Nghiên cứu khả năng phân hủy hydrocarbon dầu mỏ của một số chủng vi khuẩn tía quang hợp tạo màng sinh học phân lập tại việt nam

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY HYDROCARBON DẦU MỎ CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP TẠO MÀNG SINH HỌC PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2022 download by : skknchat@gmail.com ii VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ …… ….***………… NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY HYDROCARBON DẦU MỎ CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP TẠO MÀNG SINH HỌC PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 42 01 07 Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Thị Nhi Công PGS.TS Đồng Văn Quyền Hà Nội – 2022 download by : skknchat@gmail.com iii LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận án này, trước tiên tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Lê Thị Nhi Cơng - Trưởng phịng Cơng nghệ sinh học mơi trường PGS.TS Đồng Văn Quyền, Phó Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm qúy báu suốt trình học tập thực đề tài nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn TS Đỗ Thị Liên toàn thể anh, chị cán nhân viên phịng CNSH mơi trường Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, bảo đóng góp lời khun bổ ích suốt q trình học tập nghiên cứu để tơi hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Ban lãnh đạo Học viện Khoa học Công nghệ tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu suốt năm qua Bên cạnh đó, xin chân thành cảm ơn chuyên viên Bùi Thị Hải Hà phụ trách đào tạo Viện Công nghệ sinh học chuyên viên Nguyễn Thị Minh Tâm phịng Đào tạo, Học viện Khoa học Cơng nghệ giúp đỡ tơi hồn thành thủ tục cần thiết suốt trình nghiên cứu sinh bảo vệ luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Quỹ Nghiên cứu cấp Nhà nước (Nafosted) cấp kinh phí cho nhóm nghiên cứu Trong thời gian qua, tơi nhận hỗ trợ nhiệt tình tạo điều kiện thuận lợi từ trường ĐH Sư phạm Hà Nội nơi công tác, với giúp đỡ nhiệt tình đóng góp quý báu bạn bè đồng nghiệp Nhân dịp xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến người thân gia đình, người bạn thân thiết ln bên cạnh động viên khích lệ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Một lần tơi xin chân thành cảm ơn! Tác giả luận án Nguyễn Thị Minh Nguyệt download by : skknchat@gmail.com iv LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu số kết cộng tác với cộng khác; Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; Phần lại chưa cơng bố cơng trình khác Tôi xin cam đoan giúp đỡ cảm ơn, tài liệu trích dẫn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Tác giả luận án Nguyễn Thị Minh Nguyệt download by : skknchat@gmail.com v MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Một số đặc điểm sinh học vi khuẩn tía quang hợp 1.1.1 Giới thiệu chung vi khuẩn tía quang hợp 1.2.2 Sinh thái học vi khuẩn tía quang hợp 1.2.3 Đa dạng vi khuẩn tía quang hợp 1.2.4 Đặc điểm máy quang hợp 1.2.5 Dinh dưỡng carbon 12 1.1 1.2 Ứng dụng vi khuẩn tía quang hợp để phân hủy hydrocarbon dầu mỏ 13 1.2.1 Tính độc hydrocarbon dầu mỏ 13 1.2.2 Các phương pháp xử lý ô nhiễm dầu mỏ 18 1.2.3 Ứng dụng vi khuẩn tía quang hợp để phân hủy hydrocarbon dầu mỏ 1.3 22 Vi sinh vật có khả phân hủy hydrocarbon dầu mỏ tạo màng sinh học 24 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Vật liệu nghiên cứu 30 2.1.1 Nguyên liệu 30 2.1.2 Hóa chất, mơi trường ni cấy 31 2.1.3 Các thiết bị máy móc 32 Phương pháp nghiên cứu 33 2.2.1 Các phương pháp phân tích vi sinh vật 34 2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử 42 2.2.3 Nhóm phương pháp phân tích hóa học 43 2.2.4 Xử lý thống kê 43 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 2.2 download by : skknchat@gmail.com vi 3.1 Kết phân lập tuyển chọn chủng VKTQH khả tạo màng sinh học phân hủy hydrocarbon dầu mỏ 44 3.1.1 Kết phân lập chủng VKTQH từ mẫu nước bùn ô nhiễm dầu 44 3.1.2 Tuyển chọn chủng VKTQH khả tạo màng sinh học phân hủy hydrocarbon dầu mỏ 3.2 48 Các đặc điểm sinh học định danh ba chủng DQ41, DD4 FO2 56 3.2.1 Các đặc điểm hình thái 56 3.2.2 Trình tự 16S rRNA định danh ba chủng DQ41, DD4 FO2 58 3.2.3 Các đặc điểm sinh học 59 3.3 Ảnh hưởng số điều kiện mơi trường đến hình thành màng sinh học chủng VKTQH 63 3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 63 3.3.2 Ảnh hưởng pH 64 3.3.3 Ảnh hưởng nồng độ muối (NaCl) 65 3.4 Hiệu suất phân hủy số hydrocarbon dầu mỏ màng sinh học từ chủng VKTQH 66 3.4.1 Hiệu suất phân hủy số hydrocarbon thơm màng sinh học đơn chủng không gắn giá thể chủng VKTQH lựa chọn 66 3.4.2 Phân hủy hydrocarbon dầu mỏ màng sinh học từ VKTQH lựa chọn 69 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 97 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 98 TÀI LIỆU THAM KHẢO 99 download by : skknchat@gmail.com vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh BA Benzoic acid Bchl Bacteriochlorophyl BLAST Basic local alignment search tool BOD Biochemical oxygen demand BTNMT CB Cinder bead CF Coconut fiber CFU Colony Forming Unit COD Chemical oxygen demand DAD Diode array detector DNA Deoxyribonucleic acid DSMZ Deutch samplung microorganism zentrum GCMS Gas chromatography – Mass spectrometry HPLC High performance – Liquid chromatography MSH OD Optical density PAH Polycyclic aromatic hydrocarbon PCR Polymerase chain reaction PUF Polyurethare foam QCVN rARN Ribosomal ribonucleic acid RNA Ribonucleic acid TCVN VK VKTQH PNSB Purple non-sulfur photosynthetic bacteria PSB Purple sulfur photosynthetic bacteria VSV Tiếng Việt Axit benzoic Công cụ tìm kiếm trình tự tương đồng Nhu cầu oxy sinh hóa Bộ tài ngun mơi trường Sỏi nhẹ Xơ dừa Đơn vị hình thành khuẩn lạc Nhu cầu oxy hố học Detectơ dãy diode Axit đeoxyribơnuclêic Trung tâm lưu trữ giống vi sinh vật – Đức Sắc kí khối phổ Sắc kí lỏng cao áp Màng sinh học Mật độ quang Hydrocacbon thơm đa vòng Chuỗi phản ứng trùng hợp Mút xốp Quy chuẩn Việt Nam Axit ribônuclêic ribôxôm Axit ribônuclêic Tiêu chuẩn Việt Nam Vi khuẩn Vi khuẩn tía quang hợp Vi khuẩn tía quang hợp khơng lưu huỳnh Vi khuẩn tía quang hợp lưu huỳnh Vi sinh vật download by : skknchat@gmail.com viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các chi vi khuẩn tía quang hợp Bảng 1.2 Những ảnh hưởng đến sức khỏe người động vật 17 Bảng 1.3 Các chi vi khuẩn có khả phân huỷ hiếu khí hydrocarbon 24 thơm Bảng 1.4 Các chi vi khuẩn có khả phân huỷ hiếu khí hydrocarbon 24 no Bảng 1.5 Các nhóm vi khuẩn có khả phân huỷ kỵ khí hydrocarbon 25 Bảng 2.1 Các loại giá thể 31 Bảng 3.1 Kết phân lập chủng VKTQH từ mẫu mẫu nước bùn ô nhiễm dầu Bảng 3.2 Khả sinh trưởng phát triển chủng VKTQH phân lập (theo ∆OD800) Bảng 3.3 67 Sự phân hủy thành phần (%) 20 (g) dầu thô sau 14 ngày nuôi cấy Bảng 3.7 62 Khả phân hủy số hydrocarbon thơm màng sinh học chủng VKTQH tạo thành sau 14 ngày nuôi cấy Bảng 3.6 56 So sánh mức độ sử dụng số nguồn C ba chủng DQ41, DD4 FO2 với đại diện loài Rhodopseudomonas Bảng 3.5 48 Khả sinh trưởng phát triển nguồn chất VKTQH Bảng 3.4 45 90 Sự phân hủy hydrocacbon no (%) dầu thô sau 14 ngày nuôi cấy MSH đơn chủng đa chủng VKTQH không giá thể download by : skknchat@gmail.com 93 ix DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Hình ảnh chụp kính hiển vi huỳnh quang VKTQH Hình 1.2 Sơ đồ vị trí thành phần máy quang hợp sơ cấp VKTQH 10 Hình 1.3 Quang hợp vi khuẩn tía khơng lưu huỳnh 11 Hình 2.1 Hình ảnh loại giá thể 31 Hình 2.2 Sơ đồ bước thí nghiệm thực luận án 33 Hình 2.3 Sơ đồ xử lý sơ loại giá thể 39 Hình 2.4 Chi tiết mơ hình xử lý hydrocarbon dầu mỏ 40 Hình 2.5 Các giai đoạn mơ hình xử lý hydrocarbon dầu mỏ 41 Hình 3.1 Mẫu bùn ô nhiễm dầu trước sau làm giàu 44 Hình 3.2 Một số khuẩn lạc VKTQH phân lập từ mẫu làm giàu 45 Hình 3.3 Khả tạo MSH dựa khả bắt giữ tím tinh thể MSH chủng VKTQH tạo thành 50 Hình 3.4 Khả tạo màng sinh học chủng VKTQH phân hủy hydrocarbon dầu mỏ Acinetobacter calcoaceticus P23 Hình 3.5 50 Khả sinh trưởng 10 chủng VKTQH sau ngày nuôi cấy nồng độ dầu diesel khác 51 Hình 3.6 Dịch nuôi cấy 10 chủng VKTQH 10% dầu diesel sau ngày nuôi cấy 51 Hình 3.7 Khả sinh trưởng 10 chủng VKTQH nồng độ toluene khác sau ngày nuôi cấy 52 Hình 3.8 Dịch ni cấy 10 chủng VKTQH 250 ppm toluene sau ngày nuôi cấy 52 Hình 3.9 Khả sinh trưởng 10 chủng VKTQH sau ngày nuôi cấy nồng độ phenol khác 53 Hình 3.10 Dịch ni cấy 10 chủng VKTQH 150 ppm phenol sau ngày 53 Hình 3.11 Khả sinh trưởng 10 chủng VKTQH nồng độ naphthalene khác sau ngày ni cấy 54 Hình 3.12 Dịch nuôi cấy 10 chủng VKTQH nồng độ 200 ppm download by : skknchat@gmail.com x naphthalene sau ngày ni cấy 54 Hình 3.13 Khả sinh trưởng chủng VKTQH nồng độ pyrene khác sau ngày nuôi cấy 55 Hình 3.14 Dịch nuôi cấy 10 chủng VKTQH nồng độ 200 ppm pyrene sau ngày nuôi cấy 55 Hình 3.15 Hình dạng khuẩn lạc hình dạng tế bào kính hiển vi điện tử chủng DD4, DQ41, FO2 57 Hình 3.16 Cây phát sinh chủng loại chủng DD4, DQ41, FO2 58 Hình 3.17 Phổ hấp phụ dịch huyền phù tế bào chủng DD4 (A), DQ41 (B), FO2 (C) 60 Hình 3.18 Khả tạo sắc tố quang hợp VKTQH hai điều kiện (A) kỵ khí, sáng (B) hiếu khí, tối 61 Hình 3.19 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả hình thành màng sinh học chủng VKTQH 64 Hình 3.20 Ảnh hưởng pH tới khả hình thành màng sinh học chủng VKTQH 64 Hình 3.21 Ảnh hưởng nồng độ NaCl tới khả hình thành màng sinh học chủng VKTQH 66 Hình 3.22 Thí nghiệm đánh giá đối kháng lẫn chủng VKTQH lựa chọn 70 Hình 3.23 Mật độ tế bào chủng DD4, DQ41 FO2 màng sinh học VKTQH sau ngày nuôi cấy 71 Hình 3.24 Hình ảnh hiển vi điện tử quét (SEM) giá thể trước sau VKTQH bám dính 72 Hình 3.25 Thời gian phân hủy dầu diesel mật độ tế bào chủng VKTQH màng sinh học đơn đa chủng không giá thể 74 Hình 3.26 Khả phân hủy dầu diesel mật độ tế bào chủng VKTQH DD4, DQ41 FO2 MSH đa chủng giá thể 75 Hình 3.27 Hiệu suất phân hủy thành phần n-alkane (từ C8 đến C16) có dầu diesel màng sinh học đa chủng VKTQH download by : skknchat@gmail.com 123 MSH đa chủng sỏi nhẹ Sỏi nhẹ MSH đa chủng xơ dừa nC36 89.66±2.32 2.88±0.003 91.75±1.26 18.95±0.27 73.25±1.26 2.88±0.002 nC37 89.68±1.89 2.23±0.07 92.00±2.32 18.95±0.18 73.09±1.3 2.26±0.001 nC38 89.67±2.18 1.87±0.04 92.08±2.32 18.95±0.29 73.05±1.13 1.57±0.003 nC39 89.71±2.32 92.38±1.84 18.95±0.31 73.02±1.13 nC40 89.71±1.04 92.38±1.69 18.95±0.26 72.95±1.13 nC41 89.71±2.32 92.38±2.28 18.95±0.63 72.89±1.04 nC42 89.71±1.69 92.38±1.93 18.95±0.57 72.25±1.78 nC43 89.71±2.08 92.38±2.38 45.42±1.01 nC44 89.71±1.04 92.38±1.76 43.21±0.98 nC45 89.71±1.69 92.38±1.97 40.67±0.87 Pris 89.70±1.38 0.02±0.001 92.37±2.37 37.92±1.01 0.02±0.001 Pr/Phy 89.68±1.04 0.05±0.001 92.37±1.38 36.01±0.82 0.05±0.002 Pr/nC17 89.71±1.69 0.01±0.001 92.38±1.69 35.32±0.96 0.01±0.001 Phy/nC18 89.71±1.38 0.00 92.38±1.68 34.48±0.78 0.00 CPI-1 89.68±2.32 (C20-C28) 0.03±0.001 92.37±2.19 32.38±0.81 0.03±0.001 CPI-2 89.67±1.04 (C22-C30) 0.03±0.001 92.37±2.02 32.35±0.45 0.03±0.002 CPI-3 89.68±1.69 (C24-C32) 0.03±0.001 92.37±2.02 32.21±0.59 0.03±0.001 0.01±0.001 92.38±1.98 37.03±0.67 0.01±0.001 Phy 89.70±1.38 Xơ dừa MSH đa chủng mút xốp download by : skknchat@gmail.com Mút xốp ... LIỆU Một số đặc điểm sinh học vi khuẩn tía quang hợp 1.1.1 Giới thiệu chung vi khuẩn tía quang hợp 1.2.2 Sinh thái học vi khuẩn tía quang hợp 1.2.3 Đa dạng vi khuẩn tía quang hợp ... khả phân hủy hydrocarbon dầu mỏ số chủng vi khuẩn tía quang hợp tạo màng sinh học phân lập Vi? ?̣t Nam? ?? thực với mục tiêu nội dung nghiên cứu sau: Mục tiêu nghiên cứu luận án - Tuyển chọn số chủng. .. xử lý ô nhiễm dầu mỏ 18 1.2.3 Ứng dụng vi khuẩn tía quang hợp để phân hủy hydrocarbon dầu mỏ 1.3 22 Vi sinh vật có khả phân hủy hydrocarbon dầu mỏ tạo màng sinh học