Để xác định đặc điểm hình thái, ba chủng DQ41, DD4, FO2 được nuôi cấy trong môi trường DSMZ 27 bổ sung 2% thạch, ở điều kiện kỵ khí – sáng, cường độ chiếu sáng khoảng 5.000 lux, nhiệt độ 30±2 oC. Quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi điện tử được tiến hành khi chúng đang ở giữa pha sinh trưởng (pha log). Sau
5 ngày nuôi cấy, chúng tôi tiến hành quan sát hình dạng, kích thước của khuẩn lạc trên kính hiển vi quang học, nhuộm Gram và quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi điện tử quét (Hình 3.15).
Kết quả nhuộm Gram cho thấy cả ba chủng VKTQH đều là VK Gram (-).
Hình 3.15. Hình dạng khuẩn lạc và hình dạng tế bào dưới kính hiển vi điện tử của chủng DD4, DQ41, FO2
Hình thái chủng DD4: Các khuẩn lạc của chủng DD4 có hình tròn, nhỏ li ti, có màu đỏ nhạt (Hình 3.15A). Tế bào của chúng có dạng hình que, xoắn, bề mặt nhăn, đơn bào, kích thước khoảng 700 x 2210 nm (Hình 3.15B).
Hình thái chủng DQ41: Các khuẩn lạc của chủng DQ41 cũng có hình tròn, lồi, bóng, không nhân, có rìa trong, màu đỏ đậm, đường kính 1 - 1.5 mm (Hình 3.15C). Tế bào của chúng có dạng hình que, bề mặt nhăn, đơn bào, kích thước khoảng 540 x 1320 nm (Hình 3.15D).
A B
C D
Hình thái chủng FO2: Các khuẩn lạc của chủng FO2 có hình tròn, nhẵn, nhỏ và màu đỏ nhạt và được bao phủ bởi một viền mờ đục, đường kính nhỏ hơn 0.5 mm (Hình 3.15E). Tế bào của chúng có dạng hình que, bề mặt hơi nhăn, đơn bào, kích thước khoảng 515 x 1160 nm (Hình 3.15F).
Quan sát dưới kính hiển vi điện tử cho thấy tất cả các chủng này đều có dạng hình gậy, với kích thước 500 ×1100 ÷ 700 ×2200 nm. Đáng chú ý, chủng FO2 có phương thức sinh sản là nảy chồi (Hình 3.15F).
3.2.2. Trình tự 16S rRNA và định danh ba chủng DQ41, DD4 và FO2
Để định danh các chủng VKTQH phân lập được, trình tự vùng gen mã hóa 16S rRNA được đọc và so sánh với ngân hàng dữ liệu [125].
Trình tự gần đủ của cácđoạn gen 16S rRNA của 3 chủng FO2, DQ41, DD4 ῀1500 bp đã được xác định và so sánh với trình tự 16S rDNA trên cơ sở dữ liệu trên GenBank và xây dựng cây phát sinh chủng loại (Hình 3.16).
Cả ba chủng VKTQH DD4, DQ41và FO2 đều có trình tự gen mã hóa 16S rRNA có mức độ tương đồng cao nhất đối với R. palustris (> 99%) và mức độ tương đồng này thấp hơn so với R. faecalis (> 98%).
Dựa trên các đặc điểm hình thái và trình tự của gen mã hóa 16S rRNA, ba chủng được chọn được đặt tên là Rhodopseudomonas sp. DD4, Rhodopseudomonas sp. DQ41 và Rhodopseudomonas sp. FO2. Trình tự gen 16S rRNA của 3 chủng FO2, DQ41, DD4 đã được đăng ký trong GenBank với mã số tương ứng là LC318127, LC318128 và LC318129.
Liên quan đến phân hủy hydrocarbon trong điều kiện kỵ khí, một loài thuộc chi Rhodopseudomonas đã được phân lập từ vùng bị ô nhiễm. Chủng R. palustris RP2 đã được phân lập từ lớp màng sinh học tạo ra từ các VSV phân hủy hydrocarbon, có khả năng khử được các oxit kim loại, khử nitrate trong điều kiện kỵ khí, đặc biệt có khả năng phân hủy được thành phần n-alkane của hydrocarbon dầu mỏ trong điều kiện kỵ khí [137]. Trước đó, ba chủng VKTQH thuộc chi
Rhodopseudomonas có độ tương đồng về trình tự 16S rDNA với loài R. palustris từ
97 đến 99% được phân lập được từ mẫu nước và bùn thải công nghiệp thể hiện khả năng sử dụng benzoate và 4-hydroxybenzoate là nguồn carbon duy nhất cho sinh trưởng trong điều kiện quang dưỡng [79].
3.2.3. Các đặc điểm sinh học
3.2.3.1. Đặc điểm sắc tố quang hợp
Sự khác biệt giữa các loại bacteriochlorophyll (Bchl) dẫn đến sự khác nhau về cực đại của quang phổ hấp thụ trong vùng ánh sáng đỏ là đặc trưng cơ bản để phân biệt VKTQH với các vi sinh vật quang dưỡng khác [2].
Ba chủng VKTQH DQ41, DD4, FO2 được nuôi cấy kỵ khí, có ánh sáng trong môi trường DSMZ 27 lỏng. Sau 4 ngày nuôi cấy, cả 3 chủng đều đạt tới giữa pha sinh trưởng (pha log). Dịch huyền phù tế bào được lấy ra để đo phổ hấp thụ trên máy quang phổ. Kết quả được trình bày ở Hình 3.17.
Hình 3.17. Phổ hấp phụ dịch huyền phù tế bào của 3 chủng DD4 (A), DQ41 (B), FO2 (C)
Trong vùng phổ 700 - 900 nm, chủng DD4 có cực đại tại bước sóng 806 và 866 nm, chủng DQ41 có cực đại tại bước sóng 804 và 865 nm và chủng FO2 có cực đại tại bước sóng 805 và 863 nm. Như vậy, chúng đều có các điểm cực đại ở vùng 800 - 890 nm đặc trưng cho bacteriochlorophyll a như mô tả trong nghiên cứu trước [16]. Kết quả này cho thấy cả 3 chủng nghiên cứu đều chứa Bchl a.
Ngoài Bchl, VKTQH còn chứa nhóm sắc tố khác là carotenoid. Carotenoid ở VKTQH cũng rất đa dạng, đặc trưng cho từng loài và cũng khác hẳn với nhóm sắc tố này ở tảo và thực vật bậc cao về cấu trúc. Chủng DD4 có các cực đại tại 591nm, chủng DQ41 có các cực đại tại 406, 445, 464, 492, 591nm, chủng FO2 có các cực đại tại 460, 491, 591 nm. Các cực đại hấp thụ này phù hợp với phổ hấp thụ của họ spirilloxanthin.
Với những đặc điểm cơ bản này, theo khóa phân loại của Bergey, ba chủng VKTQH DQ41, DD4 và FO2 khác với hai loài thuộc chi Rhodopseudomonas là R.
viridis và R. sulfoviridis có chứa bacteriochlorophyll b và carotenoid chủ yếu là 1,2-
dihydroneurosporene và 1,2-dihydrolycopene.
Theo nghiên cứu của Plennig và Trueper (1992), khả năng tổng hợp sắc tố ở tế bào VKTQH phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện sinh trưởng. Các loài trong chi
Rhodopseudomonas có khả năng tổng hợp sắc tố khi sinh trưởng ở điều kiện hiếu khí, tối [16]. Để xác định khả năng tổng hợp sắc tố của 3 chủng lựa chọn, chúng tôi nuôi cấy chúng trên đĩa petri chứa môi trường DSMZ 27 có bổ sung 2% thạch và nuôi ở điều kiện kỵ khí, sáng và hiếu khí, tối. Kết quả xác định ảnh hưởng của oxy và ánh sáng đến khả năng tổng hợp sắc tố của các chủng lựa chọn cho thấy chúng đều sinh trưởng được trong điều kiện hiếu khí, tối nhưng khả năng tổng hợp sắc tố bị ức chế một phần, màu sắc khuẩn lạc trở nên hồng nhạt hoặc mất màu (Hình 3.18).
Hình 3.18. Khả năng tạo sắc tố quang hợp của VKTQH ở hai điều kiện (A)kỵ khí, sáng và (B) hiếu khí, tối
Kết quả thu được khẳng định rằng ba chủng lựa chọn tổng hợp sắc tố quang hợp khi được chiếu sáng. Mặc dù chúng có thể sinh trưởng được trong điều kiện hiếu khí, tối nhưng khả năng tổng hợp sắc tố của chúng đều bị ức chế. Đây cũng là một trong những đặc điểm đặc trưng của chi Rhodopseudomonas.
3.2.3.2. Khả năng sử dụng một số nguồn carbon hữu cơ của ba chủng DQ41, DD4 và FO2
Để xác định khả năng sử dụng một số nguồn carbon cho sinh trưởng của ba chủng DQ41, DD4 và FO2, chúng đã được nuôi trong môi trường DSMZ 27 dịch thể, trong đó acetate lần lượt được thay thế bởi các nguồn carbon bao gồm formate, methanol, succinate, citrate, tartate, benzoate, glycerol và malate. Dịch sinh khối thu được sau 7 ngày nuôi cấy được đo bằng máy quang phổ kế với bước sóng 800 nm để theo dõi mật độ tế bào. Các kết quả thu được so sánh với một số loài
Bảng 3.4. So sánh khả năng sử dụng một số nguồn carbon của ba chủng DQ41, DD4 và FO2 với đại diện của loài Rhodopseudomonas [2, 67]
Chủng Nguồn C DD4 FO2 DQ41 R. palustris R. acidophila R. rutila R. rhenobacensis Formate + + + + ± – + Methanol – – – ± – ± – Acetate ++ ++ ++ + + + + Succinate ++ + + + + + + Citrate + + + ± ± ± – Tartate – – – – – – + Benzoate + + + + – – – Glycerol ++++ ++++ ++++ + + + + Malate +++ ++ ++ + + + +
Chú thích: Sự tăng mật độ tế bào ở bước sóng 800 nm sau 07 ngày nuôi cấy;
(++++), ΔOD> 1,5; (+++), ΔOD từ 1.0 đến 1.5; (++), ΔOD từ 0,5 đến 1,0; (+), ΔOD từ 0,1 đến 0,5; và (-), ΔOD <0,1 (không sinh trưởng).
Kết quả trong Bảng 3.4 cho thấy, cả ba chủng DQ41, DD4 và FO2 đều có khả năng sinh trưởng trên môi trường chứa formate, acetate, succinate, citrate, benzoate, glycerol và malate. Chúng không có khả năng sinh trưởng trên môi trường chưa methanol và tartate. Khả năng sử dụng các nguồn carbon như acetate, succinate, malate và glycerol của 3 chủng vi khuẩn nghiên cứu cũng tương tự như các loài thuộc chi Rhodopseudomonas. Trong số các loài thuộc chi này, có hai loài là R. palustris và R. rhenobacensis và một số chủng thuộc loài R. acidophila có khả năng sử dụng formate là nguồn carbon cho sinh trưởng. Tuy nhiên, loài R. acidophila chỉ sinh trưởng tốt trong môi trường axit [2] và R. rhenobacensis lại có
khả năng sử dụng tartate là nguồn carbon [67]. Đặc biệt, cả 3 chủng VKTQH DD4, FO2 và DQ41 đều có khả năng sinh trưởng mạnh trên môi trường chứa nguồn carbon là glycerol. Theo một số nghiên cứu đã được công bố [2, 3, 67], trong số các loài thuộc chi Rhodopseudomonas chỉ có loài R. palustris có khả năng sử dụng benzoate là nguồn carbon duy nhất cho sinh trưởng kỵ khí ngoài sáng.
Như vậy, theo đặc điểm dinh dưỡng carbon thì cả ba chủng VKTQH trong nghiên cứu này gần với loài R. palustris hơn cả. Nhiều đặc điểm hình thái, sinh lý và dinh dưỡng carbon của những chủng này cũng tương tự như loài R. palustris. Để xác định một cách chính xác 3 chủng VKTQH lựa chọn, phương pháp giải trình tự đoạn 16S rRNA đã được sử dụng để đối chiếu và định danh loài trên cơ sở dữ liệu gene 16S rRNA công bố trên ngân hàng gene NCBI.
3.3. Ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường đến sự hình thành màng sinh học của 3 chủng VKTQH học của 3 chủng VKTQH
Các yếu tố môi trường có liên quan mật thiết đến sự sinh trưởng và cơ chế trao đổi chất ở VKTQH, qua đó ảnh hưởng tới khả năng tạo màng sinh học của chúng. Do đó, khả năng tạo màng sinh học của các chủng VKTQH trong các điều kiện thay đổi về pH, nhiệt độ, nồng độ muối NaCl được khảo sát nhằm tìm ra được điều kiện tối ưu cho khả năng hình thành màng sinh học để ứng dụng trong xử lý ô nhiễm hydrocarbon dầu mỏ ở các điều kiện môi trường khác nhau.
3.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành màng sinh học của 3 chủng VKTQH FO2, DQ41, DD4
Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng, nhiệt độ là yếu tố có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh trưởng của VSV [103]. Nhiệt độ có liên quan trực tiếp tới sự có mặt của các enzyme, tốc độ phản ứng của các enzyme, vì vậy nó ảnh hưởng lên sự phát triển của các tế bào, từ đó tác động đến quá trình hình thành màng sinh học. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành màng sinh học của 3 chủng DQ41, DD4 và FO2 ở các nhiệt 15, 30, 37, 40, 45oC.
Kết quả (Hình 3.19) cho thấy, cả 3 chủng DQ41, DD4 và FO2 đều có khả năng sinh trưởng tốt ở các nhiệt độ thử nghiệm, đạt tối ưu ở khoảng 30 - 37oC. Khả năng hình thành màng sinh học giảm dần khi tăng nhiệt độ tới 40 - 45oC, đặc biệt chủng DD4. Mặc dù, mức độ sinh trưởng của các chủng ở khoảng nhiệt độ 15oC và 40 - 45oC kém hơn so với nhiệt độ tối ưu nhưng chúng vẫn sinh trưởng khá tốt. Trong các thí nghiệp tiếp theo, chúng tôi lựa chọn nhiêt độ tối ưu cho sinh trưởng và tạo màng sinh học là 30 - 37oC.
Hình 3.19. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng hình thành màng sinh học của các chủng VKTQH (p<0,05)
3.3.2. Ảnh hưởng của độ pH đến sự hình thành màng sinh học của 3 chủng VKTQH
Thông thường pH thích hợp cho sinh trưởng phát triển của hầu hết các chủng vi khuẩn là trung tính. Tuy nhiên, cũng có một số loài vi khuẩn Rhodococcus equi sinh trưởng tốt ở pH kiềm. Do đó, dải pH từ 4-9 được sử dụng để đánh giá khả năng sinh trưởng và hình thành màng sinh học của 3 chủng VKTQH lựa chọn. Kết quả được thể hiện ở Hình 3.20.
Hình 3.20. Ảnh hưởng của pH tới khả năng hình thành màng sinh học của các chủng VKTQH (p<0,05)
Kết quả cho thấy cả 3 chủng VKTQH FO2, DQ41, DD4 khả năng thích ứng ở điều kiện pH = 4 thấp. Đáng chú ý, 3 chủng VKTQH có khả năng sinh trưởng và tạo màng sinh học tốt trong dải pH từ 5 - 9. Trong đó, chủng Rhodopseudomonas
sp. FO2 thể hiện khả năng sinh trưởng ưu thế hơn so với hai chủng DD4 và DQ41.
3.3.3. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự hình thành màng sinh học của 3 chủng VKTQH
Nồng độ muối liên quan đến áp suất thẩm thấu của tế bào, tác động đến trao đổi chất của vi sinh vật, ảnh hưởng đến biểu hiện một số gen quy định quá trình hình thành biofilm. Ở loài S. aureus ở nồng độ NaCl cao sẽ khởi động sự hình thành biofilm thông qua biểu hiện của gen rbf liên quan đến sự điều khiển khả năng tích hợp các tế bào [110]. Đa số vi khuẩn sinh trưởng tốt trong môi trường có nồng độ muối thấp hơn 2%, nhưng cũng có một số loại vi khuẩn sinh trưởng tốt trong môi trường chứa nồng độ muối trên 30%, đó là các vi khuẩn ưa muối (halophilic) như:
Halobacterium, Natronococcus, v.v. Bên cạnh đó, khi thu thập mẫu, nhóm nghiên
cứu đã khảo sát hàm lượng muối tại các mẫu nước ô nhiễm dầu ở các vùng biển như: Bình Định, Khánh Hòa, Vũng Tàu thì hàm lượng muối nhỏ hơn 2%. Ba chủng VKTQH được định danh trong luận án này đều được phân lập từ các vùng nước mặn bị ô nhiễm dầu mỏ ở các khu vực ven biển Việt Nam. Vì vậy, tìm hiểu về ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự sinh trưởng và khả năng hình thành màng sinh học của 3 chủng VKQTH được xem là một yếu tố cần thiết. Kết quả khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng VK trong các công thức thí nghiệm (nồng độ muối từ 0 - 4%) được minh họa ở Hình 3.21.
Tất cả các chủng VKTQH đều tạo màng sinh học ở các nồng độ muối NaCl khác nhau. Trong ba chủng thì hai chủng DD4 và FO2 tạo màng sinh học tốt nhất ở nồng độ NaCl 1,5 đến 2% còn chủng DQ41 tạo màng sinh học tốt nhất ở nồng độ NaCl 1%. Tuy nhiên, để tìm điều kiện chung cho các chủng VKTQH thì nồng độ 1 – 2 % được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Kết quả này cũng mở ra hướng ứng dụng những chủng VKTQH này ở cả môi trường nước ngọt, nước lợ và nước mặn.
Hình 3.21. Ảnh hưởng của NaCl tới khả năng hình thành màng sinh học của các chủng VKTQH (p<0,05)
Trong quá trình tạo màng sinh học đa chủng VKTQH rất khó có thể sử dụng đúng các điều kiện tạo màng sinh học tốt nhất cho từng chủng VKTQH, đặc biệt khi xử lý ngoài hiện trường. Như vậy, với khả năng sinh trưởng và tạo màng sinh học tốt trong dải nhiệt độ 30-37oC, pH 5-9 và nồng độ NaCl 1 -2 %, các chủng VKTQH đã được lựa chọn dễ dàng thích ứng với môi trường thực tế ngoài hiện trường.
3.4. Hiệu suất phân hủy một số hydrocarbon dầu mỏ của màng sinh học từ 3 chủng VKTQH chủng VKTQH
3.4.1. Hiệu suất phân hủy một số hydrocarbon thơm bởi màng sinh học đơn chủng không gắn giá thể của các chủng VKTQH được lựa chọn
Để khẳng định khả năng phân hủy hydrocarbon dầu mỏ là do hoạt động của màng sinh học của các chủng VKTQH đã lựa chọn, chúng tôi tiến hành phân tích hàm lượng của toluene, naphthalene, pyrene, phenol còn lại trong các mẫu sau khi xử lý bằng màng sinh học. Các thí nghiệm được thiết kế với nồng độ cơ chất cao mà vẫn đảm bảo mức độ sinh trưởng của các chủng VKTQH ở mức tốt (∆OD800 ≥ 1,0).
Bảng 3.5. Khả năng phân hủy một số hydrocarbon dầu mỏ của màng sinh học đơn chủng do 3 chủng VKTQH tạo thành sau 14 ngày nuôi cấy
Tên chủng VK Hydrocarbon dầu mỏ Nồng độ ban đầu (ppm)
Hiệu suất phân hủy (%)
Đối chứng Sau xử lý bằng VKTQH Sau xử lý