(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu chiết tách và phân tích đặc điểm cấu trúc của glycosaminoglycan từ hải sâm holothuria atra

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu thân tơi hướng dẫn TS Phạm Đức Thịnh tham khảo thêm tài liệu cơng bố trước có nguồn gốc rõ ràng Các số liệu nêu luận văn kết làm việc suốt trình thực nghiệm Viện Nghiên cứu Ứng dụng công nghệ Nha trang, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Nha trang, tháng năm 2019 Tác giả Mai Ngơ Thương Hồi download by : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học Cơng nghệ Ban lãnh đạo Phịng ban thuộc Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa học Thạc sĩ Hóa phân tích 2017-2019 Cảm ơn Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam thông qua Đề tài HTQT mã số QTRU04.06/18-19 hỗ trợ kinh phí thực đề tài Tiếp theo, tơi xin cảm ơn chân thành sâu sắc đến TS Phạm Đức Thịnh - Phó Viện trưởng, Viện Nghiên cứu Ứng dụng công nghệ Nha Trang TS Đào Việt Hà - Viện trưởng, Viện Hải dương học tận tình việc hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu Viện hồn thành luận văn Tôi xin cảm ơn thầy cô giảng dạy anh chị lớp cao học CHE17 tận tình giảng dạy giúp đỡ tơi bổ sung thêm kiến thức suốt khóa học Tơi xin cảm ơn anh chị Phịng Hóa Phân tích Triển khai công nghệ thuộc Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang tạo điều kiện giúp đỡ thiếu sót kiến thức chuyên ngành tơi làm thực nghiệm đề tài Cuối tơi xin dành lời cảm ơn gia đình bạn bè tôi, bên cạnh ủng hộ hỗ trợ mặt kinh tế tinh thần để tơi tiếp tục đường học tập Học viên Mai Ngơ Thương Hồi download by : skknchat@gmail.com Danh mục kí hiệu chữ viết tắt CS : Chondroitin sulfate Cetavlon : Trimethyl Hexadecyl lammonium bromide 13C-NMR : Carbon-13 NMR Spectroscopy DEAE -Sepharose Fast Flow : Diethylaminoethyl- EtOH : Ethanol FCS : Fucosylated chondroitin sulfate FS : Fucan sulfate Fuc : Fucose GAG : Glycosaminoglycan GalNAC : N-Acetyl galactosamine Gal : Glactose GlcA : Glucuronic axit Gluc : Glucose GLC : Gas Liquid Chromatography GPC : Gel permeation chromatography HPLC : High Performance Liquid 1H-NMR : Proton NMR Spectroscopy IR : Infrared Spectroscopydesorption/ionization NMR : Nuclear Magnetic Resonance PS : Polysaccharide sulfates TCA : Triclorua acetic acid TFA : Triflorua acetic acid Sepharose Fast Flow download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1: Hình thái chung bên ngồi hải sâm [13]………………………8 Hình 1.2 Hải sâm Holothuria atra……………………………………… 10 Hình 1.3 Cấu trúc Fucan sulfate phân lập từ loài hải sâm .14 Hình 1.4 Cấu trúc Fucan sulfated từ hải sâm Holothuria edulis Ludwigothurea Grise 16 Hình 1.5 Cấu trúc minh họa Fucosylated chondroitin sulfate (R: ester sulfate)………………………… 16 Hình 1.6 Cấu trúc Fucosylate chondroitin sulfate…………………… 17 Hình 2.1 Hải sâm Holothuria atra xử lý mẫu ……………………27 Hình 2.2 Quy trình chiết tách glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra………… 30 Hình 2.3 Phân đoạn tinh chế glycosaminoglycan sắc ký trao đổi anion……… 31 Hình 2.4 Độ dịch chuyển hóa học phổ NMR polysaccharide…………………………………………………………41 Hình 3.1 Sắc ký đồ GPC glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra………… 45 Hình 3.2 Phân đoạn glycosaminoglycan sắc ký trao đổi anion…………………… 50 Hình 3.3 Sắc ký đồ đường chuẩn sắc kí khí GC ………………………51 Hình 3.4 Sắc ký đồ GC thành phần đường đơn phân đoạn F2 ……………………………………………………………….52 Hình 3.5 Phổ IR phân đoạn F1 ……………………………………… 55 Hình 3.6 Phổ 1H-NMR phân đoạn F1 …………………………………58 download by : skknchat@gmail.com Hình 3.7 Phổ 13 C-NMR phân đoạn F1……………………………… 59 Hình 3.8 Phổ IR phân đoạn F2 ……………………………………… 60 Hình 3.9 Phổ H-NMR phân đoạn F2 …………………………………61 Hình 3.10 Phổ 13 C-NMR phân đoạn F2 ……………………………….62 download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Hàm lượng protein lipit hải sâm số vùng biển giới[15] ………………………………………11 Bảng 1.2 Thành phần hàm lượng khoáng vi lượng số loài hải sâm [16]……………………………………………… 12 Bảng Thành phần hóa học Fucosylated chondroitin sulfate phân lập từ thành tế bào số loài hải sâm [22]…………………………… 18 Bảng 2.1 Các đỉnh phổ đặc trưng fucoidan phổ hồng ngoại [58]……… 39 Bảng 3.1 Hiệu suất chiết glycosaminoglycan loài hải sâm ……… 44 Bảng 3.2 Thành phần hóa học glycosaminoglycan từ mẫu thô hải sâm Holothuria atra…………………………………………48 Bảng 3.3 Thông số mẫu đường đơn chuẩn đo phương pháp sắc kí khí GC………………………………….51 Bảng 3.4 Thành phần hóa học phân đoạn glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra ………………………………………………….54 Bảng 3.5.Thành phần hóa học phân đoạn glycosaminoglycan từ hải sâm Stichopus variegatus [49]……………………………………… 55 download by : skknchat@gmail.com MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1.GIỚI THIỆU VỀ HẢI SÂM 1.1.1 Giới thiệu chung hải sâm 1.1.2 Giới thiệu hải sâm Holothuria atra 1.1.2.1.Đặc điểm hình thái sinh sản 1.1.2.2 Phân bố môi trường sống 1.1.2.3 Phân loại 1.1.3 Thành phần hóa học hải sâm 10 1.1.3.1 Hàm lượng protein lipit hải sâm số vùng biển giới 10 1.1.3.2 Thành phần hàm lượng khống vi lượng số lồi hải sâm 12 1.2 TỔNG QUAN VỀ CẤU TRÚC CỦA GLYCOSAMINOGLICAN 13 1.2.1 Các nghiên cứu Fucan sulfate 13 1.2.2 Các nghiên cứu Fucosylate chondroitin sulfate 16 1.2.3 Hoạt tính sinh học ứng dụng glycosaminoglycan 19 1.3 LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM VỀ GLYCOSAMINOGLYCAN TỪ HẢI SÂM 23 1.3.1 Lịch sử nghiên cứu giới 23 1.3.2 Lịch sử nghiên cứu Việt Nam .24 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 27 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 27 2.1.2 Dụng cụ - Thiết bị - Hóa chất .27 2.1.2.1 Dụng cụ 27 2.1.2.2 Thiết bị 28 2.1.2.3 Hóa chất 28 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .29 download by : skknchat@gmail.com 2.2.1 Phương pháp chiết tách phân đoạn glycosaminoglycan từ hải sâm 29 2.2.1.1 Phương pháp chiết tách glycosaminoglycan 29 2.2.1.2 Phương pháp tách phân đoạn glycosaminoglycan 31 2.2.2 Các phương pháp phân tích thành phần hóa học glycosaminoglycan 31 2.2.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng tổng carbohydrate 31 2.2.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng sulfate 32 2.2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng uronic axít 32 2.2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng protein 32 2.2.2.5 Phương pháp xác định thành phần monosaccharide 32 2.2.2.6 Sắc ký thẩm thấu gel (GPC) 32 2.2.2.7 Phương pháp phổ hồng ngoại IR 33 2.2.2.8 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 33 2.3 THỰC NGHIỆM 33 2.3.1 Chiết tách phân đoạn glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra 33 2.3.1.1 Xử lý mẫu 33 2.3.1.2 Chiết tách glycosaminoglycan 34 2.3.1.3 Phân đoạn tinh chế glycosaminoglycan phương pháp sắc kí trao đổi anion DEAE-Sepharose fast flow (1,5 x 20 cm) 34 2.3.2 Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate 35 2.3.4 Phân tích hàm lượng uronic axit 36 2.3.5 Phân tích hàm lượng protein 37 2.3.6 Phân tích thành phần đường đơn 37 2.3.7 Phương pháp sắc kí thẩm thấu Gel (GPC) 38 2.3.8 Phương pháp phân tích phổ IR 39 2.3.9 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 40 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1 PHÂN LẬP VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA GLYCOSAMINOGLYACAN TỪ HẢI SÂM HOLOTHURIA ATRA 43 download by : skknchat@gmail.com 3.1.1 Phân lập glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra 43 3.1.2 Thành phần hóa học glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra 45 3.2 TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC PHÂN ĐOẠN CỦA GLYCOSAMINOGLYCAN TỪ HẢI SÂM HOLOTHURIA ATRA 48 3.2.1 Tách phân đoạn glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra 48 3.2.2 Thành phần hóa học phân đoạn glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra 50 3.3 ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA GLYCOSAMINOGLYCAN TỪ HẢI SÂM HOLOTHURIA ATRA 55 3.3.1 Đặc điểm cấu trúc phân đoạn F1 chiết tách từ glycosaminoglycan hải sâm Holothuria atra 55 3.3.1.1 Phổ hồng ngoại IR phân đoạn F1 55 3.3.1.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR phân đoạn F1 56 3.3.1.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR phân đoạn F1 58 3.3.2 Đặc điểm cấu trúc phân đoạn F2 chiết tách từ glycosaminoglycan hải sâm Holothuria atra 59 3.3.1.2 Phổ hồng ngoại IR phân đoạn F2 59 3.3.2.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR phân đoạn F2 60 3.3.2.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR phân đoạn F2 61 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 4.1.KẾT LUẬN 63 4.2 KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 download by : skknchat@gmail.com MỞ ĐẦU LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI: Trong năm gần đây, khái niệm thực phẩm chức đưa cách tiếp cận thiết thực để có sức khỏe tốt khuyến khích sử dụng sản phẩm thiên nhiên giúp mang lại nhiều lợi ích sinh lý từ làm giảm nguy mắc bệnh mãn tính khác Hầu hết thực phẩm chức thuốc có nguồn gốc trực tiếp gián tiếp từ tự nhiên, đặc biệt loài thực vật cạn lồi sinh vật biển Điển hình hợp chất glycosaminoglycan (GAG) phân lập từ động vật biển nói chung hải sâm nói riêng, cịn gọi polysaccharide sulfate (PS) hợp chất tự nhiên có giá trị cao nghiên cứu rộng rãi gần nhờ sở hữu phổ hoạt tính sinh học rộng như: chống tạo mạch, kháng u, chống đông máu, kháng viêm, chống tăng huyết áp, chống huyết khối, [1, 2] Glycosaminoglycan từ hải sâm phân chia thành hai nhóm khác fucosylated chondroitin sulfate (FCS) fucan sulfate (FS) FS polymer mạch thẳng cấu tạo gốc fucose /hoặc fucose (sulfate), FS từ lồi hải sâm có khác biệt chủ yếu mật độ vị trí nhóm sulfate gốc đường fucose [2] FCS polymer có mạch nhánh cấu trúc tạo nên đơn vị lặp lại disaccharide (1→3)-β-D-GalNAc-(1→4)β-D-Gluc-(1→n) Cấu trúc mạch tương tự cấu trúc chondroitin có nguồn gốc từ động vật có vú, nhiên khác biệt độc đáo FCS hải sâm mà khơng lồi động vật hay thực vật cạn biển có cấu trúc mạch nhánh tạo nên fucan sulfate vị trí C-3 gốc Glucuronic axit [3] FCS loài hải sâm khác phân biệt dựa vào cấu tạo mạch nhánh, số mạch nhánh mức độ sulfate hóa mạch nhánh mạch [1, 2, 4] Cho tới nay, nhóm hợp chất GAG nghiên cứu từ nhiều loài hải sâm khác download by : skknchat@gmail.com Phụ lục sắc ký đồ GC glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra download by : skknchat@gmail.com download by : skknchat@gmail.com Phụ lục 8: Sắc ký đồ GC mẫu đường đơn chuẩn download by : skknchat@gmail.com download by : skknchat@gmail.com Phụ lục 9: Sắc ký đồ GC thành phần đường đơn phân đoạn F2 download by : skknchat@gmail.com Phụ lục phổ IR phân đoạn glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra download by : skknchat@gmail.com Phụ lục 10: Phổ IR phân đoạn F1 từ hải sâm Holothuria atra download by : skknchat@gmail.com Phụ lục 11: Phổ IR phân đoạn F2 từ hải sâm Holothuria atra download by : skknchat@gmail.com Phụ lục phổ H-NMR phân đoạn glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra download by : skknchat@gmail.com Phụ lục 12: Phổ H-NMR phân đoạn F1 từ hải sâm Holothuria atra download by : skknchat@gmail.com Phụ lục 13: Phổ H-NMR phân đoạn F2 từ hải sâm Holothuria atra download by : skknchat@gmail.com 13 Phụ lục phổ C-NMR phân đoạn glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra download by : skknchat@gmail.com Phụ lục 14: Phổ 13 C-NMR phân đoạn F1 từ hải sâm Holothuria atra download by : skknchat@gmail.com Phụ lục 15: Phổ 13 C-NMR phân đoạn F2 từ hải sâm Holothuria atra download by : skknchat@gmail.com download by : skknchat@gmail.com ... từ hải sâm Holothuria atra 50 3.3 ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA GLYCOSAMINOGLYCAN TỪ HẢI SÂM HOLOTHURIA ATRA 55 3.3.1 Đặc điểm cấu trúc phân đoạn F1 chiết tách từ glycosaminoglycan hải. .. lại, từ việc phân tích tổng quan tình hình nghiên cứu nước nước, đề tài: ? ?Nghiên cứu chiết tách phân tích đặc trưng cấu download by : skknchat@gmail.com 26 trúc glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria. .. glycosaminoglycan từ loài hải sâm Holothuria atra ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU: 3.1 Đối tượng nghiên cứu: download by : skknchat@gmail.com Glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra 3.2 Phạm vi nghiên cứu: