học của 3 chủng VKTQH
Các yếu tố môi trường có liên quan mật thiết đến sự sinh trưởng và cơ chế trao đổi chất ở VKTQH, qua đó ảnh hưởng tới khả năng tạo màng sinh học của chúng. Do đó, khả năng tạo màng sinh học của các chủng VKTQH trong các điều kiện thay đổi về pH, nhiệt độ, nồng độ muối NaCl được khảo sát nhằm tìm ra được điều kiện tối ưu cho khả năng hình thành màng sinh học để ứng dụng trong xử lý ô nhiễm hydrocarbon dầu mỏ ở các điều kiện môi trường khác nhau.
3.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành màng sinh học của 3 chủng VKTQH FO2, DQ41, DD4
Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng, nhiệt độ là yếu tố có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh trưởng của VSV [103]. Nhiệt độ có liên quan trực tiếp tới sự có mặt của các enzyme, tốc độ phản ứng của các enzyme, vì vậy nó ảnh hưởng lên sự phát triển của các tế bào, từ đó tác động đến quá trình hình thành màng sinh học. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành màng sinh học của 3 chủng DQ41, DD4 và FO2 ở các nhiệt 15, 30, 37, 40, 45oC.
Kết quả (Hình 3.19) cho thấy, cả 3 chủng DQ41, DD4 và FO2 đều có khả năng sinh trưởng tốt ở các nhiệt độ thử nghiệm, đạt tối ưu ở khoảng 30 - 37oC. Khả năng hình thành màng sinh học giảm dần khi tăng nhiệt độ tới 40 - 45oC, đặc biệt chủng DD4. Mặc dù, mức độ sinh trưởng của các chủng ở khoảng nhiệt độ 15oC và 40 - 45oC kém hơn so với nhiệt độ tối ưu nhưng chúng vẫn sinh trưởng khá tốt. Trong các thí nghiệp tiếp theo, chúng tôi lựa chọn nhiêt độ tối ưu cho sinh trưởng và tạo màng sinh học là 30 - 37oC.
Hình 3.19. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng hình thành màng sinh học của các chủng VKTQH (p<0,05)
3.3.2. Ảnh hưởng của độ pH đến sự hình thành màng sinh học của 3 chủng VKTQH
Thông thường pH thích hợp cho sinh trưởng phát triển của hầu hết các chủng vi khuẩn là trung tính. Tuy nhiên, cũng có một số loài vi khuẩn Rhodococcus equi sinh trưởng tốt ở pH kiềm. Do đó, dải pH từ 4-9 được sử dụng để đánh giá khả năng sinh trưởng và hình thành màng sinh học của 3 chủng VKTQH lựa chọn. Kết quả được thể hiện ở Hình 3.20.
Hình 3.20. Ảnh hưởng của pH tới khả năng hình thành màng sinh học của các chủng VKTQH (p<0,05)
Kết quả cho thấy cả 3 chủng VKTQH FO2, DQ41, DD4 khả năng thích ứng ở điều kiện pH = 4 thấp. Đáng chú ý, 3 chủng VKTQH có khả năng sinh trưởng và tạo màng sinh học tốt trong dải pH từ 5 - 9. Trong đó, chủng Rhodopseudomonas
sp. FO2 thể hiện khả năng sinh trưởng ưu thế hơn so với hai chủng DD4 và DQ41.
3.3.3. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự hình thành màng sinh học của 3 chủng VKTQH
Nồng độ muối liên quan đến áp suất thẩm thấu của tế bào, tác động đến trao đổi chất của vi sinh vật, ảnh hưởng đến biểu hiện một số gen quy định quá trình hình thành biofilm. Ở loài S. aureus ở nồng độ NaCl cao sẽ khởi động sự hình thành biofilm thông qua biểu hiện của gen rbf liên quan đến sự điều khiển khả năng tích hợp các tế bào [110]. Đa số vi khuẩn sinh trưởng tốt trong môi trường có nồng độ muối thấp hơn 2%, nhưng cũng có một số loại vi khuẩn sinh trưởng tốt trong môi trường chứa nồng độ muối trên 30%, đó là các vi khuẩn ưa muối (halophilic) như:
Halobacterium, Natronococcus, v.v. Bên cạnh đó, khi thu thập mẫu, nhóm nghiên
cứu đã khảo sát hàm lượng muối tại các mẫu nước ô nhiễm dầu ở các vùng biển như: Bình Định, Khánh Hòa, Vũng Tàu thì hàm lượng muối nhỏ hơn 2%. Ba chủng VKTQH được định danh trong luận án này đều được phân lập từ các vùng nước mặn bị ô nhiễm dầu mỏ ở các khu vực ven biển Việt Nam. Vì vậy, tìm hiểu về ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự sinh trưởng và khả năng hình thành màng sinh học của 3 chủng VKQTH được xem là một yếu tố cần thiết. Kết quả khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng VK trong các công thức thí nghiệm (nồng độ muối từ 0 - 4%) được minh họa ở Hình 3.21.
Tất cả các chủng VKTQH đều tạo màng sinh học ở các nồng độ muối NaCl khác nhau. Trong ba chủng thì hai chủng DD4 và FO2 tạo màng sinh học tốt nhất ở nồng độ NaCl 1,5 đến 2% còn chủng DQ41 tạo màng sinh học tốt nhất ở nồng độ NaCl 1%. Tuy nhiên, để tìm điều kiện chung cho các chủng VKTQH thì nồng độ 1 – 2 % được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Kết quả này cũng mở ra hướng ứng dụng những chủng VKTQH này ở cả môi trường nước ngọt, nước lợ và nước mặn.
Hình 3.21. Ảnh hưởng của NaCl tới khả năng hình thành màng sinh học của các chủng VKTQH (p<0,05)
Trong quá trình tạo màng sinh học đa chủng VKTQH rất khó có thể sử dụng đúng các điều kiện tạo màng sinh học tốt nhất cho từng chủng VKTQH, đặc biệt khi xử lý ngoài hiện trường. Như vậy, với khả năng sinh trưởng và tạo màng sinh học tốt trong dải nhiệt độ 30-37oC, pH 5-9 và nồng độ NaCl 1 -2 %, các chủng VKTQH đã được lựa chọn dễ dàng thích ứng với môi trường thực tế ngoài hiện trường.
3.4. Hiệu suất phân hủy một số hydrocarbon dầu mỏ của màng sinh học từ 3 chủng VKTQH chủng VKTQH
3.4.1. Hiệu suất phân hủy một số hydrocarbon thơm bởi màng sinh học đơn chủng không gắn giá thể của các chủng VKTQH được lựa chọn
Để khẳng định khả năng phân hủy hydrocarbon dầu mỏ là do hoạt động của màng sinh học của các chủng VKTQH đã lựa chọn, chúng tôi tiến hành phân tích hàm lượng của toluene, naphthalene, pyrene, phenol còn lại trong các mẫu sau khi xử lý bằng màng sinh học. Các thí nghiệm được thiết kế với nồng độ cơ chất cao mà vẫn đảm bảo mức độ sinh trưởng của các chủng VKTQH ở mức tốt (∆OD800 ≥ 1,0).
Bảng 3.5. Khả năng phân hủy một số hydrocarbon dầu mỏ của màng sinh học đơn chủng do 3 chủng VKTQH tạo thành sau 14 ngày nuôi cấy
Tên chủng VK Hydrocarbon dầu mỏ Nồng độ ban đầu (ppm)
Hiệu suất phân hủy (%)
Đối chứng Sau xử lý bằng VKTQH Sau xử lý bằng MSH VKTQH DQ41 Toluene 250 2,12 70,23 100 Naphthalene 300 1,52 68,37 97,71 Pyrene 250 1,7 69,02 99,14 Phenol 300 3,45 53,28 76,48 DD4 Toluene 250 2,12 75,01 100 Naphthalene 300 1,52 63,96 97,23 Pyrene 250 1,7 61,05 99,02 Phenol 300 3,45 50,22 78,35 FO2 Toluene 250 2,12 78,59 100 Naphthalene 300 1,52 61,36 96,53 Pyrene 300 2,1 69,99 99,37 Phenol 300 3,45 57,68 86,53
Kết quả từ Bảng 3.5 cho thấy, khả năng phân hủy các hợp chất toluene, naphthalene, pyrene của các màng sinh học do các chủng vi khuẩn này tạo thành là rất tốt, đặc biệt, phân hủy hoàn toàn toluene ở nồng độ ban đầu là 250 ppm. So sánh với khả năng phân hủy kị khí toluene của nhóm vi khuẩn khử nitrate Dechloromonas khoảng 0.071mmol/l (khoảng 7ppm) sau 7 ngày [139] và khả năng phân huỷ của
Azoarcus khoảng 0.216 mmol/l (khoảng 20ppm) sau 14 ngày [140] cho thấy các
chủng VKTQH của chúng tôi vượt trội cả về hiệu suất phân hủy cũng như nồng độ chống chịu.
Hiệu suất phân hủy pyrene của các chủng cũng rất tốt đều đạt trên 99%. Chủng FO2 có khả năng phân hủy pyrene cao nhất với hiệu suất lên tới 99,37% tương ứng với nồng độ ban đầu là 300 ppm. Kết quả này cho thấy hiệu suất phân hủy pyrene của
màng sinh học do các chủng VKTQH này tạo ra còn cao hơn nhiều so với các chủng vi khuẩn đã được nghiên cứu trước đây. Cụ thể, chủng Paracoccus sp. DG25 do Lê Thị Nhi Công và cộng sự phân lập từ nước thải kho xăng dầu Đức Giang (Hà Nội) có hiệu suất phân hủy pyrene đạt 76,07% với nồng độ ban đầu 300 ppm [141]. Chủng Paracoccus sp. BTL4 do nhóm nghiên cứu của Nghiêm Ngọc Minh và cộng sự phân lập có khả năng phân hủy 25,5% pyrene sau 7 ngày với nồng độ ban đầu là 100 ppm [142]. Một chủng phân hủy pyrene Hydrogenophaga sp. PYR1 được phân lập từ trầm tích sông bị nhiễm PAH và được phát hiện có khả năng phân hủy các hydrocacbon thơm đa vòng trong cả điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Trong điều kiện hiếu khí, 94% pyrene có thể bị phân huỷ bởi chủng PYR1 trong vòng 15 ngày ở 28 °C, trong khi sự phân huỷ benzo [a] pyrene không rõ ràng. Tuy nhiên, chủng này có thể phân hủy đáng kể pyrene và thậm chí benzo [a] pyrene trong điều kiện kỵ khí khử sắt [143].
Hiệu suất phân hủy naphthalene lần lượt là 97,71; 97,23; 96,53% tương ứng với các chủng DQ41, DD4 và FO2 (nồng độ cơ chất ban đầu là 300 ppm). Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về khả năng phân hủy naphthalene của các vi sinh vật. Cụ thể, Rockne và cộng sự (2000) đã phân lập được một nhóm VK khử nitrate phân huỷ kỵ khí naphthalene. Trong đó, một chủng VK thuộc loài Pseudomonas
spp. có khả năng phân huỷ 70 - 90% naphthalene (phụ thuộc vào hàng lượng nitrate) sau 57 ngày nuôi cấy với nồng độ ban đầu là 15,6 Μm [144]; một nhóm vi khuẩn phân lập được từ nước ngầm bị ô nhiễm naphthalene gồm Acinetobacter và
Pseudomonas đã phân hủy kỵ khí 94,68% naphthalene (nồng độ naphthalene ban
đầu là 0,5 mg / L) sau 30 ngày nuôi cấy và xuất hiện sự khử nitrate [145]. Tại Việt Nam, chủng Paracoccus sp. DG25 do Lê Thị Nhi Công và cộng sự phân lập ngoài khả năng phân hủy pyrene nêu trên cũng có khả năng phân hủy naphthalene với hiệu suất 86,64% sau 7 ngày với nồng độ ban đầu là 250 ppm, chủng Rhodococcus sp. VTPG5 phân hủy được 99,9 % naphthalene sau 7 ngày nuôi cấy với nồng độ ban đầu là 150 ppm [141]; chủng Rhodococcus sp. BQN11 do Cung Thị Ngọc Mai và cộng sự phân lập có khả năng phân hủy naphthalene với hiệu suất 61,01% với nồng độ ban đầu là 200 ppm [119]. Đối chiếu với kết quả thu được trong luận án này, có thể thấy rằng, khả năng phân hủy naphthalene của 3 chủng
Rhodopseudomonas sp. DD4, Rhodopseudomonas sp. DQ4 và Rhodopseudomonas
sp. FO2 là khá tốt.
Hiệu suất phân hủy phenol ở nồng độ 300 ppm của các chủng VKTQH DQ41, DD4, FO2 lần lượt là 76,48, 78,35, 86,53%. Kết quả này cho thấy hiệu suất phân hủy phenol của ba chủng này khá cao so với các công bố trước đó. Cho đến nay, trên thế giới đã có nhiều công bố về VK phân huỷ phenol trong điều kiện hiếu khí, điển hình như: Liu và cs năm 2009, đã công bố hai chủng Acinetobacter sp.
XA05 và Sphingomonas sp. FG03 phân lập từ bùn hoạt tính và đất ô nhiễm phenol có hiệu suất phân hủy phenol lần lượt là 78% và 68% sau 60 giờ với hàm lượng ban đầu là 100 ppm [146]. Nor-Suhaila và cộng sự (2010) đã công bố nghiên cứu về chủng vi khuẩn Rhodococcus UKM-P được phân lập từ nước ô nhiễm dầu có hiệu suất phân hủy phenol đạt 98,5% sau 7 ngày nuôi lắc với hàm lượng phenol ban đầu là 50 ppm [147]. Tại Viện Công nghệ sinh học, Cung Thị Ngọc Mai và cộng sự đã phân lập được chủng vi khuẩn Rhodococcus sp. BTLP1 có khả năng phân hủy 92,5 % phenol với nồng độ ban đầu là 150 ppm tại 30oC sau 7 ngày nuôi cấy từ nước thải khu công nghiệp Từ Liêm, Hà Nội [148]. Tuy nhiên phân huỷ phenol trong điều kiện kỵ khí chưa có nhiều công bố. Gần đây, Wang và cộng sự (2017), khi nghiên cứu khả năng phân huỷ kị khí phenol của một nhóm VK đã nhận thấy 99% phenol bị phân huỷ sau 30 ngày với nồng độ ban đầu là 500 mg L−1. Trong nhóm VK nghiên cứu, Syntrophus là quần thể quan trọng cho sự phân hủy phenol [149].
3.4.2. Phân hủy hydrocarbon dầu mỏ bởi màng sinh học từ các chủng VKTQH lựa chọn
3.4.2.1. Kiểm tra tính đối kháng của các chủng VKTQH lựa chọn
Mục tiêu của nghiên cứu này là đánh giá hiệu suất phân hủy hydrocarbon dầu mỏ của màng sinh học từ hỗn hợp các chủng VKTQH lựa chọn, so sánh với màng sinh học đơn chủng. Bên cạnh đó, hiệu quả của màng sinh học khi được tạo trong điều kiện có và không có giá thể cũng được so sánh. Trước tiên, tính đối kháng của ba chủng được đánh giá theo phương pháp cấy vạch (Hình 3.21).
Kết quả, cho thấy ba chủng VKTQH này không đối kháng lẫn nhau (Hình 3.21).
Hình 3.22. Thí nghiệm đánh giá sự đối kháng lẫn nhau của các chủng VKTQH lựa chọn. (1)- DQ41; (2)- DD4; (3),- FO2
3.4.2.2. Đánh giá hiệu quả tạo màng sinh học trên các loại giá thể
Trong nghiên cứu, chúng tôi lựa chọn một số loại giá thể phù hợp cho mục đích xử lý ô nhiễm bao gồm: nhẹ, diện tích bề mặt lớn, dễ tìm kiếm, giá thành rẻ. Ba loại giá thể đã được lựa chọn, gồm: (1) giá thể có nguồn gốc tự nhiên (xơ dừa) và (2) giá thể có nguồn gốc nhân tạo (mút xốp, sỏi nhẹ). Trước khi sử dụng trong nghiên cứu, ba loại giá thể được xử lý sơ bộ để loại bỏ tạp chất và các loại vi sinh vật không mong muốn có mặt trong nguyên liệu.
Để cố định VK trên giá thể, tế bào của các chủng DD4, DQ41 và FO2 với tỷ lệ bằng nhau được nuôi trong môi trường DSMZ 27. Lấy 5 ml dịch huyền phù tế bào ở bước sóng OD600 nm, được rửa cùng với dung dịch đệm photphat và được tiếp tục nuôi trong môi trường 100 ml DSMZ 27 trong 72 giờ, nhiệt độ 30 °C để đạt được khoảng 2 × 109 CFU. Sau đó, dịch huyền phù tế bào được nuôi cấy trong 100 ml môi trường DSMZ 27 và 1,5 g xơ dừa, mút xốp, sỏi nhẹ chìm trong môi trường. Quá trình này được nuôi ở nhiệt độ 30 °C trong 120 giờ trong môi trường cố định để giúp màng sinh học vi khuẩn bám trên bề mặt của giá thể. Cứ sau 48 giờ, môi trường đã qua sử dụng được thay thế bằng môi trường mới. Các tế bào bám dính hoặc được sử dụng ngay lập tức hoặc được giữ ở 4 °C trong 3 tuần. Vì vậy, những giá thể màng sinh học này đã được sử dụng trong vòng 3 tuần. Tương tự, màng sinh
học đơn chủng và màng sinh học đa chủng được thực hiện không có giá thể với mật độ vi khuẩn ban đầu là 8 × 102 CFU / L
Số lượng VKTQH trong màng sinh học đơn và đa chủng có hoặc không có giá thể được xác định để đánh giá hiệu quả tạo màng sinh học (Hình 3.23).
Hình 3.23. Mật độ tế bào của chủng DD4, DQ41 và FO2 trong MSH sau 9 ngày nuôi cấy
Ở ngày 0, số lượng của mỗi chủng vi khuẩn ban đầu tương ứng với 8 × 102
(CFU m / L) (SD = 13). Sau 9 ngày nuôi cấy với nồng độ dầu diesel ban đầu là 17,2 g/L, số lượng tế bào của mỗi chủng là gần 7,93 đơn vị log. Số lượng tế bào của mỗi chủng VKTQH trong MSH đơn chủng/MSH đa chủng không giá thể và MSH đa chủng trên giá thể xơ dừa không thay đổi, trong khi số lượng VKTQH trong MSH gắn trên giá thể sỏi nhẹ và mút xốp giảm.
Quan sát dưới kính SEM màng sinh học cho thấy độ xốp của tất cả các giá thể phù hợp cho sự hấp phụ của các tế bào vi khuẩn vào giá thể (Hình 3.24). Trong đó, sỏi nhẹ có nhiều cấu trúc mút xốp, nơi vi khuẩn có thể xâm chiếm; xơ dừa có cấu trúc sợi hình thành bởi các sợi song song; mút xốp không xốp như các giá thể khác nhưng theo Alessandrello và cộng sự (2017), mút xốp là một vật liệu tiềm năng để gắn vi khuẩn và được áp dụng trong phân huỷ hydrocarbon dầu mỏ [133]. Các đặc tính lý tưởng của giá thể đó là không độc, rẻ tiền và có độ xốp cao cũng như có cấu trúc dạng sợi để gắn kết các tế bào phát triển [150]. Các giá thể có thể thúc đẩy sự cố định của vi sinh vật bằng cách hỗ trợ khu vực sống cho vi sinh vật,
sử dụng các thành phần hydrocacbon trong dầu làm nguồn carbon và năng lượng cho sự phát triển, đồng thời cho phép khuếch tán oxy nhanh chóng như một chất nhận điện tử [151]. Sự hiện diện của các vi khuẩn cố định trên các giá thể này đã