như sau:
Độ nhạy: xét nghiệm chính xác ở nồng độ protein từ 2 – 120 g/L. 2.2 Chất thử và thuốc thử
- Huyết thanh, huyết tương, dịch màng bụng, dịch màng phổi… - Nước cất.
- Dung dịch protein chuẩn (Cs =60 g/l). - Thuốc thử Gornall.
Kali và natri tartate trong thuốc thử Gornall cĩ vai trị ngăn cản sự kết tủa của đồng hydroxid đồng thời kali iodua ngăn cản phản ứng tự khử của ion đồng.
Chú ý: Cách pha thuốc thử Gornall được thực hiện như sau CuSO4.5H2O 1,5 g.
Na,K-tartrat 6,0 g.
NaOH 30 g (hoặc 42 ml NaOH bão hịa). KI: 1,0 g.
Nước cất vừa đủ 1000 ml.
Bảo quản trong chai màu nâu, tránh ánh sáng. 2.3 Tiến hành
Cho vào 3 ống nghiệm dung tích 10 ml:
Bảng 10: Thiết kế thí nghiệm định lượng Protein tồn phần trong huyết thanh (bằng phương pháp Gornal)
Thuốc thử Ống trắng (B) Ống chuẩn (S) Ống thử (T)
Nước cất 20 µl 0 ml 0
Dung dịch protein chuẩn 0 20 µl 0
Huyết thanh 0 0 20 µl Thuốc thử Gornall 1 ml 1 ml 1 ml Liên kết peptid/protein + Cu++ Phức hợp xanh tím tớm OH-
Lắc đều. Để yên ở nhiệt độ phịng 10 phút.
Đo mật độ quang học ở bước sĩng 530 nm. Đối chiếu với ống trắng để tính được mật độ quang học thực của phức hợp màu xanh tím tạo ra trong ống chuẩn (AS) và ống thử (AT)
Nồng độ protein ống thử (CT) được tính theo cơng thức: AT - AB
CT = x CS (g/l) AS - AB
Trong đấy CS = 60 g/l. 2.4 Ý nghĩa
Protein tồn phần huyết thanh được tổng hợp chủ yếu ở gan, tế bào máu, hạch lympho, lách và tủy xương. Bình thường, nồng độ protein tồn phần huyết thanh là 60 - 80 g/L. Khi bị bệnh, nồng độ protein tồn phần cũng như các thành phần protein cĩ thể thay đổi. Trong lâm sàng sự giảm nồng độ protein huyết thanh được quan tâm hơn.
- Giảm protein huyết thanh thường gặp:
+ Do giảm cung cấp: Gặp trong các trường hợp chế độ ăn thiếu protein, suy dinh dưỡng, bệnh Kwashiorkor hoặc do tiêu hố và hấp thu kém gặp trong một số bệnh đường tiêu hố như bệnh spru (rối loạn tiêu hĩa, hấp thu protein), bệnh Crohn’s (viêm đại tràng tự miễn), thiếu hụt enzym tiêu hố, thiếu hụt hệ thống vận chuyển acid amin,
+ Do giảm tổng hợp: Chủ yếu gặp trong bệnh gan như xơ gan, viêm gan mĩn do gan tổng hợp 100% albumin, 80% globulin huyết thanh.
+ Do mất protein:
Bệnh thận: Điển hình là hội chứng thận hư, đào thải nhiều protein qua nước tiểu. Nồng độ protein trong mỏu giảm dẫn đến giảm áp lực keo trong lịng mạch gây phù. Ngồi ra cịn gặp trong viêm cầu thận mạn, suy thận.
Bệnh bỏng nặng: Mất máu và huyết tương qua vết bỏng. Các trường hợp chảy máu, mất máu nĩi chung.
+ Do dùng thuốc: Thuốc gây giảm protein huyết thanh bao gồm estrogen và thuốc tránh thai đường uống.
- Tăng protein huyết thanh: Ít gặp.
Tăn tương đối gặp trong các trường hợp máu cơ do mất nước, mất điện giải nặng.
Tăng tuyệt đối gặp trong trường hợp tăng tổng hợp loại protein bất thường nào đĩ, ví dụ trong bệnh đa u tuỷ xương xuất hiện protein Bence-Jones (protein nhiệt tan) làm cho protein máu tăng cao, cĩ thể tới 160 g/L.
Garo lâu khi lấy máu cĩ thể gây tăng nhẹ protein. Một số thuốc cĩ thể gây tăng protein tồn phần huyết thanh, VD steroids, androgens, corticosteroids, dextran, hĩc mơn sinh trưởng, insulin, phenazopyridine và progesterone.
BÀI 7: KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN II